Generierung chimärer IgGE1 und IgGE2 Antikörper‑Konstrukte

Die schwere Kette IgGC^H1hinge wurde mit den Oligonukleotiden IgG Xho for und IgG CH1  hinge back,  die  schwere Kette  IgG¹C^H1‑2  mit  den Oligonukleotiden IgG  Xho  for  und IgG1  CH2back amplifiziert. Die Banden wiesen eine erwartete Größe von ca. 350 bp (IgG¹C^H1‑

hinge) und ca. 700 bp (IgG¹C^H1‑2) auf.  

Die schwere Kette IgEC^H2‑4 wurde mit den Oligonukleotiden IgE CH2 for und IgE sfi 5x  his rev, die schwere Kette IgEC^H3‑4 mit den Oligonukleotiden IgE CH3 for und IgE sfi 5x his  rev amplifiziert. Die Banden wiesen eine erwartete Größe von ca. 950 bp (IgEC^H2‑4) und  ca.  700  bp  (IgEC^H3‑4)  auf.  In  Abb.  23A  sind  die  Amplifikate  der  einzelnen  Ketten  auf  einem analytischen 1.5% Agarosegel gezeigt.  

Abb. 23: Gelelektrophoretische Analyse der PCR zur Amplifikation der schweren Ketten der Isotypen G  und  E  und  der  generierten  IgGE1  und  IgGE2  schweren  Ketten.  Die  Analyse  erfolgte  auf  einem  analytischen 1.5%igen  Agarosegel  mittels  Ethidiumbromidfärbung.  (A)  Bahn 1:  Marker  16 ‑DNA/Eco130I,  Bahn  2:  IgG¹C^H1‑2  ,  Bahn  3:  IgG¹C^H1‑hinge,  Bahn  4:  IgEC^H2‑4,  Bahn 5: IgEC^H3‑4,  (B)  Bahn 1:  Marker  16 

‑DNA/Eco130I, Bahn 2: IgGE1 , Bahn 3: IgGE2.^. 

Nun  sollten  die  schweren  Ketten  der  IgE  und  IgG¹  Regionen  hybridisiert  werden.  Bei  einer  Hybridisierungsreaktion  müssen  die  Amplifikate  in  einem  Verhältnis  von  1 : 1  eingesetzt  werden.  Hierfür  wurden  die  gereinigten  Amplifikate  auf  ein  1.5%iges Agarosegel aufgetragen und gelektrophoretisch getrennt (Abb. 23).  

Für die Hybridisierungsreaktion des IgGE1 Antikörper‑Konstruktes wurden als Edukte  IgG¹C^H1‑hinge  und  IgEC^H2‑4  äquivalent  eingesetzt  und  nach  fünf  Zyklen  wurden  die  Oligonukleotide IgG  Xho  for  und IgE  sfi  5x  his  rev  hinzugegeben,  eine  PCR  unter  Standardbedingungen durchgeführt. 

Für die Hybridisierungsreaktion des IgGE2 Antikörper‑Konstruktes wurden als Edukte  IgG¹C^H1‑2 und IgEC^H3‑4 ebenfalls äquivalent eingesetzt und nach fünf Zyklen wurden die  Oligonukleotide IgG  Xho  for  und IgE  sfi  5x  his  rev  hinzugegeben  und  eine  PCR  unter  Standardbedingungen  durchgeführt.  In  Abb.  23B  sind  die  Amplifikate  der  Hybridisierungsprodukte IgGE1 und IgGE2 gezeigt.  

Anschließend  sollten  die  schweren  Ketten  IgGE1  und  IgGE2  in  den  Expressionsvektor  pBudCE4.1  eingebracht  werden.  Hierfür  wurde  der  Vektor  pBudCE4.1/IgG¹‑Anti ‑ Ves v 5 #1  verwendet.  Da  HEK293‑Zellen  schon  mit  diesem 

    ERGEBNISSE   

Vektor  transfiziert  wurden  und  die  stabil  exprimierenden  Zelllinien,  erfolgreich  den  Antikörper exprimierten.  

