Hefen - Entwicklung von Verfahren für die kontinuierliche, zielgerichtete Evolution von Protein

2.2 Methoden

2.2.2 Hefen

2.2.2.1 Bestimmung der optischen Dichte von Hefekulturen

Das Wachstum von S. cerevisiae in Flüssigkultur wurde photometrisch über die Zunahme der Absorption bei einer Wellenlänge von 600 nm verfolgt. Dabei entspricht eine OD600 = 1 einer Zelldichte von 2 x 10⁷Zellen/ml (Treco et al. 1993).

2.2.2.2 Kultivierung von Hefen in Flüssigmedium

10 ml Flüssigmedium wurde mit Hefeklonen von Agarplatten angeimpft und üN bei 30°C und 190 rpm geschüttelt (= Vorkultur). Nicht-transformierte Hefestämme wurden in YPDA-Vollmedium inkubiert. Bei Hefestämmen, die mit einem Plasmid (Plasmid-Prototrophiemarker TRP1, LEU2 oder HIS3) oder mit den beiden Y2H Plasmiden pGBKT7-BD-bait (Plasmidmarker TRP1) und pGADT7-AD-prey bzw.

pRS315-AD-prey (Plasmidmarker LEU2) transformiert wurden, wurde Minimalmedium verwendet, in dem die entsprechende Aminosäure die durch den/die Plasmidmarker kodiert ist, nicht enthalten war (Drop Out Medium DO Trp, DO Leu, DO His bzw. DO TrpLeu). Somit konnten in der Vorkultur alle Hefen wachsen, die ein oder zwei Plasmide aufgenommen hatten, ungeachtet ob Protein-Protein-Interaktion stattfindet oder nicht.

Die 20 ml Hauptkultur wurde mit einer Anfangs-OD600 =0,1 gestartet. Bei nicht-transformierten Hefestämmen wurde wiederum YPDA verwendet. Transformierte Hefestämme wurden entsprechend dem/den Plasmidmarker(n) in Drop Out Medium kultiviert. Bei Überprüfung der Y2H Interaktion wurde das Minimalmedium so gewählt, dass für das Wachstum nicht nur die Expression der Plasmid-kodierten Marker TRP1 und LEU2 notwendig war, sondern auch Reportergene des genomischen Y2H Systems aktiviert sein mussten. Beim Test auf Expression von HIS3 wurde Histidin-freies

Minimalmedium (DO TrpLeuHis) verwendet bzw. zur Erhöhung der Stringenz 3-Aminotriazol (3-AT) im millimolaren Bereich zugesetzt (z. B. DO TrpLeuHis/100 mM 3-AT). Beim Test auf Expression von Aur1-C wurde Aureobasidin A (AbA) im nanomolaren Bereich zugesetzt (z. B. DO TrpLeuHis/64 nM AbA). Sobald die Hauptkultur die stationäre Phase (OD600 > 3) erreichte, wurde sie erneut mit einer Anfangs-OD600 = 0,1 in frisches Medium überimpft.

2.2.2.3 Transformation mit PEG/LiAc

Die Transformation von Hefe wurde nach (Gietz et al. 2002) durchgeführt.

Eine Hefekolonie (ca. 0,5 cm im Durchmesser) wurde üN in 10 ml 2-fach konzentriertem YPDA-Medium bei 30°C und 190 rpm geschüttelt. Mit dieser Vorkultur wurden 50 ml 2-fach YPDA mit einer OD₆₀₀ = 0,5 angeimpft und für 3 - 5 h geschüttelt. Die Hefezellen der logarithmischen Wachstumsphase wurden durch Zentrifugation bei 3.000 g für 5 min geerntet, mit 20 ml Wasser und im Anschluss mit 1 ml gewaschen. Die gewaschenen Hefezellen (~ 10⁸) waren kompetent, um Plasmid-DNA aufzunehmen. Pro Transformationsansatz wurden 100 µl Zellen pelletiert und mit dem in Tab. 29 aufgeführten Transformationsmix resuspendiert. Der Transformationsansatz wurde kräftig gevortext, 40 min bei 42°C inkubiert und dann die t ransformierten Hefezellen abzentrifugiert, in Wasser aufgenommen und auf Selektionsplatten entsprechend den Plasmidmarkern bzw.

Y2H Selektionsmarkern ausplattiert. Die Transformationsplatten wurden 2 Tage bei 30°C inkubiert bzw. 3 Tage, wenn die Selektionsplatten 3-AT (3-Aminotriazol) oder AbA (Aureobasidin A) enthielten.

Einzelkolonien wurden auf neuen Agarplatten ausgestrichen und weitere 2 Tage bebrütet. Agarplatten wurden bis zu 4 Wochen bei RT oder 4°C gelagert.

