3.5.1 Prinzip der Immunhistochemie
Bei der immunhistochemischen Reaktion gelten die Immunglobuline, auch Antikörper genannt, als zentrale Reagenzien. Mit Hilfe dieser Antikörper lassen sich gewebliche oder zelluläre Antigene im histologischen Präparat darstellen und mittels verschiedener Farbreaktionen sichtbar machen (BOENISCH, 2003).
Bei der Fixierung von Gewebeproben in Formalin kommt es durch verschiedene chemische Reaktionen zu einer Reduktion der Antigenität. Formalinresistente Epitope überstehen die Formalinfixierung unbeschadet, formalinsensitive Epitope verändern in einem hohen Maße ihre chemische dreidimensionale Struktur (Konformationsänderung). Dabei werden aufgrund einer Reaktion des Formalins während der Fixierung mit den basischen Aminosäuren des Gewebes z.B. inter- oder intramolekulare Querverbindungen durch Hydroxymethylgruppen ausgebildet. Die Folge davon ist einerseits die Erhaltung der Morphologie des fixierten Gewebes, andererseits aber auch eine verminderte Permeabilität für Makromoleküle. So werden einige Antigene nach einer Formalinfixierung vom Antikörper nicht mehr erkannt. Dieser Vorgang ist zum Teil rückgängig zu machen. Die Antigene werden von den Methylgruppen nicht unbedingt zerstört, liegen aber maskiert vor, so dass der Antikörper sie nicht erkennen kann (BOENISCH, 2003).
Der Nachweis der maskierten Epitope gelingt nach einer enzymatischen Vorbehandlung, bei der die Epitope durch Proteolyse/Proteaseanverdauung für den Primärantikörper wieder zugänglich gemacht werden und somit ihre Immunreaktivität
wiederhergestellt wird. Eine weitere Methode zur Demaskierung von Antigenen kann mittels kochendem Citratpuffer (Fa. Quartett, Berlin) in der Mikrowelle erreicht werden (SHI et al., 1991).
Die Demaskierung an den untersuchten Paraffinschnitten erfolgte mittels Protease XIV (Fa. Sigma Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) bei 37°C und pH 7,4 für die enzym- und immunhistochemische Doppelfärbung zur Darstellung der Mastzellproteasen Chymase und Tryptase, mittels 0,05%iger Pronase E-Lösung (Fa.
Merck, Darmstadt) bei 37°C für 20 Min. für die IgE-Einfachfärbung oder mittels kochendem Citratpuffer (Fa. Quartett, Berlin) für 15 Min. für die Histamin-H4 -Rezeptor-Färbung. Um unspezifische Färbungen durch endogenes Biotin zu verringern, wurde die Aktivität der endogenen Peroxidase mit H2O2 (VWRTM
International GmbH, Darmstadt) gehemmt.
Zur farblichen Darstellung der Antigene wurde die Avidin-Biotin-Complex-Methode, (ABC-Methode) verwendet. Grundlage dieser Färbung ist eine hohe Affinität von Avidin (Hühnereiweiß) zu Biotin. Das Glykoprotein Avidin bindet an negativ geladene Gewebebestandteile bei einem isoelektrischen Punkt von 10 bei physiologischem pH. Das heißt, bei dieser Methode bindet ein unkonjugierter Primärantikörper zuerst an das Antigen. Ein biotinylierter Zweitantikörper bindet an den Erstantikörper. Der Peroxidase konjugierte Avidin-Biotin Komplex bindet mit den freien Stellen des Avidins an das Biotin des Zweitantikörpers. Die Bindungsstelle des Erstantikörpers an sein Epitop wird nun durch eine von der Peroxidase katalysierten Reaktion des zugefügten Chromogens zu einem Farbsubstrat sichtbar. Voraussetzung für die Bildung dieses Komplexes ist eine 30 minütige Inkubation des Gemisches aus Avidin und einem biotinmarkierten Enzym vor dem Gebrauch bei Raumtemperatur (GUESDON et al., 1979; BOENISCH, 2003). In Anlehnung an BUSSOLATI und GUGLIOTTA (1983) wird der pH-Wert des Puffers, in welchem die Substrate des ABC-Kits verdünnt werden, von 7,4 auf 9,4 erhöht. Dadurch läßt sich eine unspezifische Färbung der Mastzellen durch ABC vermeiden.
