(RCC-26/CD80/IL-2) zur Therapie von Patienten mit metastasiertem Nierenzellkarzinom (klinische Phase-I-Studie)
Studienaufbau und klinische Daten: Das Nierenzellkarzinom führt in Deutschland zu etwa 12.000 Neuerkrankungen im Jahr. Etwa jeder dritte Patient hat zum Zeitpunkt der Diagnosestellung bereits Metastasen, ein weite-res Drittel der Patienten entwickelt Metastasen im weiteren Verlauf. Während der Primärtumor in der Regel operativ entfernbar ist, stellt die Behandlung der metastasierten Erkrankung we-gen der Resistenz gewe-genüber Strahlen- und Chemotherapie ein großes Problem dar.
Zytokin-basierte Therapieformen und anti-angiogenetische Wirkstoffe wie die neuen Kinase-Inhibitoren führen bei einem Teil der Patienten zu begrenzten Erfolgen (meist nur eine vorübergehende Stabilisierung) bei oft er-heblichen Nebenwirkungen.
Das Ziel unserer Vakzinetherapie-Studie mit genetisch modifizierten Tumorzellen ist die Entwicklung einer spezifischen Therapie gegen das metastasierte Nierenzellkarzinom. Dabei wurde aus Tumormaterial eines HLA-A*0201- positiven Patienten eine Zelllinie etabliert (RCC-26), die durch genetische Modifikation (Transfektion mit Expressionskonstrukten für Interleukin-2 (IL-2) und CD80 (B7.1)) eine gegenüber der Ursprungszelle erhöhte Immunogenität aufweist und T-Zellen zu Proli-feration und Tumor-spezifischer Zytotoxizität aktivieren kann (Abb. 1). Dieses wurde in zahl-reichen In-vitro-Untersuchungen nachgewie-sen.
Es wurde eine klinische Phase-I-Studie initiiert, um die allogene RCC-26/CD80/IL-2-Tumor-zellvakzine an einem Patientenkollektiv mit metastasiertem Nierenzellkarzinom bezüglich folgender Zielvariablen zu testen:
• Sicherheit / Toxizität der Vakzine
• Aktivierung spezifischer Immunreaktionen
• Klinisches Ansprechen
Im Vordergrund stand dabei die klinische Überwachung der Patienten mit umfangreichen Laborkontrollen, insbesondere auch von Para-metern, die die Induktion potentieller Autoim-munreaktionen anzeigen (antinukleäre Antikör-per, Rheumafaktor, Komplementfaktoren u. a.).
Die Aktivierung spezifischer antitumoraler Immunreaktionen wird derzeit mit einer Reihe aufwändiger Methoden an Blutproben und Hautbiopsien der Patienten überprüft (Immun-monitoring, siehe unten). Die Beurteilung des
klinischen Ansprechens der Tumorerkrankung erfolgte durch engmaschiges Restaging der Pa-tienten mit Computertomographie und Skelett-szintigraphie.
Für den Einschluss von Patienten in die Vakzi-nestudie galten folgende Kriterien:
• metastasiertes Nierenzellkarzinom
• mindestens eine messbare Markerläsion
• keine systemische Therapie 3 Monate zuvor
• guter Allgemeinzustand
• keine Autoimmunerkrankung
• keine immunmodulatorische Therapie (Kortikoide etc.)
• HLA-A*0201-Subtyp
Abb. 1: (a) Die ursprüngliche Tumorzelle RCC-26 präsen-tiert zwar Tumorantigen, dies allein führt aber bei den zytotoxischen T-Zellen nicht zur Aktivierung. (b) Erst die genmodifizierte Vakzinezelle bewirkt durch das kostimu-latorische Signal (CD80) und die IL-2-Produktion die Proliferation und antitumorale Aktivierung der T-Zellen.
Damit die Vakzine zu einer effektiven Antigen-präsentation im Immunsystem des Patienten führen kann, sollte dieser zumindest ebenfalls den HLA-A*0201-Subtyp aufweisen. Dieses wurde an einer Blutprobe zunächst serologisch und nach Isolierung der genomischen DNA mittels PCR und Sequenzierung getestet. Der Subtyp HLA-A*0201 findet sich in Mittel-europa bei etwa der Hälfte aller Menschen.
