3. Ergebnisse
3.5. Markierung gereinigter fetaler Rattenleberextrakten mit InsP 6 /PP-InsP 5
3.5.6. Identifizierung von möglichen Inositolphosphat-markierten Peptiden mit
3.5.6.1. Vorbereiten von Proben für die Massenspektrometrie
Zuvor konnte gezeigt werden, dass InsP6/PP-InsP5 kovalent oder extrem stark und praktisch irreversibel ionisch an Proteine oder Proteinkomplexe der P100-Fraktion bindet (3.5.4.3., 3.5.4.4., 3.5.4.5.). Zur Identifizierung putativer zellulärer Akzeptormoleküle der InsP sollten SDS-Gelbanden massenspektroskopisch untersucht werden. Um die kovalente Bindung der InsP an Peptide zu belegen, sollten proteolysierte InsP-markierte Rattenleberextrakte chro-matographisch über eine Anionenaustauschersäule aufgetrennt werden, wobei die Chroma-tographie über das gebundene InsP erfolgen sollte.
Zur Gewinnung möglichst homogener Proben für die Massenspektrometrie (MS), die InsP-Peptid-Konjugate enthielten, wurden verschiedene Strategien verfolgt (2.4.19.1.). Da sich mit Trypsin-Proteolyse keine in SDS-Gelen detektierbaren Peptide erzeugen ließen (3.5.4.5) und sich die hochmolekulare Bande bei großen Proteinmengen als nur langsam proteolysierbar erwies, wurde 6[32P]-InsP6/6[32P]-PP-InsP5-markierter P100-Extrakt exzessiv mit Trypsin ver-daut bis alle Proteine außer der hochmolekularen Bande degradiert waren (Abb. 3.5-20 A).
Dadurch wurde diese Bande weitgehend von anderen, nicht InsP-bindenden Proteinen ge-reinigt.
Abb. 3.5-20: Gewinnung von SDS-Gelbanden für die MS-Analyse von 6[32P]-InsP6/6[32 P]-PP-InsP5-markiertem Rattenleberextrakt. A: Repräsentative SDS-PAGE und Autoradiogramm für ex-zessive Proteolyse von 6[32P]-InsP6/6[32P]-PP-InsP5-markiertem Rattenleberextrakt der P100-Fraktion mit Trypsin. Die mit einem Pfeil gekennzeichnete Bande wurde aus einem anderen, frischen Gel aus-geschnitten und massenspektrometrisch untersucht. B: SDS-PAGE von 6[32P]-PP-InsP5/[32P]-InsP6 -markiertem P100-Extrakt und Autoradiogramm des getrockneten Gels. Es wurden 150 µg Protein aufgetragen. Die mit einem Pfeil gekennzeichneten Banden wurden aus einem frischen Gel ausge-schnitten und massenspektrometrisch untersucht. SDS-PAGE (15 % Acrylamid), Autoradiogramm (Exposition über Nacht).
Die mit einem Pfeil gekennzeichnete Bande wurde massenspektrometrisch untersucht. Der Überstand wurde mit HPLC über eine Anionenaustauschersäule fraktioniert, um sehr kleine InsP-Peptid-Konjugate zu isolieren, die bei der Proteolyse entstanden sein könnten. Die De-tektion dieser [32P]-InsP-Konjugate sollte über die Radioaktivität erfolgen. Außerdem wurde nicht proteolysierter 6[32P]-InsP6/6[32P]-PP-InsP5-markierter P100-Extrakt über SDS-PAGE getrennt (Abb. 3.5-20 B) und die mit Pfeilen markierten Banden ebenfalls massenspektro-metrisch untersucht.
Ein weiteres Aliquot markierter P100-Extrakt wurde proteolysiert und ebenfalls über eine Anionenaustauschersäule mit HPLC fraktioniert. Die Messung der Radioaktivität in den HPLC-Fraktionen der mit Trypsin behandelten und unbehandelten Proben ergab keine deut-lich erkennbaren „neuen“ Peaks neben InsP6 und PP-InsP5, welche bei einer Bindung von InsP an Peptide zu erwarten gewesen wären. Da aber die radioaktiven Peaks durch nichtge-bundenes 6[32P]-InsP6/[32P]-PP-InsP5 sehr breit waren, ist es möglich, dass schwächere Sig-nale bei ähnlicher Retentionszeit davon überdeckt wurden. Leider war die MS-Analyse der mit HPLC gewonnenen Proben aus technischen Gründen bisher nicht möglich und die Chromatogramme sind daher im Anhang gezeigt (Abb. A-2).
