Expression von Cre-Fusionsproteinen in E. coli

Vor der eigentlichen Verwendung des GFP-Cre-Fusionsproteins in den Algen wurde dessen Rekombinaseaktivität in vitro und in vivo in E. coli untersucht. Parallel zum GFP-Cre-Protein wurde ein weiteres Fusionsprotein, Ble-Cre, überprüft. Sollte die Einführung des aufgereinigten Cre-Proteins in seiner aktiven Form mittels Elektroporation nicht möglich sein, kann mit Hilfe eines ble-cre-Expressionsvektors die Isolierung cre-exprimierender Transformanten in C. reinhartdii unter Selektionsdruck auf Zeozin erfolgen. Das Ble-Protein fungiert dabei zusätzlich als Kernlokalisierungssignal (14), da das Ble-Cre-Fusionsprotein mit einem Molekulargewicht von 53kDa zu groß für eine passive Diffusion durch die Kernmembran ist (162). Das GFP-Cre-Protein (68kDa) wurde ebenfalls mit einer Kernlokalisierungssequenz (nls des großen SV40 T-Antigens) versehen. Die Verknüpfung der Cre-Rekombinase erfolgte für alle Fusionsproteine über den N-Terminus des Enzyms, die Aktivität der Cre sollte dadurch nicht beeinflusst werden (83). Am C-Terminus befand sich wiederum ein His6-Tag, der die spätere Aufreinigung durch Ni-NTA-Affinitätschromatographie ermöglichte. Alternativ wurde ein Abstandshalter („linker“ mit 14 Aminosäuren, L = GSNNGNASGNNSG) zwischen die beiden Proteine integriert, um mögliche sterische Hinderungen und damit eine verminderte Enzymaktivität zu minimieren.

Wie zuvor wurden alle Cre-Fusionsproteine mit dem pET-Vektor-System hergestellt (siehe Abb. 3.3-a Teil A). Das Fusionsprotein GFP-L-Cre wurde zusätzlich in einem veränderten pMAL-p2X-Vektor exprimiert (sieheAbb. 3.3-a Teil B).

Abb. 3.3-a Expressionsvektoren für Cre-Fusionsproteine. A) Alle Gene wurden in den Vektor pET16b (Fa.

Novagen) integriert. His6 = Hexahistidin-Tag, cre = Gen für Cre-Rekombinase, ble = Zeozinresistenzgen, cgfp = codonoptimiertes Gen für das Grün fluoreszierende Protein (GFP), L = „linker“, nls = Kernlokalisierungs-sequenz, PT7 = Promotor für T7-RNA-Polymerase und bla = Ampicillinresistenzgen. B) pMAL-p2X (Fa. NEB) mit His12 = Polyhistidin-Tag, Ptac = Hybridpromotor für E. coli eigene RNA Polymerase und neo = Kanamyzin-resistenzgen.

3.3.1 In vivo Rekombinationsassay für Cre-Fusionsproteine

Der in vivo Rekombinationsassay für die Cre-Fusionsproteine wurde in E. coli wie unter 3.1.2 beschrieben und mit den Expressionvektoren pET-BleCre, pET-BleLCre und pET-cGFPLCre (siehe Abb. 3.3-a Teil A) sowie dem leeren Kontrollvektor pET16b durchgeführt. Dafür wurde wiederum das pMM354/BstEII/PaeI-Fragment (siehe Abb. 3.1-f Teil A) mit dem 266bp großen loxP-X-loxP-Insert in die EcoRI-Schnittstelle des jeweiligen Expressionsvektors integriert und dann in E. coli DH5α transformiert. Wie unter 3.1.2 beschrieben, konnte bereits in den DH5α-Zellen in Abwesenheit der T7-RNA-Polymerase eine schwache Expression des Fremdgens stattfinden. Die Transformanten wurden mittels Kolonie-PCR (Oligonukleotide: PSPfw und aph1) auf die erfolgte Rekombination des loxP-X-loxP-Inserts untersucht, das erwartete PCR-Produkt von 454bp konnte bei allen cre-exprimierenden Vektoren erhalten werden (siehe Abb. 3.3-b Teil A). Es wurde jeweils von einer positiven Transformante die Plasmid-DNA isoliert und mittels Restriktionsverdau analysiert und sequenziert. Die Rekombination des loxP-X-loxP-Inserts fand in den Expressionvektoren pET-Cre-loxP-X-loxP sowie pET-BleCre-loxP-X-loxP, pET-BleLCre-loxP-X-loxP und pET-cGFPLCre-pET-BleLCre-loxP-X-loxP erfolgreich statt. Die Rekombinaseaktivität der Fusionsproteine Ble-Cre, Ble-L-Cre und GFP-L-Cre wurde durch die Verlängerung am N-Terminus der Cre, wie erwartet, nicht gestört. Die Aktivität des Ble- und des GFP-Anteils des jeweiligen Fusionsproteins wurde im Expressionsstamm E. coli ER2566 überprüft, da die Expressionsrate unter IPTG-Induktion in diesem Stamm wesentlich höher ist. Bakterien,