Klinische Studien 77
Das Zeitschema für die Vakzinestudie (Abb. 2) zeigt die intradermale Applikation der Vakzine in drei ansteigenden Konzentrationsstufen so-wie die dreimalige Entnahme einer Hautbiopsie aus einer Applikationsstelle, um eine histo-pathologische Beurteilung des lokalen Zellin-filtrats 48 Stunden nach Applikation sowie funktionelle Untersuchungen an den infiltrie-renden Lymphozyten in der Zellkultur vorneh-men zu können. Bei drei Patienten wurde das Protokoll modifiziert, indem die vier Gaben der niedrigsten Dosisstufe gestrichen wurden, so dass von Anfang an 1 x 107 Vakzinezellen gegeben wurden.
Abb. 2: Zeitschema für die intradermale Applikation der Tumorzellvakzine in drei ansteigenden Dosisstufen. In Studienwoche 6, 14 und 22 wird jeweils eine Hautbiopsie aus einer Injektionsstelle (48 Stunden nach Vakzinegabe) entnommen.
Nr. Alter, m/w Stadium** Vakzine Survival 1 39, m T2N0M0G2 4 / 1 / - 31 2 66, m T2N0M1G3 4 / 4 / 2 79 3 68, w T3bN0M1G2 4 / 4 / 2 68 4 61, m T3bN0M1G2 4 / 4 / 2 76 5* 61, m T3bNxM1G2 - / 4 / - 18 6* 63, m T2N0M0G2 - / 4 / 2 84 7* 68, w T1N0M1G2 - / 4 / 2 79 8 65, w T2NxM0G1 4 / 4 / 2 55 9 49, m T3bNxM1G2 4 / 4 / - 17 10 48, w T1bN2M1G3 4 / - / - 8 11 53, m T1bN0M0G2 4 / 4 / 2 30 (lebt) 12 61, m T3aN0M1G3 4 / 4 / 2 36 (lebt) 13 58, m T2NxM1G2 4 / 4 / 2 29 (lebt) Tab. 1: Übersicht über die Patienten der Vakzinestudie (Stand 3/07). In der Spalte „Vakzine“ ist die Zahl der Applikationen pro Dosis-Stufe angegeben (2,5 / 10 / 40 x 106 Zellen). In der Spalte „Survival“ ist die Überlebenszeit in Wochen angegeben. * bei drei Patienten entfiel die niedrigste Dosis. ** Bei Stadium N0M0 und NxM0 traten die Metastasen zu einem späteren Zeitpunkt auf.
Insgesamt wurden 135 Patienten für die Studie HLA-typisiert, von denen 69 Patienten A*0201-positiv waren. Viele der Patienten waren jedoch zu progredient oder wurden von Klinikseite in Industrie-gesponserte Studien eingeschlossen. Bis März 2007 konnten jedoch
15 Patienten in die Studie eingeschlossen werden. Von diesen sind 13 Patienten auswertbar, da sie alle die komplette Anzahl an Vakzine-Applikationen erhalten haben oder gemäß dem Studienprotokoll bis zur Progression vakziniert worden sind (Tab. 1).
Ernsthafte systemische Nebenwirkungen traten bei keinem Patienten auf, ebenso gab es keinen Hinweis für die Induktion von klinisch rele-vanten Autoimmunphänomenen. Typisch war eine lokale Hautreaktion an den Injektions-stellen innerhalb von 48 Stunden (Rötung, Induration, leichter Juckreiz) im Sinne einer Typ-IV-Immunreaktion, die spontan wieder ab-geklungen und nicht behandlungsbedürftig war.
Bei einem Teil der Patienten fanden sich vorübergehende Erhöhungen von Amylase und Lipase (Abb. 3) sowie leichte Verschiebungen im Differentialblutbild (Anstieg der neutro-philen und eosinoneutro-philen Granulozyten, Abfall der Lymphozyten), aber kein Hinweis auf klinisch relevante Autoimmunphänomene wie etwa Thyreoiditis oder Pankreatitis.
Abb. 3: Beispiel für den Verlauf von Amylase und Lipase bei einem Patienten im Verlauf der zehn Vakzinierungen (Pfeile mit Angabe der Studienwoche am oberen Bildrand).