3.5.6.2. Ergebnisse der massenspektrometrische Untersuchung der SDS-Gelbanden Die ausgeschnittenen Gelbanden (3.5.6.1) wurden mit Trypsin verdaut und die tryptischen Peptide aus dem Gel eluiert. Vor der MS-Analyse wurden die Peptid-Gemische über
Rever-179,3 kDa 65,8 kDa 27,5 kDa 16,1 kDa 6,7 kDa
200,0 kDa 97,4 kDa 66,2 kDa 45,0 kDa
A B
se-Phase-HPLC getrennt und mit ESI-MS im Tandem-Vefahren analysiert. Bei diesem Ver-fahren werden nicht nur die molekularen Massen der Peptide bestimmt, sondern einzelne ionisierte Peptide werden in einer Ionenfalle isoliert und durch Anlegen einer Resonanz-Spannung gestoßen, so dass sie in kleinere Fragmente zerfallen. Die Spaltung der Peptide erfolgt an bevorzugten Sollbruchstellen. Es entstehen dabei Serien von ionisierten Peptid-fragmenten, die sich in der Masse jeweils um die Aminosäure-spezifische Seitenkette unter-scheiden (Abb. 3.5-21). Aus den Massendifferenzen lassen sich die zugehörigen Aminosäu-ren und in Folge auch die Aminosäuresequenz ableiten.
Abb. 3.5-21: Fragmentierung von Peptiden zur Sequenzbestimmung mit Tandem-MS. Ionisierte Petidfragmente werden in einer Ionenfalle isoliert und durch kollisionsinduzierte Dissoziation (CID) in geladene kleinere Fragmente (B1-B3 und Y1-Y3) gespalten. Dadurch entstehen sogenannte MS/MS-Fragmentionenserien. (Abbildung aus Protein Identifizierung mittels Chromatographie, Mas-senspektrometrie und Datenbanksuche: Bettina Mayr, Hansjörg Toll & Christian Huber; Instrumentelle Analytik und Bioanalytik, Universität des Saarlandes).
Abb. 3.5-22 zeigt das MS/MS-Spektrum eines Peptidfragments. Wurden auf diese Art min-destens drei Peptide mit guten Spektren identifiziert, erfolgte eine Datenbanksuche über SEQUEST gegen NCBI mouserat.
Abb. 3.5-22: MS/MS-Spektrum (SEQUEST) eines Peptidfragments. Links sind die Massen der Fragmentionen angegeben.
Um die Vermutung zu überprüfen, dass es sich bei der Bindung der InsP an Peptide, um eine kovalente Modifikation handelt, wurde für Serin-, Threonin- und Tyrosin-haltige Frag-mente die Massen möglicher gebundener InsP einbezogen. Die berechneten InsPx-Massen sind unten angegeben. Dabei wurde ein bzw. zwei H2O-Moleküle unter Berücksichtigung der Kondensationsreaktion zwischen Peptid und InsPx von der theoretischen InsPx-Masse abge-zogen (Abb. 3.5-23).
A: R-InsP5: C6H17O21P5 = 579,895 Da, nach Veresterung mit Peptid:
579,895-H2O = 561,884 Da
B: R-InsP6: C6H18O24P6 = 659,861 Da, nach Veresterung mit Peptid:
659,861-H2O= 641,851 Da
C: R-InsP6-R: C6H18O24P6 = 659,861 Da, nach Veresterung mit zwei Peptidresten:
659,861-2 H2O = 623,84 Da
D: R-PP-InsP5: C6H19O27P7 = 739,828 Da, nach Veresterung mit Peptid:
739,828 - H2O = 721,817 Da
Abb. 3.5-23: Berechnung der Molekulargewichte möglicher Peptid-Modifikationen durch InsPx. Phosphatgruppen sind durch (P) vereinfacht dargestellt. R bedeutet beliebiger Peptidrest. Absolute Atommassen:1H = 1.0078250 Da, 16O = 15.9949146 Da, 12C = 12.0000000 Da, 31P = 30.9737615 Da.
