Einführung: Für eine erfolgreiche Umsetzung klinischer Studienprotokolle müssen erstens Laboreinrichtungen verfügbar sein, um Zelltherapeutika unter Bedingungen vor-zubereiten, die einen Transfer zurück in die Patienten gestatten (sog. good manufacturing practice (GMP)-Einrichtungen). Alle Arzneimittel, die am Patienten eingesetzt werden, unterliegen strengen gesetzlichen Auflagen. Eine dafür notwendige Reinraum-anlage wird derzeit von der GSF vorbereitet.
Zweitens müssen auch Strategien zur Über-prüfung des Immunstatus’ der behandelten Patienten entwickelt, standardisiert und vali-diert werden. Von besonderer Bedeutung ist dieses Immunmonitoring immer dann, wenn Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung in klinische Phase-I/II-Studien aufgenommen werden. Bei diesen Patienten wird ein klinisches Ansprechen auf die jeweilige Therapie nur selten erwartet und somit sind hochsensitive und standardisierte Immun-monitoring-Technologien von ganz entschei-dender Bedeutung für die Evaluierung der therapeutischen Effekte auf das Immunsystem.
Die Immunmonitoring-Plattform: Die GSF und die beiden Münchener Universitäten arbeiten auf dem Gebiet der Immuntherapie maligner und infektiöser Erkrankungen in vielfältigen Kooperationen sowie im Rahmen mehrerer Klinischer Kooperationsgruppen (KKG) zusammen, darunter auch unsere KKG
„Immuntherapie bei urologischen Tumoren“
und die KKG „Antigen-spezifische Immun-therapie“ (Leiter: D.H. Busch). Mit Hilfe eines im Helmholtz-Programm „Infektion und Immunität“ bewilligten Überzeichnungs-projekts wurde von den zwei GSF-Instituten (Molekulare Immunologie und Molekulare Virologie) im Jahr 2004 eine Plattform
„Immunmonitoring“ gegründet, mit dem Ziel der Entwicklung und Standardisierung verschiedenster State-of-the-Art-Verfahren zur Überwachung der Immunantwort von Patienten in laufenden klinischen Studien. Basierend auf der langjährigen, engen Kooperation zwischen meiner Arbeitsgruppe im LTI und D.J. Schendel (GSF) wurden im Rahmen des BMBF-Forschungsverbundes „Somatische Gentherapie bei Nierenzell- und Prostata-karzinom“ drei klinische Phase-I/II-Studien mit allogenen genetisch-modifzierten Tumor-Zelllinien gemeinsam etabliert und durchgeführt. Für diese Studien wurden am LTI mehrere Immunmonitoring-Verfahren
entwickelt und ein Prüflabor für Lymphozytenstimulierung unter GMP-Bedingungen aufgebaut. Durch diese Kerneinheit von qualifizierten Wissen-schaftlern und technischem Personal, die vielfältige Immunmonitoring-Technologien standardisieren und validieren, wird sicher-gestellt, dass den klinischen Partnern die neuesten Werkzeuge zur Untersuchung der Wirkung ihrer experimentellen Therapien zur Verfügung stehen, ohne die Notwendigkeit viele komplizierte Technologien selber etablieren zu müssen. Darüber hinaus kann eine solche Kerneinheit immer auf dem neuesten Stand der Technik in diesem Gebiet sein, und gleichzeitig die laufenden Studien durch validierte Tests unterstützen und beratend zur Seite stehen. Die Mitglieder dieser Plattform interagieren ebenfalls mit der GMP-Arbeitsgruppe der GSF um Methoden der Qualitätssicherung für klinisches Prüfmaterial zu etablieren. Neben der Betreuung klinischer Studien ist die Grundlagenforschung ein weiteres Ziel, um die molekularen und zellulären Regulationen der Immunantworten besser verstehen zu können. Durch die Kombination der genannten Ziele wird es in Zukunft möglich sein, immer effizientere Therapieverfahren für die Klinik zu entwickeln.