Beide Werte stiegen während der vier rasch aufeinander folgenden Vakzinegaben der mittleren Dosis an und normalisierten sich während der längeren Therapiepausen wieder (Einheiten: U/l).
Das mediane Zeitintervall bis zur Progression war 28 Monate, das mediane Überleben der Patienten betrug 68 Monate, drei Patienten sind noch unter Beobachtung (Stand 3/07, Abb. 4).
Remissionen wurden nicht beobachtet. Es besteht eine Assoziation zwischen dem Auftreten einer deutlichen lokalen Haut-reaktion an der Vakzine-Applikationsstelle und einem längeren Überleben. Dies kann als Hinweis auf einen immunologischen Effekt der Vakzine gewertet werden.
Derzeit laufen die umfangreichen Analysen zum Immunmonitoring sowie zur histopatho-logischen und funktionellen Untersuchung der Hautbiopsien. Einige der Ergebnisse sind im Folgenden dargestellt.
Abb. 4: Kaplan-Meier-Kurven für 13 Patienten. (A) Zeit bis zur Progression, (B) Gesamtüberleben.
Immunmonitoring: Für das Immunmonitoring wurden jeweils vor der ersten Vakzinierung und 48 Std. nach der 4., 8., und 10.
Vakzinierung, d. h. zum Zeitpunkt der Hautbiopsien, und zum Follow-up-Termin drei Monate später, Blutproben abgenommen. Bei fünf Patienten wurde zusätzlich 14 Tage nach der letzten Vakzinierung eine weitere Blut-probe abgenommen. Aus diesen heparinisierten Blutproben wurden PBMC isoliert und kryokonserviert. Ferner wurden jeweils vor der ersten Vakzinierung und vor und 48 Std. nach der 4., 8., und 10. Vakzinierung sowie vor und 24 Std. nach jeder Dosiserhöhung (5. und 9. Vakzinierung) zusätzliches Blut für die Serumgewinnung abgenommen. Auch das Serum wurde aliquotiert und kryokonserviert, und dient derzeit einer umfangreichen Multiplex-Zytokin-Bestimmung (IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, TNF-α, IFN-γ, GM-CSF etc.). Die mit Skalpell heraus-geschnittenen und maximal erbsengroßen Hautbiopsien wurden aufgeteilt und für die Immunhistologie sowie für die direkte RNA-Isolierung zum TCR-Tracking zunächst ebenfalls eingefroren. Außerdem wurden kleine Stückchen direkt in T-Zell-Kulturmedium aufgenommen, um auswandernde Lympho-zyten phänotypisch und funktionell charakterisieren zu können. Allerdings mussten die Zellen meistens 10-18 Tage mit
50 U IL-2/ml in Kultur gehalten werden, da ansonsten die Zellzahl ex vivo nicht ausgereicht hätte, um eine durchflusszytome-trische Analyse ihrer Zelloberflächenmarker und ihres Zytokin- bzw. Chemokin-Expressionsprofils durchführen zu können. In den meisten Fällen dominierten CD4+-T-Zellen vom Effector-memory-Typ in der Kultur. Die Zytokinprofile nach In-vitro-Stimulation mit den Tumorzellen wiesen bei einigen Patienten eine erhöhte Sekretion von IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 und GM-CSF auf. Die Sezernierung von TNFα und G-CSF nahm dagegen eher ab. IL-1β, IL-7, IL-12 und IL-17 waren meistens nicht detektierbar, IL-2 und IFN-γ ließen sich aus methodischen Gründen (lt. Firma: Serumgehalt im Medium) quan-titativ nicht reproduzierbar bestimmen. Gut ließen sich jedoch mittels des Cytometric Bead Arrays bei den Patienten die Chemokine IP-10 (CXCL10), MIG (CXCL9) und RANTES (CCL5) am Durchflusszytometer quantifizie-ren. Abb. 5 zeigt die verstärkte Sekretion von RANTES nach wiederholter Impfung am Beispiel von Patient 2.