Es konnten jedoch keine Peptide identifiziert werden, welche die angegebenen Massenver-schiebungen enthielten. Allerdings ist eine kovalente Modifikation von Peptiden durch InsP nicht vollständig auszuschließen, da die erhaltenen Fragmentionen häufig so klein waren, dass die technische Grenze der Methode erreicht war. In Tab. 3.5-1 sind die mit MS identifi-zierten Proteine aufgeführt. Die Proteinzusammensetzung der nicht mit Trypsin vorbehandel-ten Proben war, wie zu erwarvorbehandel-ten, nicht sehr homogen. Es konnvorbehandel-ten jedoch in allen analysier-ten Gelbanden verschiedene Ferritin-Untereinheianalysier-ten und ribosomale Proteine gefunden wer-den. In der hochmolekularen Bande, die der SDS-PAGE des mit Trypsin vorbehandelten
P O OH OH
O (P)
(P) (P)
OH
P O
O O OH
R
P OH OH
O (P)
(P) (P)
(P)
P O
O O OH
R O
P O
O O OH
R P O O OH
R
O (P)
(P) (P)
(P)
P O
O O OH
R P O
O OH OH
P O OH
O (P)
(P) (P)
(P)
A B C D
P100-Extrakts entstammte, wurden die leichte und die schwere Proteinkette des Ferritins und ein α-Ketten ähnliches Protein des Hämoglobins identifiziert.
Tab. 3.5-1: Ergebnisse der massenspektrometrischen Untersuchung der Gelbanden. Angege-ben sind die Art der Probe, das identifizierte Peptid, dessen NBCI gi-Nummer, das Molekulargewicht und die Sequenzübereinstimmung mit dem vorgeschlagenen Peptid. Peptide, die zu Protein-Komplexen gehören, die in den meisten der untersuchten Banden vorkommen, sind kursiv dargestellt.
Probe Protein gi-Nummer Masse
(Da)
Überein-stimmung
[%]
ribosomal protein L6 gi 16758864 33569,1 27,6
EF11_MOUSE Elongation factor 1-alpha 1 gi 1169475 50163,9 14,5
ribosomal protein L5 gi 13592051 34458,7 20,9
Geltasche
R5RTL7 ribosomal protein L7 gi 11383729 30329,3 17,7
hemoglobin beta chain, minor gi 92362 15992,4 87,1 hemoglobin beta chain complex gi 17985949 15979,4 75,5 acidic ribosomal protein P0 gi 11693176 34215,5 35,0
ferritin light chain gi 2119695 20782,5 64,5
unnamed protein product gi 12846200 27504,2 33,9 similar to ribosomal protein S18, cytosolic gi 27715307 17798,8 38,2 ribosomal protein S15a gi 14165469 14839,5 45,4 smilar to hemoglobin alpha chain gi 34870607 15284,5 58,5 similar to ribosomal protein L10a gi 34874214 25033 43,3 ribosomal protein S16, 40S rib prot S16 gi 4506691 16445,3 43,8 similar to 60S Protein L12 gi 27706782 17845,6 44,8 ribosomal protein S7, 40S rib prot S7 gi 4506741 22126,9 26,3 proteasome subunit alpha type 7 gi 34860906 27855,8 21,8 Lauffront
amino acid starvation-induced protein gi 202990 13874,3 33,3
ferrtitin light chain gi 2119695 20782,5 64,5
EF11_MOUSE Elongation factor 1-alpha 1 gi 1169475 50163,9 19,0 similar to ribosomal protein L7 gi 27660180 30313,2 28,8
ribosomal protein L4 gi 11968086 47256,8 15,2
similar to ribosomal protein L7a, surfeit3 gi 25025731 29978,6 27,8 Trenngel oben
ribosomal protein L6 gi 16758864 33569,7 29,3
ferritin light chain gi 2119695 20782,5 68,3
ferritin heavy chain gi 111625 20995,5 35,4
Trenngel oben nach Trypsin-Behandlung
similar to hemoglobin alpha chain gi 34870607 15284,5 36,6
3.6. Ferritin als möglicher Bindungspartner für hochphosphorylierte