Darstellung einer avianen Antikörper‑Bibliothek mit Hilfe der  Gateway™ Technologie

    ERGEBNISSE   

Abb.  31:  Sequenz‑Analyse  der  variablen  Regionen  der  pASG‑IBA102‑P005scFv‑p3  Klone.  (A)  der  schweren  Kette,  (B)  der  leichten  Kette.  Die  erhaltenen  Sequenzen  der  Klone  1 ‑ 5 wurden  einem Alignment  unterzogen und die CDR sind umrahmt.  

Nachdem  festgestellt  wurde,  dass  alle  sequenzierten  Kolonien  unterschiedliche  aviane  scFv  trugen,  wurden  die  Kolonien  von  den  Platten  geschabt  und  konnten  so  als  Ausgangsbibliothek für eine Selektion eingesetzt werden. 

4.3.4.  Darstellung einer avianen Antikörper‑Bibliothek mit Hilfe der 

Restriktion und Ligation sollte in einem weiteren System die Möglichkeit der Klonierung  einer scFv Bibliothek durch homologe Rekombination evaluiert werden. Hierfür wurde  die  Gateway™ Technologie,  die  auf  dem  Rekombinationssystem  des  lambda  Bakteriophagens  aus E. coli  basiert,  verwendet.  Für  den  Lebenszyklus  eines  lambda  Bakteriophagen  gibt  es  zwei  Möglichkeiten,  einmal  den  lytischen  Zyklus,  der  zur  Zerstörung der Wirtszelle führt und den lysogenen Zyklus, bei dem die orts‑spezifische  Integration  des  Phagen‑Genoms  in  das  Genom  der  Wirtszelle  stattfindet.  Durch  die  Replikation der Wirtszelle wird beim lysogenen Zyklus ebenfalls die DNA des Phagens  vermehrt,  zur  Freisetzung  entfernt  der  Phage  anschließend  seine  genetischen  Informationen  aus  dem  Genom  der  Wirtszelle  was  zur  lyse  der  Zelle  führt.  Dieser  Mechanismus der orts‑spezifischen Integration von genetischem Material kann auch für  die Klonierung genutzt werden, wobei spezifische Sequenzen (attachment sites) von 25 bp  an das zu klonierende Gen angefügt werden. Diese flankierenden Bereiche entsprechen  den sites  im  Bakteriophagen  und  werden  bei  den  folgenden  Reaktionen  spezifisch  gebunden,  geschnitten  und  wieder  kovalent  verknüpft.  Um  die  beiden  Zyklen  des  Bakteriophagen  nutzen  zu  können  werden  spezifische  Enzyme  verwendet.  Durch  Einsatz der ‑Integrase (Int) aus dem E. coli integration host factor (IHF) wird der lysogene  Zyklus nachgeahmt. Dies ist Bestandteil des BP Clonase Enzym Mixes. Der entstandene  Entry‑Vektor  wird  in  einer  weiteren  Reaktion  mit  einem  so  genannten  LR  Clonase  Enzym Mix, der eine ‑Int, IHF und ‑Excisionase (Xis) beinhaltet, versetzt. Die Vektoren,  die für die beiden Reaktionen verwendet werden, beinhalten das ccdB‑Gen. Dieses Gen  gilt als „Selbstmord‑Gen“, da es mit der E. coli Gyrase interagiert, diese inhibiert¹²³ und  somit  zur  Lyse  der  Zelle  führt.  Ein  grundlegender  Mechanismus  der  Gateway™ 

Technologie  basiert  auf  dem  toxischen  ccdB‑Gen  und  seinem  Antidot,  dem  ccdA‑Gen. 

Der  Destinationsvektor  pHEN2‑Dest‑ccdB‑CAT3.1  beinhaltet  neben  dem  bereits  erwähnten ccdB‑Gen ebenfalls eine Chloramphenicol‑Acetyl‑Transferase (CAT) Kassette  um  die  Insertion  der  scFv‑Fragmente  zu  ermöglichen  (Abb.  32).  Dieser  Vektor  lag  im  Arbeitskreis bereits vor¹²⁴. 