Hefen können mit mehr als einem Plasmiden transformiert werden, entweder nacheinander oder gleichzeitig (Kotransformation). Die (Ko-)Transformationsrate wurde bestimmt aus der Anzahl an Kolonien auf den Selektionsplatten pro eingesetzter Gesamtzellzahl und pro µg DNA. Die Transformationsrate von Plasmid-DNA betrug in der Regel 10⁵, die Kotransformationsrate 10³. Die (Ko-)Transformanten wurden entsprechend ihrer Stammes und ihrer heterolog exprimierten Proteine bezeichnet. Beispiel: AH109-bait/prey bedeutet, AH109 wurde mit pGBKT7-bait und pGADT7-prey kotransformiert.

Tab. 29. Transformationsmix Komponente Volumen [µl]

50% PEG 3350 (w/v) 1 M LiAc

ssCarrier DNA (2 mg/ml) Plasmid (100 ng/µl) H2O

240 36 50 1 – 10 ad 360

2.2.2.4 Elektroporation von S. cerevisiae

Methode I – Herstellung von Spheroblasten nach Everett (1992)

15 ml einer logarithmisch wachsenden Hefekultur (OD600 < 2) wurden durch eine 10-minütige Zentrifugation bei 4.000 g geerntet, in 5 ml Spheroblastenpuffer A resuspendiert, mit 100 Units Lytikase versetzt und 10 – 30 min bei 30°C und schwachem sch ütteln (25 rpm) inkubiert, um die Zellwand anzudauen. Die so generierten Spheroblasten wurden durch 5-minütige Zentrifugation bei 400 g geerntet, zweimal mit 5 ml Spheroblastenpuffer A gewaschen und schließlich in 1 ml

Spheroblastenpuffer A aufgenommen. In 10 ml YPDA-Sorbitol Medium wurden die Spheroblasten bei 50 rpm für 90 min geschüttelt. Die regenerierten Spheroblasten wurden im Anschluss geerntet und zweimal mit 5 ml 1 M Sorbitol gewaschen, um jegliches Salz zu entfernen, das die Effizienz der Elektroporation beeinträchtigen würde. Schließlich wurden die Spheroblasten in 1 M Sorbitol zu einer Zellsuspension von 1 x 10⁸ Zellen/ml verdünnt. Die kompetenten Hefen wurden in 200 µl-Aliquots in vorgekühlten Elektroporationsküvetten (Spaltbreite 2 mm) mit bis zu 1 µg RNA bzw. DNA für 5 min inkubiert. Die Ansätze wurden bei 800 V, 21 µF, 1.000 Ohm und einer Zeitkonstante von 4,5 - 5 elektroporiert, mit 500 µl vorgewärmtem YPDA-Sorbitol in Reaktionsgefäße übertragen und 2 - 16 h bei 30°C regeneriert. Die Elektroporationsansätze w urden anschließend auf Agarplatten selektiert.

Methode II – nach Lundblad (1993)

50 ml einer logarithmisch wachsenden Hefekultur (OD600 ≤ 1,5) wurden durch Zentrifugation bei 4.000 g für 10 min bei 4°C geerntet. Das Zellpellet wurde in 8 ml gekühltem Wasser aufgenommen, mit 1 ml 10x TE und 1 ml 1 M Lithiumacetat versetzt und 45 min sowie nach Zugabe von 0,25 ml 1 M DTT weitere 15 min bei 30°C bei 90 rpm inkubiert. I m Anschluss wurden 40 ml eiskaltes Wasser zugegeben und die Zellen bei 4°C geerntet. Nach Was chen mit 25 ml eiskaltem Wasser und 2,5 ml eiskaltem 1 M Sorbitol wurden die Zellen schließlich in 50 µl 1 M Sorbitol aufgenommen, so dass eine 150 µl Suspension entstand. 40 µl der Zellsuspension wurden mit bis zu 1 µg RNA oder DNA gemischt, in Elektroporationsküvetten (Spaltbreite 2 mm) für 5 min in Eiswasser inkubiert und bei 5 kV, 25 µF und 200 Ohm und einer Zeitkonstante von 4,5 - 5 elektroporiert. Unmittelbar danach wurde 1 ml eiskaltes Sorbitol (1 M) zugegeben, die Ansätze in Reaktionsgefäße überführt und entweder direkt plattiert oder bis zu 8 h in Eiswasser gekühlt und im Anschluss auf Agarplatten selektiert.