Der  Vektor  pBudCE4.1/IgG¹His‑Anti – Ves v 5 #1  und  die  Fragmente  IgGE1His  und  IgGE2His wurden mit den Restriktionsenzymen Sfi I und Xho I inkubiert. Die jeweiligen  Fragmente  wurden  mit  dem  Vektor  ligiert,  XL1blue‑Zellen  wurden  mit  den  Ligationsansätzen transformiert, auf TYE‑Zeo‑Platten ausgestrichen und über Nacht bei  37 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurden jeweils fünf Kolonien von den Platten mittels  PCR und den Oligonukleotiden IgE 688 for und IgE 1169 b überprüft und die Kolonien  über  Nacht  bei  37 °C  und  220 rpm  kultiviert.  Die  Plasmid  DNA  der  pBudCE4.1/IgGE1His‑Anti – Ves v 5 #1  und  pBudCE4.1/IgGE2His‑Anti – Ves v 5 #1  Antikörper‑Konstrukte  wurden  einer  Sequenzanalyse  unterworfen.  Nachdem  die  Antikörper‑Konstrukte  durch  Sequenzanalysen  auf  die  richtige  Insertion  der  schweren  Ketten  IgGE1  und  IgGE2  hin  überprüft  wurden,  standen  diese  für  die  Expression  in  Mammalia zur Verfügung. 

4.2.2.  Expression des Anti – Ves v 5‑IgGE1His #1 und des  Anti ‑ Ves v 5‑IgGE2His #1 Antikörper‑Konstruktes 

Die  Antikörper‑Konstrukte  sollten  anschließend  in  HEK293‑Zellen  exprimiert  werden. 

Hierfür  wurden  HEK293  ‑Zellen  mit  der  erhaltenen  DNA  unter  Verwendung  von  PEI  transfiziert¹¹⁸.  Nach  drei  Tagen  wurde  der  Kulturüberstand  abgenommen  und  eine  ELISA  Analyse  durchgeführt.  Die  Zellen  wurden  drei  Wochen  bis  zur  stabilen  Expression  der  Zelllinien  kultiviert.  Nach  einer  erneuten  ELISA  Analyse  (Abb.  24)  mit  Überständen  der  stabil  transfizierten  exprimierenden  Zelllinien  zur  Expression  der  Antikörper‑Konstrukte  wurden  die  Zellen,  deren  Antikörper  eine  deutliche  Reaktivität  gegenüber dem spezifischen Allergen aufwiesen, weiter kultiviert.  

Abb.  24:  ELISA  Analyse  zur  Überprüfung  der  stabilen  Expression  der  Anti – Ves v 5‑IgGE1His #1  und  Anti – Ves v 5‑IgGE2His #1  Antikörper‑Konstrukte. Die  Mikrotiterplatte  wurde  mit  je  50 μl (c = 50 μg/ml)  Allergen Ves v 5 über Nacht belegt, mit 10% FKS haltigem DMEM blockiert und mit 50 μl der Überstände  der stabilen Expression der insektengift‑spezifischen Antikörper‑Konstrukte der Isotypen IgGE1 und IgGE2  inkubiert. (A) Als sekundärer Antikörper diente das polyklonale Anti‑human‑IgG‑AP Konjugat (1 : 20000 in  10%  FKS  haltigem  DMEM).  Die  Detektion  erfolgte  bei  405 nm  mittels  AP‑Detektionslösung.  (B)  Als  sekundärer  Antikörper  diente  der  polyklonale  Anti‑human‑IgE  Antikörper  (1 : 20000  in  10%  FKS  haltigem  DMEM) und dieser wurde anschließend mit dem polyklonaen Anti‑goat‑IgG‑AP Konjugat (1 : 20000 in 10% 

FKS  haltigem  DMEM)  inkubiert.  Die  Detektion  erfolgte  bei  405 nm  mittels  AP‑Detektionslösung.  Als  Kontrolle wurde in beiden Fällen 10% FKS haltiges DMEM verwendet. 

