1. EINLEITUNG
1.3. Hintergrund der Arbeit
Die durch Atherosklerose entstandenen Koronarstenosen werden heutzutage bevorzugt durch die perkutane transluminale koronare Angioplastie (PTCA) behoben. Hierfür steht die Ballondilation mit oder ohne Stent-Implantation zur Verfügung. Die anfängliche Erfolgsrate ist größer als 90 %, allerdings treten bei 20 – 40 % der Patienten Restenosen auf, die diese Therapiemethode limitieren (Popma et al. 1992, Topol et al. 1993, Bauridel et al. 2002). Ein möglicher Grund für die hohe Restenoserate könnte eine Endothelverletzung bei der Dilation selbst sein. Bosmans et al. (1996) haben am Kaninchen gezeigt, dass sich zwar das Endothel nach einer Verletzung durch eine Angioplastie relativ schnell regeneriert, seine Funktion aber längerfristig vermindert bleibt. Die durch die Aufdehnung entstandene endotheliale Dysfunktion könnte somit die Entstehung eines neuen Plaques in dem dilatierten Bereich hervorrufen. Auf Grund der hohen Restenoserate werden andere, mögliche Angriffspunkte für die Atherosklerosetherapie diskutiert. Am naheliegendsten erscheint die Wiederherstellung der endothelialen Funktion. Eine zentrale Rolle bei der endothelialen Funktion spielt das NO, wie die Forschungsarbeiten der letzten Jahre verdeutlichen. 1992 wurde NO vom Wissenschaftsmagazin „Science“ zum Molekül des Jahres gewählt, und 1998 erhielten Louis J. Ignarro, Robert F. Furchgott und Ferid Murad für ihre Forschungstätigkeit um das Signalmolekül NO den Nobelpreis für Physiologie bzw. Medizin. Als Substrat der NO-Synthase wurde das L-Arginin zu einem der Forschungsschwerpunkte des NO-Stoffwechsels. Eine erste konkrete Therapieidee zur Senkung der Restenoserate nach Ballonangioplastie lieferte Tarry und Makhoul (1994). Sie konnten im Tierversuch zeigen, dass L-Arginin zu einer Reduktion der Intimahyperplasie nach Ballonangioplastie führt.
Bode-Böger et al. konnten 1996 zeigen, dass sich bei Patienten mit PAVK die Durchblutung durch intravenöse Gabe von L-Arginin steigern lässt. Eine positive Wirkung von oralem L-Arginin bei Patienten mit Hypercholesterinämie und Herzversagen wurde noch im selben Jahr beschrieben. Auch hier konnte eine Dilation der Gefäße durch L-Arginin erzielt werden (Clarkson et al. 1996, Rector et al. 1996). Rector et al. (1996) konnten neben der gesteigerten Durchblutung auch einen Anstieg der Lebensqualität verzeichnen. Wenige Jahre später konnten bei Patienten mit stabiler Angina pectoris erste Erfolge mit L-Arginin beobachtet werden. Blum et al. setzten 1999 orales L-Arginin ein und erzielten eine deutliche Verbesserung der Angina-pectoris-Symtomatik. Cermuzynski et al. (1997) erreichten durch eine dreitägige orale Gabe von L-Arginin eine Verringerung der ST-Streckensenkung unter Belastung bei Patienten mit Angina pectoris. Lerman et al. konnten 1998 eine Verbesserung
der endothelialen Funktion durch Langzeitgabe von L-Arginin zeigen und schlugen L-Arginin als eine mögliche Therapiemaßnahme vor. Ihre Ergebnisse wurden 2000 von Maxwell et al.
bestätigt. In dieser Studie konnte eine Verbesserung der endothelialen Dysfunktion durch orale Gabe von L-Arginin in Kombination mit Antioxidantien erzielt werden. 2002 wurde dann erstmals von Suzuki et al. L-Arginin gezielt zur Restenoseprävention im Stentbereich eingesetzt. Diese Forschungsgruppe konnte zeigen, dass im Vergleich zur Therapie mit Kochsalzlösung die intramurale Applikation von L-Arginin zu einer reduzierten neointimalen Hyperplasie im Stentbereich führt. Sie proklamierten ihre Ergebnisse als möglichen neuen Therapieansatz zur Prävention von Stentrestenosen. Dieser positive Effekt auf die Restenoserate konnte von Dudek et al. (2002) allerdings nicht bestätigt werden.