Die Immunmonitoring-Technologien: Meist reicht ein einzelnes diagnostisches Verfahren nicht aus, um die vielschichtigen Folgen verschiedenster therapeutischer Maßnahmen auf das Immunsystem zu erfassen. Dies ist insbesondere der Fall, wenn es sich um individualisierte Therapieschemata handelt und/oder z. B. eine Tumorerkrankung weit fortgeschritten ist. Folgende Technologien wurden dafür am LTI etabliert:
• ELISPOT-Analysen (enzyme linked immunosorbent spot) zur Quantifizierung Antigen-spezifischer T-Zell-Antworten anhand von Zytokin- bzw. Granzym- oder Perforin-Produktion
• Cytometric bead array (CBA FlexSet, BD Biosciences) bzw. BioPlex-Assay (Bio-Rad, Luminex-Technologie) für die gleichzeitige Quantifizierung von über 20 verschiedenen Zytokinen und Chemokinen aus Serum oder Zellkulturüberständen sowie die Quantifizierung von Zell-signalling-Molekülen (Phosphoproteinen)
• Zytokin-Sekretions- bzw. capture-Assay (MACS®-Miltenyi-Technologie), der eine Anreicherung z. B. Tumor-spezifischer CD4+- und CD8+-T-Zellen auch ohne Kenntnis des Antigens erlaubt
• Multiparameter-Immunfluoreszenz am LSRII-Gerät (BD Biosciences) der GSF, für eine kombinierte phänotypische und funktionelle Analyse verschiedener T-Zell-Subpopulationen
• MHC/Peptid-Tetramer- bzw. Multimer-Bindungsanalysen, vorausgesetzt, dass immunogene, MHC-restringierte Antigene bekannt sind
• Quantitative T-Zell-Rezeptor-Analysen (TCR) mittels Real-time-RT-PCR, wie es z. B. für die RCC-26-Vakzinestudie möglich ist, da hier bereits Tumor-spezifische TCR-Sequenzen bekannt sind.
Um das zytotoxische Potential von T-Zellen zu charakterisieren, wurden zum einen ELISPOT-Assays für Granzym B und Perforin etabliert, zum anderen der Nachweis der sog. CD107a/b-Mobilisierung eingesetzt. Hierbei handelt es sich um vesikuläre Membranproteine, die während der Degranulierung transient an die Zelloberfläche kommen und dann über Bindung an einen Fluoreszenz-markierten monoklonalen Antikörper sichtbar gemacht werden. In Kombination mit einer Multimerfärbung, intrazellulärer Zytokin-bestimmung sowie einer Oberflächenmarker-analyse lassen sich am Durchflusszytometer sowohl der Phänotyp als auch die Spezifität und der funktionelle Status Antigen-spezifischer T-Zellen gleichzeitig überprüfen.
Eine derartige Mehrfarbenanalyse testen wir derzeit am LSRII-Gerät (BD Biosciences) der GSF.
Als Material für die Etablierung und Vali-dierung der Immunmonitoring-Technologien standen uns Blut- und Hautbiopsieproben der Patienten unserer klinischen Studien zur Verfügung. Um unter Therapie beispielsweise das Zytokinprofil der Zellen aus Biopsiematerial zu analysieren, wurde u. a. der Cytometric Bead Array eingesetzt. Abb. 1 zeigt das Zytokinprofil von T-Zellen aus der Haut-biopsie eines Patienten unserer Prostata-karzinomstudie nach mehrfacher Impfung.