    ERGEBNISSE   

Abb. 32: Schematische Darstellung der homologen Rekombination der avianen wespengift‑spezifischen  Antikörper‑Bibliothek  mit  Hilfe  der Gateway™  Technologie.  Nachdem  die  flanierenden  Bereiche  (attachment  sites, att)  mittels  einer  PCR  angefügt  wurden,  wurde  das  Produkt  mittels  BP  Reaktion  in  den  Entry‑Vektor überführt. Anschließend wird der scFv mittels LR Reaktion in den Expressionsvektor kloniert. 

Die  unterschiedlichen attachment  sites  der  einzelnen  Reaktionen  sind  in  verschiedenen  Farben  dargestellt  und  flankieren  die  Bereiche  des  ccdB‑Gens  bzw.  der  scFv‑Fragmente.  Die  Abkürzungen  B,  P,  L  und  R  basieren auf dem Rekombinationssystem des Lambda Bakteriophagens aus E. coli. 

4.3.4.1. Amplifikation und Anfügen der attB sites des P005scFv  

Zur  Amplifikation  und  Anfügen  der  attB  Sites  der  P005scFv  wurden  von  der  Fusionsreaktion  pENTRY‑IBA20‑P005scFv  0.2 μl  entnommen,  da  diese  den  vollständigen  scFv  beinhaltet,  und  mit  den  Oligonukleotiden  Ch vH attB1 for  und  Ch vL attB2 back, welche die benötigten Sequenzen für attB sites trugen amplifiziert und  gereinigt.  Die  Konzentration  des  Amplifikates  wurde  sowohl  mittels  eines  NanoDrop ND‑1000  Gerätes  als  auch  densitometrisch  auf  einem  1%igen  Agarosegel  mittels Quantity  one®  (Bio‑Rad  laboratories  GmbH,  München)  bestimmt.  Die  avianen  scFv standen somit für die BP Reaktion zur Verfügung.  

4.3.4.2. BP Reaktion zur Generierung des Entry‑Vektors 

Nun  sollte  das  scFv  Fragment  in  den  Donorvektor  pDONR™201  mittels  homologer  Rekombination eingebracht werden. Hierfür wurde die Konzentration des Amplifikates  bestimmt,  welche  bei  11 ng/μl  lag.  Anschließend  wurde,  wie  im  Methodenteil 

beschrieben,  die  BP  Reaktion  durchgeführt.  Es wurden  TOP10  Zellen mit  der  Reaktion  transformiert, auf TYE‑Kan‑Platten ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert.  

Am  nächsten  Tag  wurden  die  Klone  ausgezählt,  die  Größe  der  Subbibliothek  betrug  2.7 x 10⁶  Transformanden.  Zehn  Kolonien  wurden  mittels  PCR  und  den  Oligonukleotiden  chicken  vh  for  und  chicken  vl  back  überprüft.  Sieben  von  zehn  analysierten  Kolonien  zeigten  eine  Bande  in  der  erwarteten  Höhe.  Zwei  positive  Kolonien  wurden  über  Nacht  bei  37 °C  und  220 rpm  kultiviert,  die  Plasmid  DNA  gereinigt  und  einer  Sequenzanalyse  unterworfen.  Die  sequenzierten  Kolonien  trugen  unterschiedliche aviane scFv. 

Die Kolonien wurden von den Platten geschabt und eine 100 ml 2YT‑Kan‑Kultur mit der  Zellsuspension der Subbibliothek bis zu einer OD^600nm von 0.1 inokuliert. Aus 10 ml der  100 ml  Kultur  wurde  die  Plasmid  DNA  gereinigt  und  anschließend  die  Konzentration  bestimmt.  Der Entry‑Vektor  pDonor‑P005scFv  stand  somit  für  die  LR  Reaktion  zur  Verfügung.  

