Einfluss der Calcium- und Magnesium-Konzentration, Hitze und TCE-Fällung auf

P]-InsP6/6[³²P]-PP-InsP5

In Vorversuchen (2.4.16.1.) sollte geklärt werden, ob eine spezifische Markierung von Ge-webeextrakten mit InsP in vitro überhaupt erreicht werden kann und ob sich diese Reaktion auf bestimmte zelluläre Fraktionen der Gewebeextrakte beschränkt. Außerdem sollten ver-schiedene Reaktionsbedingungen mit unterschiedlichen Konzentrationen an freiem, d.h.

nicht in Komplexe mit ATP oder EDTA gebundenem, Magnesium und Calcium geprüft wer-den. Dadurch sollte ermittelt werden, ob die putative Phytylierung auf eine Komplexierung von InsP6/PP-InsP5 mit diesen Ionen zurückzuführen ist und ob möglicherweise Ca²⁺- oder Mg²⁺-aktivierte Enzyme in die Markierungsreaktion eingebunden sind. Zudem wurde getes-tet, ob durch Hitze- oder Säurebehandlung die radioaktiven Markierungen physikalisch ent-fernt werden können. Durch ein Erhitzen der Probe, werden Salz- und Wasserstoffbrücken destabilisiert, wodurch physikalisch assoziierte InsP von der Proteinmatrix gelöst würden.

Durch dieses Vorgehen konnten nicht nur Erkenntnisse bezüglich optimaler Reaktionsbedin-gungen für eine solche Markierung erlangt werden, sonder es wurden auch erste Hinweise über die Art der Bindung zwischen InsP und makromolekularem Zellmaterial gewonnen.

Tatsächlich fielen die Markierungsversuche mit den verschiedenen Zellfraktionen der Leber-extrakte sehr unterschiedlich aus (Abb. 3.5-6). In allen Fraktionen war unabhängig von der Magnesium- und Calciumkonzentration und einem Kochen der Proben in SDS-Probenpuffer eine mehr oder weniger stark ausgeprägte radioaktive Markierung der Probenlauffront im Trenngel (weißer Pfeil in Abb. 3.5-6 D) und eine Retention radioaktiven Materials in den Geltaschen (gestreifter Pfeil) zu beobachten. Besonders in der P100- (schwarzer Pfeil, Abb.

3.5-6 D und Abb. 3.5-7; Bestandteile der Plasmamembran) aber auch der P10- (Abb. 3.5-6 C; Mitochondrien) und P2-Fraktion (Abb. 3.5-6 B; schwere Membranen und Kerne) trat au-ßerdem eine hochmolekulare (~ 200 kDa) nicht scharf laufende Bande auf. Diese Bande war jedoch nur bei Proben zu beobachten, die zuvor in SDS-Probenpuffer erhitzt wurden. In ei-nem Experiment konnten ebenfalls hochmolekulare Banden in der S100-Fraktion (Abb. 3.5-6 E; lösliche zytosolische Bestandteile) detektiert werden, die sich in weiteren Experimenten aber nicht reproduzieren ließen. Die Ergebnisse zeigten keine Abhängigkeit von der Magne-sium- und Calcium-Konzentration im Reaktionsansatz. (Abb. 3.5-6 und Abb. 3.5-7). Die Kon-trollen zeigten keine ausgeprägte radioaktive Markierung im Trenngel (Abb. 3.5-6 F und G).

Abb. 3.5-6: Markierung gereinigter fetaler Rattenleberextrakte mit 6[³²P]-PP-InsP5/[³²P]-InsP6. Gereinigte fetale Rattenleberextrakte der P0.5- (A), P2- (B), P10- (C), P100- (D) und S100-Fraktion (E) wurden unter Basisreaktionsbedingungen mit 1 mM Mg²⁺ und 6[³²P]-PP-InsP5/[³²P]-InsP6 2 h bei 37 °C inkubiert und dann durch SDS-PAGE (10 % Acrylamid) und Autoradiogramme (Expositionszeit 72 h) analysiert. Dargestellt sind Versuchansätze mit 20 µM Ca²⁺ (Spur 1 und 2) oder ohne Ca²⁺ (Spur 3 und 4). Es wurden jeweils 50 µg Protein pro Spur aufgetragen, wobei Aliquots jedes Versuchsansat-zes zuvor 1 min bei 95 °C erhitzt (Spur 1 und 3) oder direkt aufgetragen wurden (Spur 2 und 4). In F wurde Basisreaktionsansatz (1 mM Mg²⁺, 20 µM Ca²⁺) aufgetragen, der mit 0,12 nmol 6[³² P]-PP-InsP5/[³²P]-InsP6 für 2 h bei 37 °C inkubiert wurde. In G wurde dem Reaktionsansatz 0,5 µg IP6K-2 zugefügt. Die Aliquots in der Spur 1 wurden zuvor 1 min bei 95 °C erhitzt und die Aliquots in Spur 2 direkt aufgetragen. Pfeile in D: gestreift: Geltasche; schwarz: hochmolekulare Bande; weiß: Lauffront der Proben.

