Immunhistochemische Methodik

Die Immunhistochemie ist eine etablierte Methode zur Untersuchung histologischer Gewebepräparate, auch von Tumorpräparaten.

Sie dient der Lokalisation und Identifikation von Proteinen mittels Antikörpern. In der vorliegenden Studie waren dies ABCA3 und TTF-1 in NSCLC.

TTF-1 kann die Expression von ABCA3 in der gesunden Lunge positiv beeinflussen, da das ABCA3-Gen eine Gruppierung potentieller Bindungsstellen für

Transkriptionsfaktoren, unter anderem TTF-1, enthält (siehe Kapitel 1.2 TTF-1).

ABCA3 wurde nun auch in NSCLC nachgewiesen (Overbeck et al. 2013). Aufgrund der vorhandenen Enhancer (der Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren) für TTF-1, wäre ein Einfluss von TTF-1 auf ABCA3 auch in NSCLC möglich. In der vorliegenden Studie wurden zunächst Tumorpräparate derselben Tumorprobe separat immunhistochemisch hinsichtlich dieser zwei Proteine untersucht. Um eine noch präzisere Aussage über die Expression von ABCA3 und TTF-1 in derselben Zelle treffen zu können, wäre eine Untersuchung mittels Immunfluoreszenzfärbung denkbar.

ABCA3

ABCA3 wurde in NSCLC bisher kaum untersucht. So gibt es nur eine Studie, die der vorliegenden Studie vorausgeht (Overbeck et al. 2013), die dieses Protein in NSCLC mittels Immunhistochemie untersucht hat. Dementsprechend untersuchten Overbeck et al. tissue microarrays (ausgestanzte Gewebezylinder aus NSCLC) mit Hilfe des gleichen Färbe- und Auswerteprotokolls, das auch in der vorliegenden Studie zur Anwendung kam (siehe Kapitel 2.2.2.4 Immunhistochemie).

Während ABCA3 in NSCLC kaum untersucht worden ist, kam die Immunhistochemie als Untersuchungsmethode bereits bei Untersuchungen von Gewebeproben unterschiedlichen Ursprungs (zum Beispiel Leber, Bauchspeichel-drüse und Kehlkopf) und Tumorzellen der akuten myeloischen Leukämie hinsichtlich ABCA3 zum Einsatz.

Stahlman et al. (2007) wiesen ABCA3 unter anderem in Gewebeproben der menschlichen Leber nach. Stahlman et al. produzierten eigene Antikörper gegen ABCA3. In der vorliegenden Studie wurde hingegen ein kommerziell erwerblicher Antikörper (Anti-ABCA3, antibody produced in rabbit von SIGMA Life Science) verwendet. Stahlman et al. (2007) produzierten einen Antikörper im Kaninchen – auch der in der vorliegenden Studie verwendete kommerzielle Antikörper wird im Kaninchen produziert. Durch einen kommerziell produzierten Antikörper, der

entsprechenden Qualitätskontrollen unterliegt, kann eine gleichbleibende Qualität des Antikörpers einfacher garantiert werden.

Stahlman et al. (2007) verdünnten ihren Antikörper allerdings auf 1:1000 und inkubierten ihn nur eine Stunde. In der vorliegenden Studie wurde hingegen eine Verdünnung von 1:150 verwandt und der Antikörper inkubierte über Nacht. Auf diese Weise wurde dem Antikörper mehr Zeit zur Reaktion mit dem Protein ermöglicht, um alle im Tumorpräparat vorhandenen Proteine ABCA3 sicher nachweisen zu können.

ABCA3 wurde aber nicht nur in menschlichen Gewebeproben unterschiedlichen Ursprungs wie bei Stahlman et al. (2007) immunhistochemisch untersucht, sondern auch in Zellen der akuten myeloischen Leukämie (Chapuy et al. 2008).

Chapuy et al. verwendeten bei ihren Untersuchungen keine Gewebeschnitte, wie in der vorliegenden Studie geschehen, sondern fixierten zuvor zentrifugierte Zellen in Formalin. Dies ist bei Zellen der akuten myeloischen Leukämie nicht anders möglich, da die akute myeloische Leukämie Zellen des blutbildenden Systems betrifft, die nicht in einem Gewebe bzw. Zellverband wie bei NSCLC auftreten.

Chapuy et al. (2008) verwendeten weiterhin den gleichen kommerziell her-gestellten primären Antikörper, der auch in der vorliegenden Studie zur Anwendung kam. Ebenso wie in der vorliegenden Studie wurde er über Nacht inkubiert, allerdings in einer Verdünnung von 1:200. Die in dieser Studie angewandte Verdünnung von 1:150 erwies sich in Vorversuchen zur vorausgegangenen Studie von Overbeck et al. (2013) als gleichwertig zur Detektion von ABCA3 im Gewebeverband.