3.5.2 Primäre Antikörper
3.5.2.1 Primärantikörper zur Darstellung der Tryptase
Benutzt wurde ein kommerziell erhältlicher monoklonaler Antikörper (Isotyp IgG1) aus der Maus gegen humane Tryptase (Klon AA1, Fa. DakoCytomation GmbH, Hamburg). Spezifität, Klon-Nummer, Spezies, Verdünnung und Bezugsquelle sind der Tabelle 8 zu entnehmen. Eine Übersicht der verwendeten Antikörperkombinationen ist in Tabelle 8 und 10 dargestellt
3.5.2.2 Primärantikörper zur Darstellung von IgE an Mastzellen Verwendet wurde ein kommerziell erhältlicher, monoklonaler und an FITC
(Fluoresceinisothiocyanat) gekoppelter Antikörper aus der Ziege gegen den Hund (Fa. Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA). Spezifität, Spezies, Verdünnung und Bezugsquelle sind der Tabelle 8 zu entnehmen. Eine Übersicht der verwendeten Antikörperkombinationen ist in Tabelle 10 dargestellt.
3.5.2.3 Primärantikörper zur Darstellung von Histamin-4-Rezeptor (H4R) Benutzt wurde ein kommerziell erhältlicher, aus dem Kaninchen stammender und
gegen den Histamin H4 Rezeptor des Menschen gerichteter polyklonaler Antikörper (Fa. Novus Biologicals, LLC, Littleton). Spezifität, Spezies, Verdünnung und Bezugsquelle sind der Tabelle 8 zu entnehmen. Eine Übersicht der verwendeten Antikörperkombinationen ist in Tabelle 10 dargestellt.
3.5.3 Sekundäre Antikörper
3.5.3.1 Sekundärantikörper zur Darstellung der Tryptase
Verwendet wurde ein kommerziell erhältlicher, biotinylierter (biotinmarkierter), in der Ziege hergestellter und gegen Mäuse IgG (H+L) gerichteter Antikörper (BA 9200, Fa.
Vector Laboratories Inc., Burlingame). Spezifität, Spezies, Verdünnung und Bezugsquelle sind der Tabelle 9 zu entnehmen.
3.5.3.2 Sekundärantikörper zur Darstellung von IgE an Mastzellen
Benutzt wurde ein kommerziell erhältlicher, biotinylierter (biotinmarkierter), in der Ziege hergestellter und gegen FITC (Fluoresceinisothiocyanat) gerichteter Antikörper (BA 0601, Fa. Vector Laboratories Inc., Burlingame). Spezifität, Spezies, Verdünnung und Bezugsquelle sind der Tabelle 9 zu entnehmen.
3.5.3.3 Sekundärantikörper zur Darstellung von Histamin-4-Rezeptor (H4R) an Mastzellen
Verwendet wurde ein kommerziell erhältlicher, biotinylierter (biotinmarkierter), in der Ziege hergestellter und gegen Kaninchen IgG (H+L) gerichteter Antikörper (BA 1000, Fa. Vector Laboratories Inc., Burlingame). Spezifität, Spezies, Verdünnung und Bezugsquelle sind der Tabelle 9 zu entnehmen.
Tab. 8: Verwendete Primärantikörper
Primär-AK gegen
Klon Spezies Verdünnung Bezugsquelle
Tryptase AA1 Maus 1:700 Dako
IgE-FITC -- Ziege 1:60 000 Bethyl
H4R -- Kaninchen 1:100 Novus
Tab. 9: Verwendete Sekundärantikörper
Sekundär-AK
Klon Spezies Verdünnung Bezugsquelle
GAM-b AA1 Ziege 1:200 Vector
GA-FITC-b -- Ziege 1: 200 Vector
GAR-IgG-b -- Ziege 1:200 Vector
Abkürzungen: GAM-b = Goat mouse-biotinylated; GA-FITC-b = Goat anti-Fluoresceinisothiocyanat-biotinylated; GAR-b = Goat anti-rabbit-IgG-biotinylated.
Tab. 10: Übersicht der verwendeten Primär- und Sekundärantikörper
Um die Protease Chymase in den Mastzellen nachzuweisen, wurde der Naphtol AS-D Chloroazetat Esterase Kit (Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) verwendet. Dabei wird als Puffer TrizmalTM 6,3 Konzentrat verwendet, als Enzymsubstrat Naphtol AS-D Chloroazetat Lösung und als Farbsubstrat Fast Blue BB Basislösung eingesetzt. Natriumnitrit Lösung wurde als Katalysator der Reaktion verwendet.
Bei dem enzymhistochemischen Nachweis von der im Zytoplasma von Mastzellen befindlichen Chymase spaltet diese das Substrat Naphtol AS-D Chloroazetat, wobei Naphtol freigesetzt wird. Eine von Natriumnitrit katalysierte Reaktion von Naphtol mit dem Farbstoff Fast Blue BB sorgt für einen farbigen (blauen) Niederschlag im Zytoplasma der Mastzelle (Methode nach KLEINSCHMIDT et al., 2007). Die besten Ergebnisse ergaben sich, wenn das Enzym eine Umgebungstemperatur von 37,0°C bis 38,0°C hatte. Dies wurde durch permanentes Warmhalten aller Lösungen in