Homologe Kompetitionsexperimente mit Zellmembranhomogenaten zur Berechnung von K D

In homologen Kompetitionsexperimenten sind der eingesetzte Radioligand und der Kompetitor strukturell identisch. Diese Versuchsanordnung ermöglicht die Bestimmung der Gleichgewichts-dissoziationskonstante KD des Radioliganden, welche für die Berechnung der Bindungsaffinität strukturverschiedener Testsubstanzen (siehe Abschnitt 2.1.3.5) bekannt sein muss. Für jede verwendete Charge eines Zellmembranhomogenats wurde der KD-Wert des verwendeten Radioliganden [³H]NMS berechnet und die Anzahl der vorhandenen Bindungsstellen Bmax als weiteres Charakteristikum bestimmt.

Versuchsdurchführung

In einer Mikrotiterplatte mit 96 Kavitäten (V5) wurden steigende Konzentrationen des „kalten“

(nicht-radioaktiven) Kompetitors N-Methylscopolamin (NMS) vorgelegt (s. Pipettierschema Tab.

Verweis). Für die Messung der unspezifischen Bindung wurde eine supramaximale Konzentration der strukturverwanden Substanz Atropin eingesetzt, welche die gleiche spezifische Bindungsstelle an muskarinischen Rezeptoren wie NMS besetzt. Die Messung der Gesamtbindung erfolgte in Abwesenheit eines Kompetitors. In jedem Versuch wurden die einzelnen Messwerte in Dreifachbestimmung durchgeführt.

Zu jedem Ansatz wurden [³H]NMS und 12,5 mM HEPES-Puffer (L9) hinzugefügt. Die Endkonzentration des Radioliganden sollte dabei 0,2 nM betragen, da sich diese Menge aus Erfahrung in Gleichgewichtsexperimenten gut bewährt hat. Die tatsächliche [³H]NMS-Konzentration wurde wie in Abschnitt 2.1.3.2 beschrieben bestimmt.

Das konzentrierte Membranhomogenat aus M2- bzw. M4-Rezeptor exprimierenden FlpIn^TM -CHO-Zellen (siehe Abschnitt 2.1.1.2) wurde mit HEPES-Puffer (L9) so verdünnt, dass eine Gesamtbindung von 400-600 cpm zu erwarten war (meist 1:10 bis 1:20). Dieser Bereich wurde gewählt, um einerseits ein ausreichend großes Messfenster zu erreichen. Andererseits wurde sichergestellt, dass bei der angestrebten [³H]NMS-Konzentration von 0,2 nM im Versuchsansatz nur maximal 10% an Rezeptoren gebunden und somit stets ein Überschuss des Radioliganden für die Kompetition mit kalten NMS vorlag.

Der Start der Bindungsreaktion erfolgte durch Zugabe des Zellmembranhomogenats zu jedem Ansatz. Die Mikrotiterplatte wurde mit Parafilm abgedeckt, die Probenansätze mithilfe eines Rotationsmischers kurz gemischt und anschließend bei 30°C unter ständigem Schütteln im Wasserbad für 2 Stunden inkubiert. Diese Inkubationszeit war anhand von Erfahrungswerten ausreichend zur Erreichung eines Gleichgewichts am M2- bzw. M4-Rezeptor mit NMS.

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Tab. 2.6 Pipettierschema zur homologen Kompetition mit [³H]NMS im Gleichgewicht an Zellmembranhomogenaten. Die entsprechenden Lösungen des Kompetitors NMS, Atropin und des Radioliganden wurden jeweils mit Aqua dest. (R1) hergestellt.

Durch schnelle Vakuumfiltration am Tomtec®-Harvester (G10) wurde der Versuch beendet. Dabei wurden die Zellmembranfragmente durch eine Glasfaserfiltermatte (V8) zurückgehalten, welche zuvor für 2 min in eiskalter 0,1%iger PEI-Lösung (L18) zur Herabsetzung der unspezifischen Absorption eingelegt worden war. Das automatische Filtrationsprogramm beinhaltete das Absaugen der Versuchsansätze durch den Filter und zweimaliges Spülen jeder Kavität mit ca. 500 µl Aqua dest.

(R1, gekühlt auf 2-8°C), wobei das Spülwasser ebenfalls durch den Filter abgesaugt wurde. Nach erfolgter Filtration wurde die Filtermatte für ca. 3 min bei 400 Watt in einer haushaltsüblichen Mikrowelle getrocknet. Anschließend wurde mit Hilfe eines Heizblocks (G8) ein Szintillationswachs (V4) bei ca. 70°C auf die Filtermatte aufgeschmolzen. Nach Erkalten wurde diese in eine transparente Folienhülle (V10) überführt und die enthaltene Radioaktivität mit einem Szintillationsmessgerät (G1) in der Einheit cpm (counts per minute) gemessen.