4.3.4.3. LR Reaktion zur Generierung des Expressions‑Vektors 

Nachdem  die  Sequenzanalyse  auf  eine  erfolgreiche  Insertion  der  avianen  scFv  in  den  Donorvektor pDONR™201 hinwies, sollten die scFv Fragmente durch die LR Reaktion  in den Destinationsvektor überführt werden.  

Die  LR  Reaktion  wurde,  wie  im  Methodenteil  beschrieben,  mit  der  LR  Clonase  I  durchgeführt.  Es  wurden  TOP10  Zellen  mit  der  LR  Reaktion  transformiert,  die  Zellen  auf TYE‑Amp‑Platten ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert.  

Am  nächsten  Tag  wurden  die  Kolonien  ausgezählt,  die  Größe  der  Bibliothek  betrug  2 x 10⁶  Transformanden.  Es  wurden  zehn  Kolonien  mittels  PCR  und  den  Oligonukleotiden chicken vh for und chicken vl back überprüft. Alle analysierten Kolonien  zeigten  eine  Bande  in  der  erwarteten  Höhe.  Die  Kolonien  wurden  von  den  Platten  geschabt und eine 100 ml 2YT‑Amp‑Kultur mit der Zellsuspension der Subbibliothek bis  zu  einer  OD^600nm  von  0.1  inokuliert.  Aus  10 ml  der  100 ml  Kultur  wurde  die  Plasmid  DNA  gereinigt  und  anschließend  die  Konzentration  bestimmt.  Der  Destinationsvektor  pHEN‑Dest‑P005scFv  stand  somit  für  die  Transformation  in  F‑pilus  tragende 

    ERGEBNISSE   

Es  wurden  TG1  Zellen,  die  durch  ihren  F‑pilus  die  Fähigkeit  besitzen  von  Phagen  infiziert  werden  zu  können,  mit  dem  Vektor  transformiert,  auf  TYE‑Amp‑Platten  ausgestrichen  und  über  Nacht  bei  37 °C  inkubiert.  Am  nächsten  Tag  wurden  die  Kolonien ausgezählt, die Größe der Bibliothek betrug dabei 5 x 10⁶ Transformanden. Es  wurden  zehn  Kolonien  mittels  PCR  und  den  Oligonukleotiden lmb3  for  und fdseq  back  überprüft.  Sechs  von  zehn  Kolonien  zeigten  eine  Bande  in  der  erwarteten  Höhe.  Fünf  positive  Kolonien  wurden  über  Nacht  bei  37 °C  und  220 rpm  kultiviert,  die  Plasmid  DNA gereinigt und alle fünf Klone einer Sequenzanalyse unterworfen (Abb. 33). 

Abb.  33:  Sequenz‑Analyse variablen Regionen  der  pHEN‑Dest‑P005scFv  Klone. (A) der  schweren  Kette,  (B) der leichten Kette. Die erhaltenen Sequenzen der Klone (GW) 1 ‑ 5 wurden einem Alignment unterzogen  um  die  unterschiedlichen  CDR  besser  vergleichen  zu  können.  Die frameshifts  wurden  mit  einem  *  in  der  Aminosäuresequenz und sind dadurch in einem Leserahmen dargestellt.  

Es  konnte  gezeigt  werden,  dass  es  sich  bei  den  sequenzierten  Kolonien  um  unterschiedliche aviane scFv  handelt.  Drei  scFv wiesen  jedoch einen frameshift  auf.  Die  eigentliche  Bibliotheksgröße  entspricht  eher  der  Top10‑Transformation,  also  2 x 10⁶  da  nur  ca.  60%  der  aktuellen  Bibliothek  einen  avianen  scFv  tragen.  Die  Kolonien  wurden  anschließend von den Platten geschabt und konnten so als Bibliothek für eine Selektion  eingesetzt werden.