Dennoch lassen die anderen oben genannten Studien den Schluss zu, dass L-Arginin oral als unterstützende Therapie bei Atherosklerose und Angina pectoris geeignet zu sein scheint.
Diese Annahme basiert auf seiner Funktion als NO-Lieferant, die mit einer positiven Auswirkung auf die Thrombozytenaggregation, Monozytenadhäsion und Proliferation der Muskelzellen zu Schaumzellen gekoppelt ist. Somit wäre es möglich, dass L-Arginin einer erneuten Stenose nach Angioplastie entgegenwirken könnte.
Zur Bestimmung des oxidativen Status stehen heute eine Vielzahl analytischer Methoden zur Verfügung. Die Bestimmung von MDA hat ihre Anfänge in der Bestimmung der so genannten Thiobarbitursäure-reaktiven-Substanzen (TBARs). Bei dieser Methode entstehen durch die Reaktion mit Thiobarbitursäure farbige Verbindungen, die mittels Spektrometrie oder Fluorimetrie bestimmt werden können (Sinnhuber et al. 1958, Yagi 1976). Da die Thiobarbitursäure eine hoch reaktive Substanz ist, mangelt es bei der Bestimmung der TBARs an Selektivität. In den frühen Thiobarbitursäure-Assays wurden daher neben MDA auch andere Substanzen mit Keto- oder Aldehydfunktionen (Zucker, Aminosäuren, HNE, Harnstoff, Biliverdin) bestimmt. Zusätzlich entstanden auf Grund der Reaktionsbedingungen während der Bestimmung artifizielle TBARs aus Vorläufern (Esterbauer et al. 1991). Somit waren die erzielten Messergebnisse eher ein Index für die Lipidperoxidation als eine genaue Bestimmung der MDA-Konzentration. Um eine höhere Selektivität zu erreichen, wurden die Thiobarbitursäure-Assays mittels Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) weiterentwickelt (Bird et al. 1983, Wade et al. 1985, Yu et al. 1986). Diese Entwicklung machte eine Abtrennung der MDA-Thiobarbitursäureprodukte von anderen Reaktionsprodukten möglich. Bis zum heutigen Zeitpunkt sind neben den fortgeschrittenen TBARs-Methoden diverse andere HPLC- und Gaschromatographie-Massenspektrometrie
(GC/MS)-Methoden zur Bestimmung des oxidativen Stresses entwickelt worden. Die für HPLC-Methoden benutzten Derivatisierungsreagenzien sind z.B. 2,4-Dinitrophenylhydrazin (DNPH) (Esterbauer et al. 1982), Diaminonaphtalen (Steghens et al. 2001) und 9-Fluorenylmethoxycarbonylhydrazin (Mao et al. 2006). Die Derivatisierung bei GC/MS-Methoden wird hauptsächlich mit Methylhydrazin (Fujioka und Shibamoto 2005), Phenylhydrazin (Cighetti et al. 1999), DNPH (Maboudou et al. 2002), 2-Hydrazinobenzthiazol (Beljean-Leymarie und Bruna 1988) und Pentafluorophenylhydrazin (Yeo et al. 1994) durchgeführt. Die weiterentwickelten Methoden sind um ein Vielfaches spezifischer als die ursprüngliche Thiobarbitursäure-Methode. Des Weiteren können sie sowohl für die Bestimmung des freien MDAs als auch für die Bestimmung des gesamten MDAs herangezogen werden (Cighetti et al. 1999, Steghens et al. 2001). Als interne Standards wurden zur Bestimmung von MDA in den letzten Jahren die verschiedensten Verbindungen eingesetzt (Luo et al. 1995, Rauli et al. 1998). In Bezug auf die Reproduzierbarkeit wird allerdings der Einsatz von deuteriertem MDA als Optimum angesehen. Schon 1968 bzw. 1985 wurden Methoden zur Herstellung von dideuteriertem MDA (3-Hydroxy[1,3-2H2]-2-propenal) vorgestellt (Hamberg et al. 1968, Basu und Marnett 1985). Allevi et al. optimierten 1994 die Methode von Basu und Marnett (1985). Heutzutage wird 1,3-d2-1,1,3,3-Tetraethoxypropan zur Herstellung von zweifach deuteriertem MDA von mehreren Arbeitsgruppen zur GC/MS-Analytik eingesetzt (Cighetti et al. 1999, Fenaille et al.
