Generierung von lox-Rezipienten in C. reinhardtii

Für die Generierung einer lox-Erkennungsequenz im C. reinhardtii-Genom wurden verschiedene Positionen in der nichtkodierenden Sequenz des RBCS2-Gens als Ort für die Insertion der lox-Sequenz getestet. Neben der Wildtypsequenz loxP wurden parallel die mutierten lox-Sequenzen loxGA und loxAC untersucht (siehe Abb. 4.1-a). Zum einen wurde die lox-Sequenz in die 5´-UTR und zum anderen im Intron1 des RBCS2-Gens integriert.

Abb. 4.1-a Integration der lox-Sequenz in der nichtkodierenden Sequenz des RBCS2-Gens. A) Wildtypsequenz loxP sowie mutierte lox-Sequenzen loxGA und loxAC (Basensubstitutionen sind farbig hinterlegt). B) Expressionskassette dargestellt für loxP-Sequenz an Position +21 „downstream“ vom Transkriptionsstart (+1) des RBCS2-Promotors. Darunter ist die mögliche „stem-loop“-Struktur in der mRNA dargestellt. C) loxP-Sequenz bei Position +81 „downstream“ vom Transkriptionsstart (+1) im RBCS2-Intron1.

Darunter ist die resultierende mRNA ohne „stem-loop“-Struktur“ abgebildet. HSP-R-In = HSP70A/RBCS2-Tandempromotor mit Intron1, UTR = 3´-UTR des RBCS2-Gens, bla = Ampicillinresistenzgen, ble-crluc = ble-codonoptimiertes Luciferase-Fusionsgen.

loxP: ATAACTTCGTATA ATGTATGC TATACGAAGTTAT

„inverted repeat“ „inverted repeat“

loxGA: ATAACTTCGTATA ATGTGTAC TATACGAAGTTAT loxAC: ATAACTTCGTATA AAGTATCC TATACGAAGTTAT

mRNA

UTR

HSP R In ble crluc bla

+1 Start-ATG

+21

UTR

ble crluc bla

HSP R In

+1 +81 Start-ATG

mRNA

B)

C)

A)

Der mögliche Einfluss der lox-Sequenz auf die Genexpression wurde mit Hilfe des Fusionsgens ble-crluc überprüft. Als Kontrolle diente eine identische Expressionskassette ohne lox-Erkennungssequenz. Im Vergleich zum Kontrollvektor, der wie erwartet das Ble-rLuc-Fusionsprotein korrekt exprimierte und Zeozinresistenz sowie Luciferaseaktivität zeigte, konnten für die Plasmide mit der lox-Sequenz in der 5´-UTR des RBCS2-Gens keine zeozinresistenten Transformanten selektiert werden. Eine mögliche Ursache für die fehlende Expression des Fusionsgens ble-crluc könnte die Ausbildung einer „stem-loop“-Struktur infolge der „inverted repeat“-Sequenzen in der lox-Erkennungssequenz sein (siehe Abb. 4.1-a Teil B). Kozak hat gezeigt, dass Sekundärstrukturen in der 5´-UTR „upstream“ vom Translationsstart (Start-ATG) einen inhibierenden Einfluss auf die Initiation der Translation haben können (84). Liu et al. konnten durch die Einführung von Mutationen in die „inverted repeat“-Strukturen eine so genannte loxH-Sequenz generieren, welche im Vergleich zum Wildtyp loxP eine weniger stabile „stem-loop“-Struktur aufwies und so zu einer Verbesserung der Expression des Reportergens führte. Die Reduktion der Rekombinationseffizienz von über 75% schränkt aber die Verwendung dieser loxH als Erkennungssequenz deutlich ein (91).