Für das IgGE2‑Antikörper‑Konstrukt konnte mit dem humanen polyklonalen Anti‑IgG‑

AP Antikörper‑Konjugat eine erfolgreiche Expression nachgewiesen werden. Das IgGE1  Antikörper‑Konstrukt  konnte  leider  weder  mit  einem  polyklonalen  Anti‑human‑IgG  noch  mit  einem  Anti‑human‑IgE  detektiert  werden.  Anschließend  wurde  das  Anti‑

Ves v 5‑IgGE2His  Antikörper‑Konstrukt  auf  Rezeptorbindung  hin  untersucht.  Hierfür  stand  die  FcRI  Domäne  des  IgE  Rezeptors  (AviQuant),  der  mit  dem  IgY‑Fc‑Teil  fusioniert  wurde  und  im  Arbeitskreis  bereits  vorlag,  zur  Verfügung.  Das  Anti‑Ves v 5‑

IgGE2His  Antikörper‑Konstrukt  wurde  für  diese  Analyse  angereichert  und  durch  Dialyse die störenden Bestandteile des Überstandes entfernt.  

    ERGEBNISSE   

Abb. 25: ELISA Analyse zur Überprüfung der IgE Rezeptorbindung des in HEK293‑Zellen exprimierten  Anti – Ves v 5‑IgGE2His Antikörper‑Konstruktes. (A) Die Mikrotiterplatte wurde mit je 50 μl (c = 50 μg/ml)  AviQuant‑IgY pro Vertiefung über Nacht belegt, mit 10% FKS haltigem DMEM blockiert und mit 50 μl der  Überstände  der  stabilen  Expression  der  insektengift‑spezifischen  Antikörper‑Konstrukte  inkubiert.  Als  sekundärer Antikörper diente das polyklonale Anti‑human‑IgG‑AP Konjugat (1 : 20000 in 10% FKS haltigem  DMEM).  Die  Detektion  erfolgte  bei  405 nm  mittels  AP‑Detektionslösung.  Als  Kontrolle  wurde  10%  FKS  haltiges  DMEM  verwendet.  (B)  Die  Mikrotiterplatte  wurde  mit  je  50 μl  (c = 50 μg/ml)  Anti –  Ves v 5‑IgGE2His (GE2) bzw. AviQuant‑IgY pro Vertiefung über Nacht belegt und mit 5% MPBS blockiert. 

Anschließend wurden 50 μl AviQuant‑IgY bzw. 5% MPBS (‑) inkubiert. Als Detektionsantikörper diente das  polyklonale  Anti‑IgY‑AP  Konjugat  (IgY)  (1 : 5000  in  2% MPBS).  Die  Detektion  erfolgte  bei  405 nm  mittels  AP‑Detektionslösung. Als Kontrolle wurde 10% FKS haltiges DMEM verwendet. 

In  Abb.  25  kann  eine  deutliche  Reaktivität  des  Anti‑Ves v 5‑IgGE2His  Antikörper‑Konstruktes gezeigt werden, wodurch die Expression des IgEC^H3‑4 Domänen  der  schweren  Kette  nachgewiesen  werden  konnte.  Die  Expression  des  intakten  IgGE2  Antikörper‑Konstruktes  und  die  Bindung  der  Fc  Domänen  des  IgE  Isotyps  an  den  Rezeptor konnte hiermit gezeigt werden. Dies bedeutet, dass neben der Expression der  IgE  Domänen  ebenfalls  eine  korrekte  Faltung  und  somit  eine  funktionelle  Bindung  bestätigt werden konnte.   

4.3.  Darstellung einer avianen immunen Antikörper‑Bibliothek