Versuchsauswertung (KD und Bmax)

Aus den gemessenen Werten der unspezifischen Bindung wurde der Mittelwert berechnet und dieser von jedem Messwert der Gesamtbindung und der Kompetition abgezogen, um die spezifische Bindung zu erhalten. Diese korrigierten Werte wurden anschließend gegen die logarithmierte Konzentration des Kompetitors aufgetragen. Die korrigierte Gesamtbindung, theoretisch betrachtet die spezifische Bindung des Radioliganden bei unendlich großer Verdünnung des Kompetitors, wurde ebenso einbezogen, indem ihr ein um zwei Dekaden kleinerer Wert als die kleinste tatsächlich verwendete Kompetitor-Konzentration zugeordnet wurde. Anschließend wurde eine nicht-lineare Regressionsanalyse mit Hilfe des Computerprogramms GraphPad Prism® durchgeführt, wobei die in der Software vorhandene Vier-Parameter-logistische Gleichung (siehe Gleichung 15) als Modell genutzt wurde. Dabei wurde stets mittels F-Test überprüft, ob ein von nH=-1 signifikant abweichender Hill-Koeffizient vorlag. Ein Wert von -1 wurde an dieser Stelle erwartet, da es sich bei diesem Gleichgewichtsbindungsversuch um eine 1:1-Interaktion zwischen den strukturidentischen Liganden und dem Rezeptor handelte. Eine abweichende Kurvensteilheit, z. B. eine flacher Kurvenverlauf mit 0>nH>-1, hätte auf eine inhomogene Rezeptorpopulation hingedeutet und die Interpretation der Daten wäre anhand des dargestellten theoretischen Hintergrunds nicht sinnvoll gewesen. Die folgende Abbildung zeigt schematisch den Kurvenverlauf eines Kompetitions-experiments mit nH=-1.

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0 200 400 600 800

*

oberes Plateau

unteres Plateau log EC₅₀

log c_Kompetitor

cpm/0,5 ml

Abb. 2.2 Schematische Darstellung des Kurvenverlaufs eines homologen Kompetitionsexperiments mit [³H]NMS.

Ordinate: gemessene Radioaktivität korrigiert abzüglich der unspezifischen Bindung im Versuchsansatz. Abszisse:

Logarithmus der eingesetzten Kompetitor-Konzentration. Kurvenanpassung: Vier-Parameter-logistische Gleichung (siehe Gleichung 15) mit einem Hill-Koeffizienten von nH=-1. In Abweichung von Gleichung 15 werden hier das obere und untere Plateau der Kurve als Top und Bottom (statt Emax und Basal) bezeichnet, da es sich um kein funktionelles Experiment handelt.

Die Lage dieser „Bindungskurve“ ist durch den Wendepunkt charakterisiert, welcher vom verwendeten Computerprogramm als logEC50 und in der entlogarithmierten Form als EC50-Wert ausgegeben wird. Bei Radioligand-Bindungsexperimenten ist dieser abhängig von der eingesetzten Radioligand-Konzentration, jedoch lässt sich nach Cheng und Prusoff (1973) daraus die Gleichgewichtsdissoziationskonstante KD des beim homologen Kompetitionsversuch verwendeten Radioliganden anhand der folgenden Gleichung berechnen:

Gleichung 6

Weiterhin lässt sich anhand von homologen Kompetitionsversuchen die Rezeptordichte Bmax (in mol/l) des verwendeten Zellmembranhomogenats nach DeBlasi et al. (1989) berechnen.

Gleichung 7

mit

Gleichung 8

(Top-Bottom) Spannhöhe der Kompetitionskurve 2,9 Umrechnungsfaktor von cpm nach dpm 0,5ml Volumen der Versuchsansätze

F individueller Verdünnungsfaktor des Zellmembranhomogenats

Der KD-Wert von [³H]NMS und die Rezeptordichte Bmax wurde für jede verwendete Charge der Zellmembranhomogenate durch mindestens drei unabhängige Experimente bestimmt. Diese Kennwerte sind im Anhang (siehe 6.1) zusammengestellt. Dabei wurde die Rezeptordichte auf den Proteingehalt jedes Zellmembranhomogenats (siehe Abschnitt 2.1.1.3) bezogen, um die Chargen besser miteinander vergleichen zu können.

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2.1.3.4 Homologe Kompetitionsexperimente mit lebenden Zellen zur Bestimmung der