2.2 Methoden
2.2.3 DNA-Techniken
2.2.3.1 Amplifikation von Nukleinsäuren
Die polymerase chain reaction (PCR) ermöglicht eine gezielte Amplifikation gewünschter DNA-Abschnitte (Mullis et al. 1986). Die Reaktionen wurden in sterilen, dünnwandigen 0,2 ml Reaktionsgefäße nach folgenden Schemata (Tab. 30 – 33) auf Eis pipettiert.
Für die Standard-PCR lag das template als Plasmid oder linear vor. Zur Amplifikation wurde die DNA-Polymerase PhusionTM High-Fidelity verwendet.
Bei PCR-Reaktionen direkt von Kolonien (cPCR) wurden 1 – 2 µl Zellmaterial mit Taq-Polymerasen amplifiziert. Für die Analyse von Bakterienkolonien wurde der PCR Master Mix (Promega) verwendet.
Die PCR-Analyse direkt von Hefekolonien wurde zur Überprüfung der genomischen Integration bzw.
Deletion genutzt bzw. zur Amplifikation hefeeigener IRES-Sequenzen aus AH109. Dafür wurde die KAPA2G™Robust Polymerase (PEQLAB) verwendet.
Tab. 30. Zusammensetzung einer Standard-PCR
Tab. 31. Zusammensetzung einer cPCR von Bakterienkolonien Komponente Endkonz.
PCR Master Mix (2x) 1x Primer forward/reverse 0,5 µM
Tab. 32. Zusammensetzung einer cPCR von Hefekolonien
Komponente Endkonz.
KAPA2G™Robust Puffer B (5x) 1x
dNTPs 0,2 mM
Primer forward/reverse 1,0 µM KAPA2G™Robust Polymerase 0,5 U/µl
Das Einfügen von Punktmutationen in Yes1 wurde mittels quick change PCR (qcPCR) generiert. Die Primer enthielten die gewünschten Nukleotidveränderungen.
Tab. 33. Zusammensetzung einer qcPCR
Tab. 34 zeigt die Amplifikations-Programme, die entsprechend den Polymerasen eingestellt wurden.
Die Elongationszeit wurde der Länge des zu amplifizierenden DNA-templates angepasst. Bis zur Weiterverarbeitung wurden die Proben bei 4°C gekühl t. Das Ergebnis der PCR-Amplifikation wurde durch Auftrag von 5 µl (analytisch) bzw. des ganzen Ansatzes (präparativ) auf ein Agarosegel und elektrophoretischer Auftrennung der Produkte überprüft.
Tab. 34. Programme der PCR-Reaktion im Thermocycler
Programmschritt PhusionTM Taq PfuUltraTM
Zeit
2.2.3.2 Enzymatische Spaltung von Nukleinsäuren
Enzymatische Spaltungen von DNA (bis zu 1 µg für analytische und bis zu 5 µg für präparative Ansätze) wurden in 30 - 50 µl Gesamtvolumen mit 1/10 Vol 10x Restriktionspuffer und
Restriktionsenzym zwischen 5 - 10 Units/µg DNA für 1 - 8 h durchgeführt. Die Wahl des Puffers sowie der Inkubationstemperatur erfolgte nach Angaben des Herstellers. Nach Restriktion wurde der Reaktionsansatz mittels Gelelektrophorese analysiert.
2.2.3.3 Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten
Zur Vermeidung falsch-positiver Kolonien bei der E. coli-Transformation bedingt durch Rezirkularisierung von linearisierten Vektoren in der Ligationsreaktion, wurden die 5´ Phosphatgruppen entfernt. Dazu wurden Vektoren nach der Restriktion mit 5 U/µg calf intestinal phosphatase (CIP) 30 min bei 37°C inkubiert.
2.2.3.4 Ligation von DNA-Fragmenten
Durch eine Ligationsreaktion wurden zu klonierende DNA-Fragmente und Vektor-DNA mit T4 DNA Ligase kovalent verknüpft. Dazu wurden 50 ng Vektor und Insert im 3-fachen molaren Überschuss eingesetzt. Die Ligation von Fragmenten mit überhängenden Enden wurde 2 h bei RT und die von stumpfen Enden üN in Eiswasser durchgeführt. Vor der Transformation von E. coli wurde der Reaktionsansatz 10 min bei 65°C inaktiviert.
