3. Ergebnisse
3.1. Charakterisierung enzymatischer Eigenschaften der humanen IP6K-2
humanen Inositolhexakisphosphat-Kinase 2 (HsIP6K-2) mit N-terminalem Glutathion-S-Transferase (GST) Anhang verwendet.
Abb. 3.1-1: Immunologischer Nachweis rekombinanter GST-IP6K-2 durch Western-Blot. Zum Nachweis wurde der Kaninchen anti-Ratte-IP6K-2-Antikörper verwendet, der gegen die zwischen Rat-te und Mensch konservierRat-te katalytische Domäne des Enzyms gerichRat-tet ist [Saiardi et al., 2001b]. Auf-getragen wurden Aliquots des Expressionsansatzes vor Induktion (1), nach Induktion (2), der vereinig-ten Eluate aus der Affinitätschromatographie über Glutathion-Sepharose (3) und einem Eluat aus der Ionenaustauschchromatographie über DEAE Sephacel (4). Der Größenstandard ist der LMW-Marker.
Das Fusionsprotein hat ein Molekulargewicht von 75 kDa (26 kDa GST plus 49 kDa IP6K-2).
3.1.1. Bestimmung der Km-Werte für InsP6 und ATP
Die apparenten Km-Werte (Kmapp) für InsP6 und ATP wurden mit einem gekoppelten opti-schen Test (2.4.10.1. und 2.4.10.2.) durch sogenannte Single Transient-Messungen [Gut-freund, 1971: 189-203] bestimmt. Dafür wurden dem Reaktionsansatz bei konstanter ATP-Konzentration (5 mM) verschiedene ATP-Konzentrationen InsP6 (0,315-10 µM) bzw. bei konstan-ter InsP6-Konzentration (5 µM) verschiedene ATP-Konzentrationen (1-10 mM) zugefügt. Für InsP6 als Substrat wurden weitere Messreihen unter „physiologischen“ Hochsalzbedingungen (Standardreaktionsansatz mit 100 mM KCl) und unter niedrigen ATP-Konzentrationen (Stan-dardreaktionsansatz mit 1 mM ATP) durchgeführt, um den Einfluss dieser beiden Faktoren auf die Km-Werte zu untersuchen. Für die Reaktionsgeschwindigkeiten v und Vmax wurden im Folgenden immer die spezifischen Reaktionsgeschwindigkeiten (mU/mg) als Einheit an-gegeben. Dies ist möglich, da die Reaktionsgeschwindigkeiten in (pmol min-1 µg-1) gemessen und auf ein Volumen des Reaktionsansatzes berechnet wurden, dass 1 ml entsprach. Die spezifische Aktivität ((nmol min-1 mg-1) oder (mU/mg)) entspricht damit dem Vmax- bzw. v-Wert (nM min-1 l-1).
1 2 3 4
97,4 kDa
66,2 kDa
45,0 kDa
31,0 kDa
21,5 kDa
Die IP6K-2-Reaktionen wurden bis zum vollständigen Substratumsatz verfolgt (Abb. 3.1-2 A) und die initialen Substratkonzentrationen und die spezifischen Reaktionsgeschwindigkeiten (spez. v) bestimmt (Abb. 3.1-2 B und Abb. 3.1-3). Die so ermittelten Werte wurden nach Mi-chaelis-Menten aufgetragen und der apparente Km-Wert sowie die initialen Reaktionsge-schwindigkeit (v, initial) für jede Messung bestimmt. Die Auswertung einer Messreihe ist exemplarisch in Tab. 3.1-1 gezeigt. Hier wird deutlich, dass die aus den Michaelis-Menten-Auftragungen berechneten Km-Werte und initialen Reaktionsgeschwindigkeiten abhängig von der Substratkonzentration zunehmen. Durch doppelt-reziproke Auftragung nach Line-weaver-Burk aller ermittelten initialen Reaktionsgeschwindigkeiten gegen die initialen Sub-stratkonzentrationen (Abb. 3.1-4 und Abb. 3.1-6) wurde der spezifische Vmax-Wert (spez.
Vmax) und ein apparenter Km-Wert ermittelt. Bei dem gefundenen Km-Wert handelt es sich ebenfalls um einen apparenten Km-Wert (Kmapp), weil die IP6K-2 offenbar einer Produkt-hemmung durch PP-InsP5 unterliegt. Ein Hinweis auf eine Produkthemmung durch PP-InsP5 zeigt sich in der Zunahme der apparenten Km-Werte bei hoher Substratkonzentration (5-10 µM InsP6), wobei die Reaktionsgeschwindigkeiten offenbar nicht in gleichem Maß beeinflusst werden (Tab. 3.1-1), was dem Schema einer kompetitiven Hemmung entspricht (siehe auch 3.3.2.).