Anders als in der vorliegenden Studie, in der ein separater Sekundär-Antikörper (ZytoChem Plus AP Polymer anti-Rabbit von ZYTOMED SYSTEMS) verwendet wurde mit anschließender Visualisierung mittels Liquid Permanent Red (Dako Real), verwendeten Chapuy et al. zur Visualisierung das EnVision System von Dako.

Dieses System verkürzt das Verfahren (es ist ein einfaches Zwei-Schritt-Visualisierungssystem). Es kann aber nicht an die Gegebenheiten verschiedener

Tumorgewebe angepasst werden wie das Verfahren, welches in der vorliegenden Studie angewandt wurde.

Die in der vorliegenden Studie definierte und verwendete Intensitätsskala zur Auswertung der immunhistochemisch gefärbten Tumorpräparate ist hingegen analog der von Chapuy et al. (2008) verwendeten Einteilung: Sie unterschieden in high (hoch≙I3), intermediate (mittel≙I2), low (niedrig≙I1) und negative (negative≙I0).

TTF-1

Im Gegensatz zu ABCA3 wurde TTF-1 in NSCLC bereits vielfach untersucht, auch immunhistochemisch.

So untersuchten Haque et al. (2002) die Expression von TTF-1 in NSCLC. Sie verwendeten ebenso wie in der vorliegenden Studie den kommerziellen primären Antikörper Monoclonal Mouse Anti-Thyroid Transcription Factor (TTF-1), clone 8G7G3/1 von Dako. Sie verwendeten jedoch eine Verdünnung von 1:800 im Gegensatz zur vorliegenden Studie, die eine geringere Verdünnung von 1:200 anwendete. Durch die höhere Konzentration sollte eine Reaktion aller Proteine von TTF-1 mit dem Antikörper sichergestellt werden.

Auch Perner et al. (2009) verwendeten den 8G7G3/1-Antikörper zum immunhistochemischen Nachweis von TTF-1 in NSCLC. Sie verwendeten eine noch geringere Verdünnung von 1:50. Anders als in der vorliegenden Studie nutzten Perner et al. (2009) nach Applikation des Primärantikörpers Ultraview Amp von Ventana. In der vorliegenden Studie wurde hingegen das NovoLink Polymer Detection System verwendet. Letzteres hat den Vorteil, dass die zu verwendenden Reagenzien in genormten Tropfflaschen geliefert werden, welche die Applikation enorm vereinfachen und somit Anwenderfehler minimieren.

Tan et al. (2003) nutzten ebenfalls zur immunhistochemischen Untersuchung von NSCLC hinsichtlich TTF-1 den 8G7G3/1-Antikörper und verwendeten die gleiche Verdünnung (1:200) wie in der vorliegenden Studie. Sie inkubierten die

Primär-antikörper jedoch nicht über Nacht, sondern nur 25 Minuten. Dies verkürzt Zeit, in der der Antikörper mit dem Protein reagieren kann, und könnte auf diese Weise dazu führen, dass nicht alle Proteine nachgewiesen werden. Des Weiteren benutzten Tan et al. (2003) ebenfalls im Anschluss an den Antikörper ein Nachweis-Kit, welches aber nicht näher benannt ist.

8G7G3/1 ist somit ein weit verbreiteter Antikörper zur Detektion von TTF-1 in Bronchialkarzinomen. Matoso et al. (2010) stellten in einer Vergleichsstudie zwischen den Antikörpern 8G7G3/1 und SPT24 jedoch fest, dass der vergleichsweise neuere SPT24 sensibler bei der Untersuchung von Bronchial-karzinomen hinsichtlich TTF-1 sein könnte.

Die Auswertung der gefärbten Tumorpräparate in der vorliegenden Studie ist semiquantitativ: Es wurde eine Intensitätsskala definiert, anhand derer die Untersucher die Auswertung am Lichtmikroskop vornahmen, dennoch sind die Ergebnisse partiell von den subjektiven Einflüssen der einzelnen Untersucher beeinflusst. Darum wurde bei jedem Tumorpräparat ein Konsens hinsichtlich des Ergebnisses gebildet.

Eine denkbare Alternative wäre eine Auswertung, die von mehreren Untersuchern vorgenommen wird, deren Ergebnisse dann gemittelt würden. Allerdings ist auch diese Auswertung immer noch semiquantitativ.