IL-2 IL-4IL-5 IL-10 TNF-αααα IFN-γγγγ
IL-2 IL-4IL-5 IL-10 TNF-αααα IFN-γγγγ
IL-2 IL-4IL-5 IL-10 TNF-αααα IFN-γγγγ C
A
B
Abb. 1: Zytokinprofil der T-Zellen aus der Hautbiopsie eines Patienten der Prostatakarzinomstudie nach wiederholter Impfung. Die T-Zellen wurden in vitro mit der LNCaP/IL-2/IFN-γ Vakzine stimuliert und die Zytokine nach 48 Std. aus dem Überstand anhand eines CBA-Assays am Durchflusszytometer bestimmt. Das Fluoreszenzsignal FL2 ist proportional zur Zytokin-konzentration. Dargestellt ist der Überstand der kultivierten T-Zellen ohne Vakzine (A), stimuliert mit Vakzine (B) und der Vakzine allein zur Kontrolle (C).
Das Cancer Vaccine Consortium: Um auch auf internationaler Ebene die Immun-monitoring-Technologien evaluieren zu können, ist die Beteiligung am Cancer Vaccine Consortium des Sabin Vaccine Institutes, USA, vorteilhaft. Das Cancer Vaccine Consortium wurde 2002 mit dem Ziel gegründet, Immunmonitoring-Assays und klinische Studien zu standardisieren und zu validieren, Kombinationstherapien zu identifizieren, Informationsplattformen und internationale Workshops zu bilden, um die Entwicklung von Vakzinen für Krebserkrankungen zu forcieren und auch um internationale Firmen für die Weiterentwicklung von Krebsimpfstoffen zu interessieren. Letzteres ist besonders wichtig um die Translation von experimenteller prä-klinischer Forschung in die Klinik zu er-leichtern.
Im Jahr 2006 wurde ein internationales ELISPOT Proficiency Panel (EPP) durch-geführt, an dem auch die Immunmonitoring-Gruppe des LTI (H. Pohla, B. Stadlbauer,
Immunmonitoring 89
H. Herbig) beteiligt war. Hierfür wurden an 29 verschiedene Labore (USA, Kanada, Belgien, Frankreich, England, Schweiz, Deutschland) 4 tiefgefrorene PBMC-Proben gesunder Spender mit unterschiedlicher Reaktivität gegenüber Mischungen von Peptiden spezifisch für Cytomegalie-Virus (CMV) alleine bzw.
gegenüber CMV, Epstein-Barr-Virus und Influenza-Virus (CEF) verschickt. Platten-belegung und Zellzahl waren vorgeschrieben, die Reaktivität der Spender und die Antigene waren unbekannt. Jedes Labor konnte auch seine eigene ELISPOT-Methode und seine eigenen Reagenzien verwenden, um die Robustheit des Assay-Systems zu testen.
Abb. 2 zeigt die Plattenbelegung und das Ergebnis eines Experimentes.
no responder high responder
low responder medium responder Media
only
Media only CMV
CMV CEF
CEF no peptide
no peptide
Abb. 2: IFN-γ ELISPOT des Proficiency Panels. PBMC von vier Spendern mit unterschiedlicher Reaktivität gegenüber CMV- (Cytomegalie-Virus) bzw. CEF- spezifischen (Cytomegalie-Virus, Epstein-Barr-Virus, Influenza-Virus) Peptidantigenen wurden entsprechend der Plattenbelegung in jeweils sechs Replikaten mit 200.000 Zellen pro well der Mikrotiterplatte aufgetragen und mit den Antigenen über Nacht inkubiert.
Abb. 3 zeigt als Beispiel ein well der Mikrotiterplatten von allen beteiligten 29 Laboren. Hier zeigen sich deutliche Unter-schiede zwischen den einzelnen Laboren.
Ursachen dafür können sein: verwendetes Serum im Medium, fehlerhafte Zählung, unterschiedliche Antikörper und Kit-Systeme.
Trotzdem haben alle Labore zumindest die richtige Zuordnung der no, low, medium und high responder getroffen.
In Abb. 4 sind Box-plot-Analysen beispielhaft für Spender 1 (no responder) und für Spender 2 (high responder) gegenüber den CEF-Peptiden dargestellt.