Abb. 3.1-2: Beispiel für Single Transient-Messung mit dem gekoppelten optischen Test zur Be-stimmung apparenter Km-Werte. Dargestellt ist der Reaktionsverlauf vor Substratzugabe (Vorlauf) und nach Starten der IP6K-2-Reaktion mit 10 µM InsP6 (A). Der Pfeil markiert das Starten der Reakti-on durch Substratzugabe. Die so gewReakti-onnenen Rohdaten wurden in MS Excel übertragen und ausge-wertet (B). Die Steigung des Vorlaufs wurde durch lineare Regression ermittelt und von der Steigung der IP6K-2 Kinetik abgezogen. Außerdem wurde die Kinetik normiert, d.h. der NADH-Verbrauch wurde in InsP6-Verbrauch umgewandelt und der Startpunkt der IP6K-2-Reaktion wurde auf null Minuten ge-setzt.
0 10 20 30 40 50
220 230 240 250
Zeit (min)
NADH-Verbrauch [µM]
0 10 20 30
0 2 4 6 8 10
Zeit (min) InsP6[µM]
A B
Abb. 3.1-3: Beispiel für die Auswertung der IP6K-2-Kinetiken in GraphPad Prism 4. Der in MS Excel bestimmte Substratverbrauch pro Zeiteinheit wurde in mU/mg Enzym (spez. v) umgerechnet und nach Michaelis-Menten gegen die Substratkonzentration aufgetragen. Die initiale maximale Reak-tionsgeschwindigkeit (v, initial hier als Vmax bezeichnet) und der Kmapp-Wert wurden durch das Pro-gramm berechnet.
Tab. 3.1-1: Auswertung der IP6K-2-Kinetiken. Die initiale Substratkonzentration wurde in MS Excel bestimmt. Kmapp und v, initial wurden aus den Michaelis-Menten-Auftragungen berechnet. Die PP-InsP5-Konzentrationen bei Kmapp ergeben sich durch Subtraktion der InsP6-Konzentration bei Kmapp
von den initialen InsP6-Konzentrationen.
InsP6 nominal InsP6 initial Kmapp PP-InsP5 bei Kmapp v, initial
[µM] [µM] [µM] [µM] (mU/mg)
0,315 0,7 0,388 0,312 145
0,500 0,9 0,501 0,399 180
1,250 1,5 0,643 0,857 270
2,500 2,5 1,032 1,468 304
5,000 4,6 1,977 2,623 400
10,000 9,0 3,707 5,293 469
Damit der eigentliche Km-Wert ermittelt werden konnte, wurde die Inhibitor-Konzentration, also [PP-InsP5], bei Kmapp für jede Messung mit InsP6 als variiertes Substrat berechnet (Tab.
3.1-1) und die Kmapp-Werte gegen die Inhibitor-Konzentration aufgetragen (Abb. 3.1-5, nach Segel, 1968: S. 251). Aus dem Graphen wurden der „wahre“ Km-Wert und die Inhibitor-Konstante (Ki-Wert) bestimmt. Der Ki-Wert beschreibt die Effektivität eines Inhibitors und ist äquivalent zu der Inhibitor-Konzentration, die in der Auftragung von 1/v vs. 1/[S] nach
Line-0 2 4 6 8 10
0 100 200 300 400
Best-fit values VMAX KM Std. Error VMAX KM
469.1 3.707 6.731 0.1090
InsP6 [µM]
v, spez (mU/mg)
weaver-Burk bei verschiedenen Inhibitor-Konzentrationen zu einer Verdoppelung der Stei-gung der Regressionsgraden führt. Je kleiner Ki ist, desto effektiver wirkt ein Hemmstoff. Für das Substrat InsP6 wurde zudem die Konstante kcat (Vmax/Km in (min-1)) berechnet, die bei Reaktionen erster Ordnung die Affinität eines Enzyms zu einem Substrat beschreibt. Ist die Substratkonzentration viel kleiner als Km, also [S] << Km, dann bedeutet ein kcat-Wert von >
1, dass bei konstanter Umsatzgeschwindigkeit mehr als 100 % des Substrates in einer Minu-te umgesetzt werden. Die so ermitMinu-telMinu-ten enzymatischen DaMinu-ten sind in Tab. 3.1-2 und Tab.
3.1-3 zusammengefasst.
Abb. 3.1-4: Bestimmung von spez. Vmax für InsP6 durch doppelt-reziproke Darstellung nach Lineweaver-Burk. Es wurden die reziproken Werte der rechnerisch bestimmten initialen Reaktions-geschwindigkeiten gegen den reziproken Wert der jeweiligen nominalen Substratkonzentration aufge-tragen. 1/(spez. Vmax) ergibt sich dann aus dem Schnittpunkt der Ordinate. Es sind die Daten für drei Messreihen dargestellt, bei denen die KCl bzw. die ATP-Konzentration variiert wurde. Jeder Daten-punkt entspricht einer Transienten.