His6 bla

transformiert mit den Vektoren pET-BleCre-loxP-X-loxP sowie pET-BleLCre-loxP-X-loxP, wurden dazu auf LBZXI-Platten bzw. mit pET-cGFPLCre-loxP-X-loxP transformierte, auf LBAXI-Platten selektiert. Zeozinresistente Transformanten konnten sowohl für Ble-Cre als auch für Ble-L-Cre erhalten werden. Die Fluoreszenz des GFP in GFP-L-Cre-exprimierenden ER2566-Transformanten konnte ebenfalls schwach unter dem UV-Licht beobachtet werden (siehe Abb. 3.3-b Teil B) Spur 2). Die Aktivität der beiden Proteinanteile (Ble und GFP) ist durch deren Fusion also nicht beeinträchtigt.

Abb. 3.3-b In vivo Rekombinationsassay für Cre-Fusionsproteine. A) Kolonie-PCR von E. coli mit den jeweiligen Plasmiden: Spur 0) DNA-Molekulargewichtsstandard, 1) pET-loxP-X-loxP, 2) pET-BleCre-loxP, 3) pET-BleLCre-loxP und 4) pET-GFPLCre-loxP. B) Fluoreszenzüberprüfung von Bakterien mit GFP-L-Cre:

Spur) 1 Kontrolle: pET-loxP-X-loxP und 2) pET-GFPLCre-loxP.

3.3.2 Expression und Reinigung der Cre-Fusionsproteine

Mit Hilfe des in vivo Rekombinationsassays konnte die Rekombinaseaktivität der Fusionsproteine Ble-Cre, Ble-L-Cre und GFP-L-Cre nachgewiesen werden. Um die in vitro Aktivität der aufgereinigten Cre-Fusionsproteine zu überprüfen, wurden die Expressionsvektoren pET-BleCre, pET-BleLCre und pET-cGFPLCre (Abb. 3.3-a Teil A) in den Expressionsstamm E. coli ER2566 transformiert. Die Expression, Zelllyse und Aufreinigung der Cre-Fusionsproteine erfolgte genau wie für die Cre-Expression, siehe 3.2.1.

Der Verlauf ist schematisch in Abb. 3.3-c dargestellt. Die Fusionsproteine Ble-Cre und Ble-L-Cre konnten erfolgreich in E. coli ER2566 exprimiert und mit der Ni-NTA-Affinitätschromatographie angereichert werden (nicht dargestellt). Bei der Dialyse kam es ,ähnlich wie bei der Cre, jedoch zur Präzipitation von einem Teil des Fusionsproteins.

Bei der Expression von GFP-L-Cre im pET16b-Vektor konnte nur eine geringe Ausbeute erzielt werden. Die SDS-PAGE zeigte, dass sich der Hauptteil des GFP-L-Cre nach der Zelllyse im „inclusion body“ befand (nicht gezeigt). Die Analyse unter UV-Licht zeigte ebenfalls nur eine schwache Fluoreszenz des Kulturüberstandes und eine starke Fluoreszenz im unlöslichen Zellpellet. Für die spätere Integration in C. reinhartdtii wurde das Protein aber unbedingt in seiner aktiven löslichen Form benötigt. Daher wurde alternativ das Plasmid

bp 0 1 2 3 4 bp

1264 2323 3675 8453

702 720

454

A)

B)

pcGFPLCre (ein abgewandelter pMAL-p2X-Vektor von Dr. M. Fuhrmann, Abb. 3.3-a Teil B) für die Expression von GFP-L-Cre in E. coli DH5α verwendet. Die Synthese des Proteins erfolgt in diesem Stamm langsamer und die Ausbeute des löslichen Proteinanteils war dadurch höher (SDS-PAGE nicht dargestellt). Die Zelllyse und die Aufreinigung erfolgten wie für pET-cGFPLCre (siehe Abb. 3.3-c). Beim Entsalzen mittels Dialyse ist jedoch, wie zuvor bei den Proteinen Cre, Ble-Cre, Ble-L-Cre, beim Pufferwechsel ein Teil des Proteins ausgefallen.