200,0 kDa 97,4 kDa 66,2 kDa 45,0 kDa 31,0 kDa

200,0 kDa 97,4 kDa 66,2 kDa 45,0 kDa 31,0 kDa

200,0 kDa 97,4 kDa 66,2 kDa 45,0 kDa 31,0 kDa

A B

C D

E F G

Abb. 3.5-7: Calcium- und Magnesiumabhängigkeit der Markierung gereinigter fetaler Rattenle-berextrakte mit 6[³²P]-PP-InsP5/6[³²P]-InsP6. Extrakt der P100-Fraktion wurde in Gegenwart von 0,12 nmol 6[³²P]-PP-InsP5/6[³²P]-InsP6 mit unterschiedlichen Ca²⁺- und Mg²⁺-Konzentrationen in Ba-sisreaktionspuffer für 1 h bei 37°C inkubiert (0,5 mM Mg²⁺: Spur 1,2; 0,5 mM Mg²⁺ + 70 µM Ca²⁺: Spur 3,4; 2 mM Mg²⁺:Spur 5,6; 2 mM Mg²⁺ + 70 µM Ca²⁺: Spur 7,8). Aliquots jedes Versuchsansatzes wur-den vor Gelauftrag 1 min bei 95°C erhitzt (Spur 1,4,5,7). Dargestellt sind SDS-PAGE (10 % Acrylamid) und Autoradiogramm des getrockneten Gels (Expositionszeit 16 Tage). Es 50 µg Protein pro Spur aufgetragen. Der schwarze Pfeil markiert die hochmolekulare radioaktive Bande.

In allen Autoradiogrammen konnte beobachtet werden, dass sehr viel radioaktives Material in den Geltaschen der SDS-Sammelgele verblieb. Hierbei könnte es sich z.B. um unlösliche Inositolphosphat-Magnesium- oder andere Inositolphosphat-Komplexe handeln, die aufgrund ihrer Molekülgröße nicht in das Gel hineinlaufen können und eventuell InsP-markiertes Pro-teinmaterial binden. Da derartige InsP-Komplexe in Folge der Protonierung der Hydro-xygruppen der Phosphatreste im sauren Milieu gut löslich sein sollten, wurden 6[³² P]-InsP₆/6[³²P]-PP-InsP₅-markierte Leberextrakte vor der Trennung durch SDS-PAGE mit 10 % TCE gefällt. Durch diese Behandlung konnte eine deutliche Reduktion des in den Geltaschen verbleibenden Materials erzielt werden. Exemplarisch sind die Autoradiogramme der Versu-che mit Extrakten der P0.5- und der P100-Fraktion in Abb. 3.5-8 dargestellt. Interessanter-weise führte eine TCE-Behandlung des P100-Extraktes zu einer deutlichen Verstärkung des radioaktiven Signals bei ca. 200 kDa. Die unterschiedlichen Mengen radioaktiven Materials in den Spuren 5-8 (Abb. 3.5-8 B) sind auf unterschiedliche Probenmengen zurückzuführen.

In Kontrollen, die aus Standardreaktionspuffer mit 6[³²P]-InsP₆/[³²P]-PP-InsP₅ und IP6K-2 bestanden, konnte durch TCE-Behandlung radioaktiver unspezifischer Hintergrund fast voll-ständig eliminiert werden (Abb. 3.5-9).