2.2.2.5 Bestimmung der Wachstumsrate von Hefekulturen

Eine Hefekolonie wurde in 10 ml Medium üN bei 30°C und 190 rpm geschüttelt. Die Hauptkultur wurde mit einer OD600 von 0,1 in Selektivmedium gestartet und die Zelldichte über 24 bzw. 48 h bestimmt (2.2.2.1). Die Generationszeit der Hefekultur in der exponentiellen Phase errechnete sich gemäß folgender Gleichung:

N_t= N₀x 2^∆t

Wachstumsrate/h [%] = x 100g g =∆t x log2

∆logN N_t= N₀x 2^∆t

Wachstumsrate/h [%] = x 100g1 Wachstumsrate/h [%] = x 100g

g =∆t x log2

∆logN g =∆t x log2

∆logN

∆t x log2

∆logN

∆t x log2

∆logN

Die Wachstumsrate pro Stunde in Prozent ergibt sich aus dem Kehrwert der Generationszeit und besagt, um wie viel Prozent die Hefekultur pro Stunde an Masse zunimmt. Bei einer Generationszeit von 2 h beträgt die Wachstumsrate/h 50%.

N: Zellzahl, die sich aus der gemessenen OD600 ergibt t: Anzahl an Stunden, die die Kultur gewachsen ist g = Generationszeit: Zeit, die Hefezelle für eine Ver- doppelung braucht

2.2.2.6 Lagerung von Hefekulturen

Ausstriche von S. cerevisiae auf Agarplatten wurden max. 4 Wochen bei RT oder 4°C gelagert. Zur langfristigen Aufbewahrung wurden Glycerinkulturen angelegt. Dafür wurden Übernachtkulturen (in YPDA oder Minimalmedium) mit sterilem Glycerin versetzt (25% Endkonz.) und bei -80°C gelagert.

2.2.2.7 Kurieren von Plasmiden

Hefen verloren ihre Plasmide, wenn sie mind. 30 Generationen lang in Vollmedium kultiviert wurden.

Ein Aliquot der Flüssigkultur wurde auf YPDA ausplattiert, um Einzelkolonien zu erhalten.

Einzelkolonien wurden auf Selektivplatten ausgestrichen; die Aminosäure, die durch den/die Plasmidmarker codiert wurde, fehlte in dem Minimalmedium. Kolonien, die auf Minimalmedium nicht anwuchsen, waren von dem/den Plasmid(en) kuriert und wurden ausgehend von der YPDA-Platte weiter verwendet.

2.2.2.8 Plasmidisolation aus S. cerevisiae

Zwischen 10³ und 10⁹ Hefezellen wurden für die Plasmidisolation benutzt. Diese wurde mithilfe des QIAprep Spin Miniprep Kits (Qiagen) und nach Vorgaben von Singh et al. (2002) durchgeführt. Das Hefepellet wurde in 200 µl P1 Puffer resuspendiert, mit 50 µl Lytikase (1.000 Units) versetzt und zum Andauen der Zellwand 45 min bei 37°C inkubiert. Dur ch Zugabe von 250 µl P2 Puffer und 10-minütiger Inkubation bei RT wurden die Hefezellen lysiert. Durch Zugabe von 700 ml N3 wurde der Ansatz neutralisiert und die Zelltrümmer im Anschluss bei 14.000 g 10 min abzentrifugiert. Der Überstand wurde auf DNA-bindende Silikasäulchen geben, mit 500 µl PB gespült und mit 750 µl PE gewaschen, 2 min trocken zentrifugiert und schließlich mit 50 µl Wasser eluiert.

2.2.2.9 Genomische Integration bzw. Deletion

Zur Expression von einem heterologen Gen in Hefe wurde eine Expressionskassette bestehend aus Promotor, Terminator und dem Gen hergestellt. Zur ortsgerichteten Integration wurden integrative Vektoren (Tab. 3) benutzt, welche dem Genlokus entsprechende homologe Enden besitzen. Zur Selektion von Integranden wurden Expressionskassetten mit einem Antibiotikum-Resistenzgen (Antibiotikum^R-Gen) benutzt, die zusätzlich integriert wurden. In Abb. 5 ist schematisch eine Integration an den LEU2-Lokus dargestellt. Integranden können durch Selektion auf Agarplatten mit G418 auf die Expression von KanMX selektiert werden. Das Genom der Integranden wurde mittels PCR von Hefekolonien (cPCR, 2.2.3.1) mit sequenzspezifischen Primern und anschließender Sequenzierung der Amplifikate (2.2.3.9) auf die korrekte Integration hin überprüft.

Bei der genomischen Deletion wird eine Expressionskassette eines Antibiotikum^R-Gens über homologe Enden (am 5´ und 3´ Ende ca. 500 bp lang) an den entsprechenden Genlokus im Hefegenom integriert. Dadurch wurde der ORF des Zielgens komplett deletiert. Integranden wurden durch Selektion auf Agarplatten mit dem entsprechenden Antibiotikum selektiert und die ortsspezifische Deletion ebenso überprüft.