Abb. 3.1-5: Bestimmung des Km-Wertes für das Substrat InsP6 und des Ki-Wertes für PP-InsP5. Die aus den Kinetiken ermittelten apparenten Km-Werte wurden gegen die an diesen Punkten vorlie-genden PP-InsP5-Konzentrationen (Inhibitor-Konzentration bei Produkthemmung) aufgetragen. Auf diese Weise lässt sich der wahre Km-Wert aus dem Ordinaten-Schnittpunkt und der Ki-Wert aus dem Abzissen-Schnittpunkt ablesen [Segel, 1976: S. 251]. Es sind die Daten für drei Messreihen darge-stellt, bei denen die KCl- bzw. die ATP-Konzentration variiert wurde. Jeder Datenpunkt entspricht einer Transienten.
0 2 4 6 8
1 2 3 4 5
5 mM ATP, 30 mM KCl 5 mM ATP, 100 mM KCl 1 mM ATP, 30 mM KCl
PP-InsP5 bei Kmapp [µM]
Kmapp
-1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5
2.5×10-3 5.0×10-3 7.5×10-3 1.0×10-2 1.2×10-2
5 mM ATP, 30 mM KCl 1 mM ATP, 30 mM ATP 5 mM ATP, 100mM KCl
1/InsP6 [1/µM]
1/v, initial (mg/mU)
Tab. 3.1-2: Ermittelte maximale Reaktionsgeschwindigkeiten, Km- und Ki-Werte für die IP6K-2-Reaktion unter Standard- und Hochsalzbedingungen sowie bei niedriger ATP-Konzentration.
Reaktionsbedingungen spez. Vmax Kmapp Km Ki kcat
(mU/mg) [µM] [µM] [µM] (min-1)
5 mM ATP, 30 mM KCl 560,54 ± 33,61 1,79 0,16 ± 0,05 0,25 3,5 5 mM ATP, 100 mM KCl 543,48 ± 41,77 1,25 0,14 ± 0,05 0,51 3,9 1 mM ATP, 30 mM KCl 235,85 ± 20,15 1,03 0,22 ± 0,07 0,48 1,1
Abb. 3.1-6: Bestimmung des spezifischen Vmax- und des apparenten Km-Werts für das Sub-strat ATP durch doppelt-reziproke Darstellung nach Lineweaver-Burk. Aufgetragen wurden die reziproken Werte der rechnerisch bestimmten initialen Reaktionsgeschwindigkeiten gegen den rezi-proken Wert der jeweiligen nominalen Substratkonzentration. 1/(spez. Vmax) ergibt sich dann aus dem Schnittpunkt der Ordinate und 1/Kmapp aus dem Schnittpunkt der Abzisse. Jeder Datenpunkt entspricht einer Transienten.
Tab. 3.1-3: Ermittelte maximale Reaktionsgeschwindigkeit und Kmapp-Wert für ATP bei Sub-stratsättigung.
Reaktionsbedingungen spez. Vmax Kmapp
(mU/mg) [mM]
5 µM InsP6 453,7±79,93 1,96
Für die IP6K-2-Reaktionen unter Standardbedingungen (5 mM ATP, 30 mM KCl) mit InsP6 als Substrat wurde ein spezifischer Vmax-Wert von 560,54 ± 33,61 mU/mg, ein Km-Wert von 0,16 ± 0,05 µM, ein Ki-Wert von 0,25 µM und kcat= 3,5 min-1 bestimmt. Der kcat-Wert zeigt, dass die IP6K-2 das Substrat InsP6 mit hoher Effektivität umsetzt. Hohe Salzkonzentrationen (100 mM KCl) beeinflussen die Konstante nicht signifikant, während eine niedrige ATP-Konzentration (1 mM) den kcat-Wert verringert. Hier nimmt aber nicht die eigentliche Affinität
-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5
2.0×10-3 4.0×10-3 6.0×10-3 8.0×10-3
1/ATP nominal [1/mM]
1/v, initial (mg/mU)
der IP6K-2 gegenüber InsP6 ab, sondern es wird nur die verringerte Reaktionsaktivität durch eine geringere Konzentration des zweiten Substrates ATP deutlich. Diese verringerte Reak-tionsaktivität zeigt sich sowohl in einer leichten Erhöhung des Km-Werts für InsP6 als auch in einer deutlichen Erniedrigung von Vmax. Die Salzkonzentration im Reaktionsansatz beein-flusst den Km-Wert nicht signifikant. Eine Produkthemmung durch PP-InsP5 konnte insofern bestätigt werden, dass sich die „wahren“ Km-Werte für InsP6 unter den verschiedenen Reak-tionsbedingungen etwa 5-10fach gegenüber den apparenten Km-Werten erniedrigt sind. Die-se Erniedrigung ist unter Standard- und Hochsalzbedingungen stärker (etwa 10fach) als bei niedrigen ATP-Konzentrationen. Die gefundenen Ki-Werte liegen zwischen 0,25 und 0,51 µM.
Der apparente Km-Wert für ATP als Substrat wurde mit 1,96 µM und der spezifische Vmax-Wert mit 453,7 ± 79,93 mU/mg bestimmt. Der wahre Km-Vmax-Wert liegt wahrscheinlich, wie für das Substrat InsP6 beobachtet, deutlich niedriger, wurde aber aus technischen Gründen nicht bestimmt.