200,0 kDa 97,4 kDa 66,2 kDa 45,0 kDa 31,0 kDa

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8

Abb. 3.5-8: Einfluss der TCE-Fällung der Proben auf das Laufverhalten der radioaktiv-markierten Rattenleberextrakte. Gereinigte fetale Rattenleberextrakte wurden in Basisreaktionspuf-fer in Gegenwart von 1 mM Mg²⁺ und 20 µM Ca²⁺ (Spur 3,4 und 7,8) oder ohne Ca²⁺ (Spur 1,2 und 5,6) mit 6[³²P]-PP-InsP5/[³²P]-InsP6 für 2 h bei 37 °C inkubiert. Die radioaktiv-markierten Leberextrakte wurden anschließend durch SDS-PAGE (10 % Acrylamid) getrennt und Autoradiogramme der ge-trockneten Gele erstellt (Expositionszeit 4 Tage). Es wurden Aliquots à 50 µg Protein pro Spur aufge-tragen. Aliquots der Spur 5-8 wurden mit TCE gefällt. Aliquots der Spur 1, 3, 5 und 7 wurden vor dem Gelauftrag 1 min bei 95 °C erhitzt. Alle anderen Proben wurden direkt auf das Gel aufgetragen (Spur 2, 4, 6, 8). Dargestellt sind SDS-PAGE und Autoradiogramm der P0.5 Fraktion (A) sowie das Autora-diogramm der P100-Fraktion (B). Pfeile: gestreift: Geltasche; schwarz: hochmolekulare Bande.

Abb. 3.5-9: Einfluss der TCE-Behandlung auf das Laufverhalten von 6[³²P]-PP-InsP5/[³²P]-InsP6. Als Kontrolle diente einmal Basisreaktionspuffer mit 1 mM Mg²⁺ und 20 µM Ca²⁺ (Spur 1-4), dem eine entsprechende Menge 6[³²P]-PP-InsP5/6[³²P]-InsP6 und 0,5 µg IP6K-2 zugesetzt wurden. Es wurde für 2 h bei 37 °C inkubiert. Die Proben wurden anschließend durch SDS-PAGE (10 % Acrylamid) getrennt und Autoradiogramme der getrockneten Gele erstellt (Expositionszeit 4 Tage). Aliquots der Spur 3 und 4 wurden mit TCE behandelt. Die Proben der Spur 1 und 3 wurden vor dem Auftragen auf das Gel für 1 min auf 95 °C erhitzt, Proben der Spur 2 und 4 wurden direkt aufgetragen. Es war eine deutliche Abnahme der in den Geltaschen verbleibenden Radioaktivität sowie ein vollständiger Rückgang ra-dioaktiven unspezifischen Hintergrunds im Trenngel nach TCE-Fällung zu beobachten.

Die Ergebnisse deuten auf eine relativ spezifische, wahrscheinlich kovalente Bindung von 6[³²P]-InsP₆/6[³²P]-PP-InsP₅ an makromolekulares Zellmaterial hin, da die hochmolekulare Bande nicht in allen Zellfraktionen auftritt bzw. besonders stark in der P100-Fraktion ausge-prägt ist. Da sich keine Abhängigkeit der radioaktiven Markierung von der Konzentration di-valenter Kationen zeigte, handelt es sich wahrscheinlich nicht um eine Reaktion, die durch

1 2 3 4 5 6 7 8

179,3 kDa 65,8 kDa 38,6 kDa 27,5 kDa

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8

A B

179,3 kDa 65,8 kDa 38,6 kDa 27,5 kDa

1 2 3 4 1 2 3 4

Ca²⁺- oder Mg²⁺-aktiviert wird. Eine Komplexbildung der InsP mit diesen divalenten Kationen, die zu unspezifischen Signalen führen könnte, konnte zumindest für die hochmolekulare Bande ausgeschlossen werden. Das Laufverhalten der hochmolekularen Bande im SDS-Gel und die Notwendigkeit eines Erhitzens der Proben deuten auf eine Bindung der InsP an ei-nen hochmolekularen Komplex hin, der über Salz- und Wasserstoffbrücken in hochmolekula-rer vermutlich polymehochmolekula-rer Form stabilisiert wird. Dieser Komplex muss nicht zwangsläufig ein Proteinkomplex sein, da keine distinkte Bande im SDS-Gel dem radioaktiven Signal zuge-ordnet werden konnte. Nach TCE-Fällung der Proben war eine verbesserte Löslichkeit die-ses putativen hochmolekularen Komplexes zu beobachten, was sich einer Zunahme des radioaktiv-markierten Materials in der hochmolekularen Bande zeigte und auf ionische Bin-dungen innerhalb des putativen Komplexes hindeutet.