Alle Ergebnisse des EPP werden derzeit validiert (S. Janetzki, ZellNet Consulting Inc., USA) und zur Publikation vorbereitet.
Um weiter zeigen zu können, wie wichtig derartige Evaluierungen der Immunmonitoring-
Technologien sind, haben wir den Einfluss von Serum im Medium getestet. Das Ergebnis ist sehr eindrucksvoll in Abb. 5 zu sehen.
Abb. 3: IFN-γ-ELISPOT des Proficiency Panels. Gezeigt ist jeweils well F3 (low responder) für alle beteiligten 29 Labore.
Overall Results – Donor 1 (no responder), CEF 50
40
30
20
10
0
Lab No.
Overall Results – Donor 2 (high responder), CEF 1000
800
600
400
200
0
Lab No.
Abb. 4: Box-Plots aller IFN-γ-ELISPOTs des Proficiency Panels am Beispiel Spender 1 (no responder, oben) und Spender 2 (high responder, unten) gegenüber den CEF-Peptiden. Dargestellt ist die Anzahl IFN-γ-produzierender PBMC für die einzelnen Labore.
0.0 20.0 40.0 60.0 80.0
ohne Peptid
CEF ohne
Peptid
CEF ohne
Peptid CEF
RPMI III
AB Serum RPMI III
HS Serum Medium
serumfrei
Anzahl IFNγ-sezernierenderT-Zellen
Abb. 5: Einfluss von Serum im Kulturmedium für die ELISPOT-Analysen. Gezeigt ist die Anzahl IFN-γ- produzierender Zellen pro eingesetzte 50.000 Zellen eines gesunden Spenders nach Stimulation mit CEF-Peptiden.
Fazit: Im Rahmen des ImmunoAssay Proficiency Panel Program sind 2007 zu-sätzliche Analysen für MHC/Peptid-Tetramer-Bindung (Leitung: P. Romero, Lausanne und C.M. Britten, Leiden), intrazelluläre Zytokin-messung (ICS; Leitung: H. Maecker, BD Biosciences, USA) und Proliferationsmessung anhand der Markierung der Zellen mit CFSE (Carboxylfluorescin-Succinimidyl-Ester; Leit-ung: J. Boyer, Pennsylvania, USA) geplant, an denen wir ebenfalls beteiligt sein werden. Ein ähnliches Ziel verfolgt auch die Monitoring Working Group des CIMT (Association for Cancer Immunotherapy) unter Leitung von C.M. Britten, C. Gouttefangeas, Tübingen, und S.H. van der Burg, Leiden.
Neben der Standardisierung der Immun-monitoring-Methoden und der Erstellung von Standard Operating Procedures (SOP) wird auch eine für die Auswertung klinischer Studien benötigt. Die Komplexität der klini-schen Resultate und der Immunmonitoring-Daten bei Patienten unter Immuntherapie benötigt dringend spezialisierte Analyse-methoden wie z. B. die Anwendung artifizieller neuronaler Netzwerke. Ein Computer-programm, das im LTI zur Verfügung steht, ist STATISTICA Neural Networks 7 (StatSoft, Tulsa, OK, USA). Hier ist die enge Kooperation mit A. Buchner (Urologische Klinik) von großer Bedeutung.
H. Pohla, B. Stadlbauer, H. Herbig, M. Odendahl 1, D.H. Busch 1, A. Cosma 2, K. Ebelt 3, D.J. Schendel 3 Koop.: 1 Institut für Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene, TU München; 2 Institut für Molekulare Virologie, GSF; 3 Institut für Molekulare Immunologie, GSF.
Förderung: BMBF DLR 01 GE 9624/1; BMBF DLR 01 GE 9625/4; KKG „Immuntherapien bei urologischen Tumoren“ (GSF/BMBF); KKG „Immunmonitoring“.
Antikörperplattform 91