2.2.3.5 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
Die RNA- und DNA-Konzentration wurde entweder anhand eines Agarosegels im Vergleich zum Größenstandard abgeschätzt oder photometrisch bestimmt. Eine OD260 = 1 entspricht einer Konzentration von 50 µg/ml doppelsträngiger DNA bzw. 40 µg/ml einzelsträngiger DNA oder RNA (Sambrook et al. 2001). Der Quotient DO260/OD280 diente als Maß für die Reinheit der Nukleinsäurelösung. Reine DNA besitzt einen Quotient A260/A280 von 1,8 – 2,0; bei reiner RNA liegt er zwischen 1,9 – 2,1.
2.2.3.6 Agarose-Gelelektrophorese
DNA- und RNA-Fragmente (100 bp bis 17 kb) wurden zur analytischen Größenbestimmung bzw. für präparative Zwecke auf 0,8 - 1%igen Agarosegelen in 0,5x TBE-Puffer elektrophoretisch aufgetrennt.
Zur Sichtbarmachung der Nukleinsäuren wurde der Agarosegellösung 0,5 µg/ml EtBr und als Schutz der DNA vor UV-Schäden 30 µg/ml Guanosin zugesetzt. Die aufzutrennenden Proben wurden mit 10x Gelauftragspuffer versetzt. Die Gele wurden bei 8 - 10 V/cm Abstand Kathode/Anode an das Spannungsgerät angeschlossen. Die Proben sowie ein DNA-Standard wurden in 30 - 120 min elektrophoretisch aufgetrennt. DNA wurde mittels UV-Licht detektiert und mithilfe einer Gel-dokumentationsanlage aufgezeichnet.
2.2.3.7 Aufreinigung von DNA-Fragmenten
Die Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Lösung bzw. aus Agarosegelblöckchen wurde mit dem MinElute PCR Purification Kit nach Angaben des Herstellers durchgeführt und mit EB-Puffer eluiert.
2.2.3.8 Aufreinigung von cPCRs im 96 well-Format
Die DNA-Aufreinigung von cPCRs aus Bakterienkolonien erfolgte über Aufreinigungsplatten im 96 well Format nach Angaben des Herstellers. Die Proben wurden in 50 µl EB-Puffer eluiert und anschließend sequenziert.
2.2.3.9 DNA-Sequenzanalyse
Sequenzreaktionen für die Auftrennung mit einem Kapillar-sequencer wurden nach Herstellerangaben durchgeführt. Die Methode beruht auf der Kettenabbruchmethode (Sanger et al. 1977), wobei hier fluoreszenzmarkierte Didesoxynukleotide zum Einsatz kamen. Die Sequenzen wurden mit der Software SeqManTMII ausgewertet. Homologievergleiche (BLASTX, BLASTN) (Altschul et al. 1997) und Datenbankrecherchen erfolgten über die Internetseiten des NCBI (National Center for Biotechnology Information; http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
2.2.3.10 Einstellung der Verunreinigung von Oligonukleotiden
Dirty bottle-Oligonukleotide wurden von der Firma ELLA bezogen. In Tab. 35 sind die theoretischen AS-Verteilungen dargestellt, die sich theoretisch durch den Grad der eingestellten Verunreinigung ergaben.
Tab. 35. Theoretische AS-Verteilung in den beiden dirty bottle-Oligonukleotiden.
A. Yes1-weak_dirty (5%). B. Yes1-mut_dirty (8,5%). Die Yes1-wt-AS stellt die höchste Wahrscheinlichkeit dar und ist rot markiert. Wahrscheinlichkeiten < 1% sind hellgrau markiert. # gibt Wahrscheinlichkeit für ein Stopp-Codon an.
A
B
Codon AS
Codon AS
A A
B
Codon AS Codon AS
Codon AS
Codon AS
Bei Yes1-weak_dirty wurden pro Nukleotid 5% Verunreinigung eingestellt, so dass durchschnittlich pro Codon 85% wt erhalten blieb bzw. 15% nicht-wildtypisch sein sollen. Für das ganze Oligonukleotid (30 degenerierte Positionen) ergaben sich durchschnittlich 4,5 Nukleotid-Austausche. Da 25% der Austausche still sind, wird eine AS-Substitution von durchschnittlich 3,4 pro Oligonukleotid erwartet.
Bei Yes1-mut_dirty wurden die Einzelnukleotide zu 8,5% verunreinigt, wodurch 75% wildtypisch bzw.
25% nicht-wildtypische Codons entstehen sollten. Im ganzen Oligonukleotid (6 degenerierte Positionen) wurden somit durchschnittlich 4,6 Nukleotide ausgetauscht. Unter Berücksichtigung der stillen Austausche ergab sich im Mittel ein AS-Austausch von 3,4.