Herstellung kompetenter Zellen und Transformation

Um das Einschleusen von DNA in eine Bakterienzelle (Transformation) zu ermöglichen, gibt es mehrere experimentelle Ansätze. In den folgenden Abschnitten werden zwei, in dieser Arbeit angewandte, Möglichkeiten genauer beschrieben.

2.3.10.1 CaCl2-Methode

Eine Möglichkeit, um die DNA-Aufnahmebereitschaft von Zellen (Kompetenz) zu erhöhen ist die Vorbehandlung dieser mit zweiwertigen Kationen bei niedrigen Temperaturen. Der genaue Mechanismus dabei ist bis heute ungeklärt, und die Optimierung der Bedingungen dieser Methode ist auf empirische Experimente zurückzuführen [190].

Zur Herstellung kompetenter Zellen nach der CaCl₂-Methode [33] wurde eine 1:100 Verdün-nung einer Übernachtkultur (ÜNK) in 50 mL Medium (NI, LB) angesetzt und bei 130 rpm

und 37^◦C bis zu einer OD546nm von 0,4 bis 0,6 inkubiert. Die Bakteriensuspension wurde in ein, auf Eis vorgekühltes, Gefäÿ überführt und bei 5.500 rpm und 4^◦C für 5 min zentrifugiert.

Das Sediment wurde in 10-15 mL vorgekühlter 100 mM CaCl2-Lösung resuspendiert und 30 min auf Eis inkubiert. Nach erneuter Zentrifugation (5.500 rpm, 4^◦C, 5 min) wurde das Sediment in 1 mL 100 mM CaCl₂-Lösung resuspendiert und auf Eis im Kühlschrank gelagert.

Die Suspension hält sich auf Eis für mehrere Tage, wobei die Kompetenz ihr Maximum nach ca. 12-24 h erreicht [143]. Dies hängt allerdings vom verwendeten Bakterienstamm ab. Je nach Stamm wurden die kompetenten Zellen sofort für die Transformation eingesetzt oder erst nach 18-24 h.

2.3.10.2 Transformation nach Hanahan

Für die Transfomation nach Hanahan [69] wurden 80 µL der, mittels CaCl2-Methode herge-stellten, kompetenten Zellen mit 5-10 µL eines Ligationsansatzes oder 1-50 ng Plasmid-DNA vorsichtig gemischt und auf Eis für 30 min inkubiert. Hierbei kommt es zur Anlagerung der DNA an die Zytoplasmamembran.

Anschlieÿend wurden die Bakterien für 1-2 min einem Hitzeschock bei 42^◦C ausgesetzt.

Dieser Hitzeschock führt zu einer erhöhten Fluidität der Membran, wodurch die Aufnahme der DNA in die Zelle erleichtert wird.

Die Bakterienzellen wurden nochmals für 5 min auf Eis gestellt und dann in 1 mL Medium (NI, LB) überführt. Ohne Zugabe des Selektionsantibiotikums wurde diese Suspension für 1 h bei 130 rpm und 37^◦C geschüttelt. In dieser Regenerations-Phase kommt es zur Ausprägung der Plasmid-vermittelten Resistenz.

Abschlieÿend wurden 50 und 200µL der Bakteriensuspension auf Antibiotikum-haltigen Agar-platten ausplattiert und bei 37^◦C über Nacht bebrütet. Als Kontrolle dienten je nach Anwen-dung folgende Ansätze:

• 80 µL kompetente Zellen: Überprüfung der Lebensfähigkeit (kein Selektionsdruck)

• 80 µL kompetente Zellen + pBR322: Überprüfung der Kompetenz

• 80 µL kompetente Zellen + Plasmid geschnitten: Überprüfung der Vollständigkeit des Restriktionsverdaus

• 80 µL kompetente Zellen + Plasmid dephosphoryliert: Überprüfung der Phosphatase

• 80 µL kompetente Zellen + Plasmid dephosphoryliert und ligiert: Überprüfung der Phosphatase

• 80 µL kompetente Zellen + Plasmid geschnitten und ligiert: Überprüfung der Ligase

2.3 Molekularbiologische Methoden: DNA 2.3.10.3 Herstellung kompetenter Zellen mittels CaCl2-Methode zur

Lagerung

Bei Stämmen mit denen verschiedene Transformationen mittels CaCl2-Methode durchgeführt werden sollten, wurde die Durchführung der Herstellung kompetenter Zellen mittels CaCl₂ so abgewandelt, dass die Bakterienzellen bei -80^◦C lagerfähig waren und damit jeder Zeit eingesetzt werden konnten.