Abb. 5: RANTES-Produktion der Haut-infiltrierenden Lymphozyten von Patient 2. Die Biopsieentnahmen erfolgten jeweils 48 Std. nach 4., 8. und 10. Vakzinegabe.
in vitro in der Kultur auswandernde T-Zellen wurden erneut mit der RCC-26/CD80/IL-2 Vakzine stimuliert. Die Chemokine wurden mittels des Cytometric Bead Arrays am FACSCalibur im Kulturüberstand bestimmt (Angabe in pg/ml aus 50 µl Kulturüberstand; 500.000 T-Zellen stimu-liert mit 50.000 Tumorzellen in 1,5 ml Medium).
RANTES ist ein Chemokin, das u. a. chemo-taktisch auf T-Zellen und Eosinophile wirkt, und eine aktive Rolle bei der Rekrutierung von Leukozyten in inflammatorisches Gewebe spielt. Es unterstützt insbesondere die Migra-tion von Monozyten und CD4+-T-Zellen.
Außer RANTES werden ebenfalls die Chemokine IP-10 und MIG nach Stimulation verstärkt sezerniert. Die Expression dieser Chemokine wird insbesondere über IFN-γ induziert und sie wirken ebenfalls
Klinische Studien 79
chemotaktisch auf aktivierte T-Zellen.
Betrachtet man jedoch die einzelnen Vakzinierungszeitpunkte, stellt sich dieser Ver-lauf durchaus unterschiedlich bei den einzelnen Patienten dar. Eine Korrelation zum klinischen Befund lässt sich derzeit noch nicht klar ableiten, da noch nicht alle Patientenproben analysiert worden sind.
TCR-Tracking: Speziell für unsere RCC-26- Vakzinestudie hat die quantitative Analyse des TCR über die Real-time-RT-PCR mittels des LightCycler große Bedeutung. Mit der Bestimmung der TCR-Sequenz eines autologen RCC-reaktiven TIL-26-Klones, erhielten wir einen außerordentlich nützlichen Surrogat-marker, um die Entwicklung von Tumor-assoziierten Immunantworten nicht nur in autologen und allogenen Kulturen sondern auch während der Vakzinierungen verfolgen zu können (Abb. 6).
TIL-26
„GG“
CDR3 AV20 GGSARQL AJ22
TIL-26
„LSG“
CDR3 AV20 LSGSARQL AJ22
AV20.3 – AJ22.3 AV20 – AJ22.5
Molekularer Marker zur
Molekularer Marker zur ÜÜberprberprüüfung der Reaktivierung/Expansion fung der Reaktivierung/Expansion Tumor
Tumor--assoziierterassoziierterGedäGedächtnischtnis--TT--ZellenZellen - Keine Kreuzreaktivität der Primer - Bestätigung durch Sequenzierung - Standardkurven (real-timeRT-PCR) Dominante in situ
TIL26 T-Zellklone
Abb. 6: TCR-Tracking. Die für TIL-26 charakteristische TCR-Sequenzen in der CDR3-Region des TCR können als molekulare Marker für die Quantifizierung Tumor-reaktiver T-Zellen in den Patienten dienen. Die CDR3-Region (complementary determining region-3) des TCR interagiert mit dem Peptidantigen und weist demnach auch die höchste Sequenzvariabilität auf.
Das TCR-Tracking ist gegenwärtig in Arbeit.
Abb. 6 zeigt die Expression des TIL-26-spezifischen TCR (AV20.3-AJ22.3 mit der
„GG“-Sequenz in der CDR3-Region) in der Hautbiopsie von Patient 6 nach der 4. Vakzi-nierung.
Abb. 7: Expression des TIL-26-spezifischen AV20.3-AJ22.3 TCR mit der „GG“-Sequenz in der CDR3-Region.
Die Gelanalyse der PCR-Amplifikate aus den Hautbiopsien zeigt im Vergleich zu Patient 1 in der Hautbiopsie von Patient 6 die spezifische Bande.
Die PBMC der Patienten dienen folgenden Immunmonitoring-Analysen:
• ELISPOT: IFN-γ, Perforin
• MHC/Peptid-Multimer-Färbungen
• Mehrfarben-Durchflusszytometrie am LSRII-Gerät: T-Zell-Subpopulationen, NK-Zellen, regulatorische Zellen
• TCR-Tracking
• In-vitro-Stimulationen (IVS)
Ergebnisse der 4-wöchigen IVS-Kulturen mit Zellen vor der ersten und nach der zehnten Vakzinegabe zeigen, dass die T-Zellen aus den Patienten mit der längeren Überlebensrate eine schnellere Proliferationsrate insbesondere gegenüber der Vakzine-Zelllinie aufweisen, was bedeuten könnte, dass hier bereits ein größerer Anteil an Effektor-Gedächtnis-T-Zellen vorliegt. Eine Analyse der Oberflächenmarker, des Zytokinprofils sowie der TCR-Expression wird auch hier derzeit durchgeführt.