Abb. 3.3-c Schema der Expression und Reinigung der verschiedenen Cre-Fusionsproteine.

in DH5αααα

pET-BleCre pET-BleLCre pET-cGFPLCre pcGFPLCre

Kultivierung und IPTG-Induktion in E. coli ER2566

Aufreinigung mit Ni-NTA-Affinitätschromatographie mittels His6-Tag Ernte und Lyse der Zellen/ Überprüfung mit SDS-PAGE auf Expression

Ble-Cre löslich!

Ble-L-Cre löslich!

GFP-L-Cre löslich!

GFP-L-Cre unlöslich!

Dialyse gegen 200mM NaCl, 50mM Na-Phospatpuffer pH=8,0

Aufkonzentrierung durch Ultrafiltration, Lagerung mit 2mM DTT und 40% Glyzerin bei -20°C

Separation des löslichen Dialysats vom Präzipitat durch Zentrifugation

3.3.3 Aktivitätstest der aufgereinigten Cre-Fusionsproteine In E. coli

Die in vitro Aktivität der aufgereinigten Fusionsproteine Ble-Cre, Ble-L-Cre und GFP-L-Cre wurde wiederum mit einem in vitro Rekombinationsassay überprüft. Als Positivkontrolle diente die kommerziell erhältliche Rekombinase von NEB. Für keines der Cre-Fusionsproteine konnte jedoch eine Rekombination der lox-Plasmide pPICZ-E und pUni-solo nachgewiesen werden (nicht gezeigt). Dagegen wurden für die kommerzielle Cre-Rekombinase infolge der Fusion beider lox-Plasmide kanamyzinresistente Transformanten in E. coli DH5α-Zellen selektiert.

Da aber die Aktivität der Cre-Rekombinase der Fusionsproteine Ble-Cre, Ble-L-Cre und GFP-L-Cre mit Hilfe des in vivo Rekombinationsassays prinzipiell bestätigt wurde, müssen ,wie auch für die FITC-markierte Cre-Rekombinase, andere Ursachen für die fehlende Rekombinaseaktivität verantwortlich sein (z.B. fehlerhafte Lagerung, zu geringe Proteinkonzentration, ungeeignete Rekombinationsbedingungen).

Die aufgereinigten Fusionsproteine Ble-Cre und Ble-L-Cre wurden in späteren Versuchen als Kontrolle im Western Blot für die ble-cre-Expression in C. reinhardtii verwendet.

In C. reinhardtii

Trotz des bisher fehlenden Nachweises für die in vitro Rekombinaseaktivität für das Fusionsprotein GFP-L-Cre wurde das Protein mit Hilfe der Elektroporation in den lox-Stamm cw15Arg^-A-2loxGA-APH integriert (wie bereits für die FITC-markierte Cre-Rekombinase beschrieben, siehe Abb. 3.2-d). Als Negativkontrolle diente der untransformierte Stamm cw15Arg^-A. Ähnlich wie für die FITC-Cre-Rekombinase lag auch das GFP-L-Cre-Protein überwiegend aggregiert im Medium und nicht im Zellkern der Alge vor. Auch nach Transfer der Algen auf TAP-Platten mit Paromomyzin konnten für den lox-Stamm cw15Arg^-A 2loxP-APH keine paromomyzinresistenten Transformanten erhalten werden. Das Experiment wurde dreimal mit demselben Ergebnis wiederholt.

Weder für die FITC-markierte Cre-Rekombinase noch für das GFP-L-Cre-Fusionsprotein konnte mit Hilfe der Elektroporation das Protein in seiner aktiven Form in die Algenzellen eingeschleust werden, in keinem der lox-Rezipienten war eine Cre-vermittelte Rekombination nachweisbar.