Durch die Integration der lox-Sequenz in das Intron1 des RBCS2-Gens wird infolge des Spleißens die mögliche Sekundärstruktur eliminiert, und die Translation der mRNA kann somit ungehindert erfolgen (siehe Abb. 4.1-a Teil C). Es konnten für alle lox-Sequenzen (loxP, loxGA, loxAC) zeozinresistente Transformanten gewonnen werden. Aufgrund der korrekten Expression des Fusionsproteins Ble-rLuc wurde die lox-Erkennungsequenz für die Cre-Rekombinase in den folgenden Versuchen standardmäßig im Intron1 des HSP-R-In-Tandempromotors integriert.

lox-Rezipienten zur Überprüfung der Cre-Rekombinaseaktivität

Um die Aktivität der Cre-Rekombinase in C. reinhardtii überprüfen zu können, wurde ein geeigneter Rekombinationsassay etabliert, welcher sowohl die Detektion des nichtrekombinierten Ausgangszustandes als auch die eines erfolgreichen Rekombinationsereignisses zuließ. Dafür wurde zusätzlich zu der ble-crluc-Kassette mit der lox-Sequenz im Intron1 ein zweiter Selektionsmarker eingeführt, das promotorlose aphVIII-Gen für die Resistenz gegen Paromomyzin. Dieses zweite Resistenzgen wurde mit einer zweiten identischen lox-Sequenz in gleicher Orientierung und einem Teil des Intron1

„downstream“ der 3´-UTR der ble-crluc-Expressionskassette gesetzt. Die resultierenden lox-Expressionsvektoren pCR-2loxP-Aph, pCR-2loxGA-Aph und pCR-2loxAC-Aph wurden vor

ihrer Verwendung in C. reinhardtii erfolgreich sowohl in vitro als auch in vivo in E. coli auf ihre Rekombinierbarkeit überprüft.

Für die Transformation des Chlamydomonas-Genoms zur Integration der lox-Vektoren wurde zu Beginn der Arbeit der Stamm cw15Arg^-A verwendet, da dieser neben der Verwendung der Resistenzmarker (ble, aphVIII) auch den Auxotrophiemarker ARG7.8 zur Selektion für Folge-Transformationen ermöglicht. Die Selektion auf Zeozin führte aber in diesem Stamm nur zu wenigen zeozinresistenten lox-Transformanten. Dieser Effekt konnte auch in späteren Versuchen bei weiteren Konstrukten mit dem ble-Gen als Selektionsmarker beobachtet werden. Eine mögliche Erklärung für die niedrige Transformationseffizienz kann die mutagene Wirkung des Antibiotikums Zeozin sein, welches Doppelstrangbrüche in der DNA verursacht (121). Der zellwandlose und argininauxotrophe cw15Arg^-A-Stamm weist möglicherweise zusätzliche Defekte im DNA-Reparaturmechanismus auf, was zu einer verringerten Toleranz gegenüber Zeozin führen würde. Es konnte aber je eine Transformante für die Integration der loxP-, loxGA- und loxAC-Expressionsvektoren mit Hilfe von PCR-Reaktionen und Southern Blot-Analysen identifiziert werden, welche nachfolgend zur Überprüfung der Cre-Rekombinaseaktivität verwendet wurden.

Die Wiederholung der Transformation im argininauxotrophen Chlamydomonas-Stamm cw15⁺ führte dagegen zu einer deutlichen Erhöhung zeozinresistenter Transformanten und ermöglichte somit eine bessere Auswahl potentieller lox-Rezipienten. Trotz der höheren Anzahl an Transformanten konnten nur zwei cw15⁺-2loxP-APH-Klone gefunden werden, welche die Expressionskassette nur einmal und vollständig integriert aufwiesen und für die Cre-vermittelte Rekombination als Teststamm zur Verfügung standen. Bei allen weiteren bisher untersuchten Kulturen (mit loxP-, loxGA- bzw. loxAC-Expressionskassette) handelte es sich um Klone mit Mehrfachinsertionen, die eine spätere Analyse bezüglich ihrer Rekombination erschweren würden. Zudem hat sich gezeigt, dass Transformanten, die die Expressionskassette mehrfach enthalten, das Fusionsgen ble-crluc nach längerer Kultivierung ohne Selektionsdruck infolge von Silencingmechanismen stilllegen (17), und somit eine Analyse bezüglich des Phänotyps (Zeozinresistenz, Luciferaseaktivität, Paromomyzinresistenz) unmöglich machen. Bis zum Ende der Arbeit konnten für die loxAC- und die loxGA-Erkennungssequenz keine geeigneten Teststämme generiert werden. Die anfängliche Analyse durch überlappende PCR-Reaktionen hat sich als nicht ausreichend herausgestellt. Die Untersuchung von weiteren möglichen Rezipienten ist in Bearbeitung.