3.5.4.2. Zeit- und Temperaturabhängigkeit der Markierung von Rattenleberextrakten mit 6[³²P]-InsP6/6[³²P]-PP-InsP5

Nachdem in Vorversuchen (3.5.4.1) keine erschöpfend sicheren Hinweise auf eine Beteilung von Enzymen an der Markierung von gereinigten Rattenleberextrakten mit 6[³² P]-InsP₆/6[³²P]-PP-InsP₅ gefunden werden konnten und die Ergebnisse auf eine Beteilung ioni-scher Bindungen an der Assoziation der InsP mit makromolekularem Zellmaterial hindeute-ten, wurde die Kinetik der Markierungsreaktion untersucht. Bei einer unspezifischen Absorp-tionen der InsP an die zelluläre Matrix, die auf Wechselwirkungen von ionischen Ladungen beruhen, sollte die Reaktion schnell ein Maximum erreichen und unabhängig von der Inkuba-tionstemperatur sein. Extrakte der P100-Fraktion wurden unterschiedlich lange (0, 5, 30 und 90 min) mit den radioaktiven InsP bei 37 °C inkubiert (2.4.17.1.). Als Kontrolle diente ein Ali-quot, das für 90 min auf Eis inkubiert wurde. Das SDS-Gel und das Autoradiogramm sind Abb. 3.5-10 gezeigt. Die mit den Pfeilen markierten Banden wurden stückweise aus den ge-trockneten Gelen geschnitten und die Radioaktivität bestimmt. Eine Zunahme des radioakti-ven Signals war in den Geltaschen, für die hochmolekulare Bande und in der Lauffront zu beobachten (Abb. 3.5-11). Die Radioaktivität im Gelhintergrund (65 kDa) blieb unverändert.

Die Radioaktivität der auf Eis inkubierten Proben lag nach 90 min in allen Bereichen auf dem Niveau der jeweiligen 0min-Probe der bei 37 °C inkubierten Proben. Die radioaktive Markie-rung des Zellmaterials unterliegt also sowohl einer Zeit- und Temperaturabhängigkeit und ist daher wahrscheinlich nicht nur auf rein ionische Bindungen sondern auf eine temperaturab-hängige kovalente Reaktion zurückzuführen.

0 20 40 60 80 100 0

25 50 75

Sammelgel Trenngel.oben Trenngel.Lauffront 65 kDa

250 500 750 1000 1250

Zeit (min)

Radioaktivität (cpm)

Abb. 3.5-10: Zeitabhängigkeit der Markierung von Rattenleberextrakt der P100-Fraktion durch 6[³²P]-PP-InsP5/[³²P]-InsP6. Extrakt der P100-Fraktion wurden unter Standardreaktionsbedingungen mit 6[³²P]-PP-InsP5/6[³²P]-InsP6 für 5 min (3), 30 min (4) und 90 min (5) auf dem Heizblock bei 37 °C inkubiert. Ein Aliquot P100-Extrakt wurde 1,5 h auf Eis inkubiert (1) und ein Aliquot sofort mit TCE gefällt (2). Die Trennung der Proben erfolgte durch SDS-PAGE (10 % Acrylamid) und die Detektion der Radioaktivität in den getrockneten Gelen mit einem Phosphoimagerscreen (Expositionszeit 6 h).

Pro Spur wurden jeweils 100 µg P100-Extrakt aufgetragen. Alle Proben wurden vor dem Auftrag auf das Gel mit TCE gewaschen und 1 min bei 95 °C erhitzt. Die mit schwarzen Pfeilen gekennzeichneten Bereiche des Gels wurden Spurweise ausgeschnitten und die Radioaktivität im Flüssig-Scintillations-Zähler bestimmt.

Abb. 3.5-11: Graphische Darstellung der Zeit- und Temperaturabhängigkeit der Markierung von gereinigtem Rattenleberextrakt durch 6[³²P]-PP-InsP5/[³²P]-InsP6. Es wurden Standardreaktionen mit Extrakten der P100-Fraktion bei 37 °C (offene Symbole) und auf Eis (geschlossene Symbole) durchgeführt. Die Proben wurden durch SDS-PAGE getrennt und die getrockneten Gele mit einem Phosphoimagerscreen analysiert. Definierte Bereiche (Abb. 3.5-10) wurden vollständig aus dem ge-trockneten SDS-Gel ausgeschnitten und die Radioaktivität im Flüssig-Scintillations-Zähler bestimmt.

Die ausgeschnittenen Bereiche entstammten den Geltaschen des Sammelgels, der hochmolekularen Bande im Trenngel, einem Bereich im Trenngel, der auf Höhe von 65 kDa liegt, sowie der Lauffront der Proben.

3.5.4.3. Säurestabilität der radioaktiver Signale in 6[³²P]-InsP6/6[³²P]-PP-InsP5