Um Inter-Assay-Variabilitäten zu vermeiden, werden die sehr sensitiven aber auch empfindlichen ELISPOT-Assays erst durchge-führt, wenn die Proben aller Patienten vor-liegen. Aus Vorarbeiten wissen wir, dass die Verwendung eingefrorener PBMC kein Pro-blem für ELISPOT-Analysen darstellt.
Zwischenzeitlich konnten wir in Kooperation mit der GSF (D.J. Schendel, B. Frankenberger, E. Nössner), H.G. Rammensee und S. Stevano-vic (Tübingen), sowie D. Hunt (USA) 34 interessante Antigenkandidaten identifizieren, die als Surrogatmarker für das Immun-monitoring von Bedeutung sind. Für diese 34 Antigene wurden 78 Peptide mit HLA-A*0201-Bindungsmotiv bestimmt, die uns von R. Frank (Helmholtz-Zentrum für Infektions-forschung, Braunschweig) synthetisiert worden sind. Die Peptidepitope, die sich in den ELISPOT-Analysen als erfolgreich erweisen, werden dann für die Multimer-Herstellung verwendet (Kooperation: D. Busch, TU München).
Von Patient 5 stand nach einer notwendigen tumororthopädischen Operation Material einer Knochenmetastase zur Verfügung. Dieses Ge-webe wurde mittels quantitativer PCR analy-siert und zeichnete sich insbesondere durch Überexpression der Gene für G250, Survivin, PRAME, EGFR und Vimentin aus (Tab. 2).
Diese Antigene sind ebenfalls als geeignete Monitoringmarker für die Patienten ausgewählt worden.
1,37 1,44
0,44 754,83 CAIX(=G250) 1
0,84 0,65
0,03 94,35 PRAME 1
4,03 11,47
7,52 12,64 Vimentin 1
0,66 1,36
0,66 1,11 ELAC 1
1314,23 1,71
0,35 1,22 NY-ESO-1 1
26,72 85,04
17,03 14,83 EGFR 1
0,42 1,60
0,22 1,60 Adipophilin 1
6,72 155,42
58,89 114,56 Survivin 1
RCC26/CD80/IL7 RCC26/CD80/IL2
RCC26
#5 NN
Tab. 2: Expressionsanalyse einiger Genkandidaten mittels quantitativer Real-time-RT-PCR Normalisiert wurde auf primäres Normalnierengewebe (NN). Verglichen wurden die RCC-26-Zelllinien und Material aus der Knochen-metastase des Patienten 5. (Die Zahlen bedeuten n-fache Überexpression).
Zusammenfassung: Grundsätzlich handelt es sich bei RCC-26/CD80/IL-2 um eine sehr sichere Genvakzine. Es gab bisher keine ernsthaften systemischen oder lokalen Neben-wirkungen und keinen Anhalt für die Induktion einer Autoimmunität. Die bisher vorliegenden Daten deuten auf einen immunologischen Effekt mit Beeinflussung des Krankheits-verlaufs bei einem Teil der Patienten hin.
A. Buchner 1, H. Pohla, B. Stadlbauer, B. Konkol, H. Herbig, R. Oberneder 2, A. Baur 3, A. Hofstetter, C. Stief 1, T. Blankenstein 4, D.J. Schendel 5.
Koop.: 1 Urologische Klinik, Klinikum der Universität München; 2 Urologische Klinik, München-Planegg;
3 Institut für Klinische Radiologie, Klinikum der Universität München; 4 Institut für Immunologie, Charité Berlin und Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin, Berlin-Buch; 5 Institut für Molekulare Immunologie, GSF.
Förderung: BMBF DLR 01 GE 9624/1; KKG „Immun-therapien bei urologischen Tumoren“ (GSF/BMBF).
Klinische Studien 81