Dabei wurde die Kultur wie in Abschnitt 2.3.10.1 beschrieben inkubiert und nach Ernte für 10 min auf Eis gestellt. Durch Zentrifugation für 10 min bei 5.500 rpm und 4^◦C wurde sedi-mentiert, und das Sediment in 10 mL eiskaltem TFB1-Puer (Tab. 2.3) resuspendiert. Nach weiteren 10 min auf Eis wurde unter den gleichen Zentrifugationsbedingungen sedimentiert.

Dieses Sediment wurde in 2 mL eiskaltem TFB2-Puer (Tab. 2.3) resuspendiert, für 10 min auf Eis gestellt, abschlieÿend a´ 200 µL aliquotiert und bei -80^◦C gelagert. Kamen diese Bakterienzellen für Transformationen zum Einsatz, musste das Auftauen auf Eis erfolgen.

2.3.10.4 Herstellung kompetenter Zellen für die Elektroporation

Aus einer Übernachtkultur (ÜNK) wurde eine 1:100 Verdünnung in 50 mL Medium (NI, LB für E. coli, SOB für Salmonellen) hergestellt und bei 200 rpm und 37^◦C bis zu einer OD600nm

von 0,5 bis 0,7 geschüttelt. Die Zellsuspension wurde in ein sauberes Gefäÿ überführt und 30 min auf Eis gestellt. Durch Zentrifugation für 15 min bei 7.000 rpm und 4^◦C wurden die Bakterienzellen sedimentiert. Das Sediment wurde in 10 mL kaltem Wasser resuspendiert und unter den gleichen Zentrifugationsbedingungen erneut sedimentiert.

Dieser Waschschritt ist erforderlich, um die Bakterienzellen vollständig von anhaftenden Sal-zen zu befreien, die sich auf die Elektroporation störend auswirken könnten und wurde noch einmal mit 5 mL kaltem Wasser wiederholt.

Abschlieÿend wurde das Sediment in 500µL kaltem Wasser resuspendiert. Die kompetenten Bakterienzellen wurden auf Eis gelagert und direkt für die Elektroporation eingesetzt. Sollten die kompetenten Zellen für einen späteren Einsatz gelagert werden, musste bei der Durch-führung mit 10 % Glycerin anstelle von kaltem Wasser gearbeitet werden. Dabei wurde das Sediment abschlieÿend in 2 mL 10 % Glycerin resuspendiert, ´a 200 µL aliquotiert und bei -80^◦C eingefroren.

2.3.10.5 Elektroporation

Die Elektroporation ist ursprünglich für das Einschleusen von DNA in eukaryotische Zellen entwickelt [151], aber längst auch für die Transformation in Bakterienzellen optimiert worden [201].

Mittlerweile ist die Elektroporation das gebräuchlichste und ezienteste Transformationsver-fahren. Hierbei wird ausgenutzt, dass, durch kurzfristiges Anlegen einer elektrischen Spannung und Entstehung eines elektrischen Feldes, in der Membran eine erhöhte Permeabilität für Ma-kromoleküle induziert wird, so dass innerhalb des elektrischen Impulses DNA ins Zellinnere diundieren kann.

Für die Durchführung wurden 50 µL der für die Elektroporation hergestellten, kompetenten Zellen mit 1-50 ng DNA vorsichtig gemischt und 10 min auf Eis gestellt. Zu beachten war bei diesem Schritt, dass auch die DNA-Lösung möglichst keine bzw. nur eine geringe Salzkon-zentration aufwies (Abschnitt 2.3.6.3), da es sonst durch das Leiten des Stroms, zu einem Kurzschluss kommt.

Bei der Einstellung des Genepulsers wurden folgende Parameter gewählt: 2,5 kV/ 200 Ω/ 25 µF/ 3,5-4,5 ms. Der Transformationsansatz wurde in die Elektroporationsküvette über-führt und der Impuls gegeben. Schnellstmöglich wurde dieser Ansatz in 1 mL Medium (NI, LB für E. coli, SOC für Salmonellen) pipettiert und für 1 h bei 130 rpm und 37^◦C geschüttelt.

Die regenerierten, transformierten Bakterienzellen wurden wie in Abschnitt 2.3.10.2 auf Se-lektionsagarplatten ausplattiert. Es konnten die gleichen Kontrollen, wie unter Abschnitt 2.3.10.2 beschrieben, verwendet werden. Zusätzlich wurde die Überlebensquote der kompe-tenten Zellen nach Elektroporation durch Ausimpfen ohne Selektionsdruck kontrolliert.

Da Elektroporationsküvetten teuer sind, wurden diese nach Reinigung mehrfach (2-3x) ver-wendet. Gereinigt wurde, indem zunächst mit 0,1 N HCl-Lösung für 5 min inkubiert wurde.

Anschlieÿend wurde die Küvette mit 96 % Ethanol gewaschen. Nach Verwerfen und dem vollständigem Verdunsten des Ethanols wurden die Küvetten erneut eingesetzt.