2001, Cighetti et al. 2002).
Die zurzeit genauste Analyse von Stoffgemischen ist mit der GC/MS bzw. der Gaschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (GC/MS/MS) zu erreichen. Unter GC/MS versteht man die physikalisch-chemische Auftrennung von Komponenten eines Probengemisches, die unzersetzt verflüchtigt werden können, mit einer sich anschießenden Strukturidentifizierung und Quantifizierung durch die Massenspektrometrie. Die GC/MS ermöglicht heutzutage den sicheren Nachweis von Verbindungen im Bereich von 10-9 bis 10-12 g. Das Prinzip der Massenspektrometrie beruht auf dem Zerfall der zu bestimmenden Moleküle in strukturspezifische Fragment-Ionen, die entsprechend ihres Masse-Ladungs-Verhältnisses aufgetrennt werden. Durch die Kopplung von zwei Massenspektrometern in Serie entsteht die GC/MS/MS. Durch die Kopplung wird ein weiterer Zerfall der Ionen-Fragmente in so genannte Ionen auslöst. Durch die Analyse der Eltern- und Tochter-Spektren ist mit der GC/MS/MS eine detailliertere Strukturanalyse als mit der eindimensionalen GC/MS möglich. Zusätzlich erhöht sich durch die Fragmentierung in Tochter-Ionen bei der GC/MS/MS noch zusätzlich die Selektivität. Beide Methoden sind
unempfindlich gegenüber interferierenden Substanzen. Als Nachteile der GC/MS- und GC/MS/MS-Analytik sind die oft aufwändige Probenvorbereitung mit kombinierten chromatographischen Trennverfahren und die Entwicklung geeigneter Derivatisierungs-techniken für die gaschromatographische Analyse zu erwähnen.
In der von uns durchgeführten klinischen Studie wurde die Konzentration von MDA im Plasma nach einem im Jahre 1995 von Luo et al. publiziertem Verfahren mittels GC/MS/MS als Pentafluorobenzylhydroxylamin-Derivat bestimmt. Vor dem Einsatz dieser Methode in unserer Studie wurde dieses adaptierte Verfahren modifiziert, intern validiert und seine Eignung für die Messung von MDA in den Studien-Proben festgestellt. Zusätzlich sollte die analytische Verlässlichkeit dieser Methode durch eine weitere, unabhängige GC/MS/MS-Methode überprüft werden. Da solch eine GC/MS/MS-Methode weder in der Literatur noch im hiesigen Institut bis Beginn der Studie verfügbar war, sollte im Rahmen dieser Arbeit eine neue GC/MS/MS-Methode für die Bestimmung von MDA im Humanplasma entwickelt und validiert werden. Alle derzeit erhältlichen Methoden zur Analyse von MDA basieren auf der Derivatisierung der Aldehyd-Funktion von MDA. Der neuen Methode sollte ein unterschiedliches Prinzip zu Grunde liegen. Da MDA eine C-H-azide Verbindung ist (pKs = 5,0) (Organikum 1976) und im Plasma nahezu vollständig dissoziiert als Carbanion vorliegt, sollte überprüft werden, ob die Alkylierung von MDA, z.B. mit Pentafluorbenzylbromid (PFB-Br) analog zur Messung von Nitrit als PFB-Derivat mittels GC/MS (Tsikas 2000), solch ein neuartiges Prinzip darstellen kann.