3. Methoden
3.1. Molekularbiologische Methoden
3.1.16. Bibliotheksklonierung
Die Darstellung der avianen insektengift‑spezifischen Bibliotheken erfolgt hinsichtlich der Isolierung der peripheren Lymphozyten, der mRNA, cDNA‑Synthese etc. nach etablierten Methoden. Ausgehend von der genspezifisch umgeschriebenen cDNA erfolgt die PCR unter Verwendung der AccuPrime Taq‑Polymerase. Die so entstandenen vH‑ und vL‑Fragmente dienten als Primäramplifikat der unterschiedlichen Klonierungen.
3.1.16.1. Klonierung mittels StarGate® combinatorial cloning system
Die StarGate® Technologie der Firma IBA (IBA GmbH, Göttingen) ermöglicht ein einfaches und schnelles Klonieren von mehreren Gen‑Sequenzen, so genannten GOI (gene of intrest), in Donor‑Vektoren und anschließendem fusionieren in einen so genannten Donor‑Fusionsvektor. Dieser dient als Ausgangsvektor zur Klonierung in verschiedene Akzeptorvektoren was das schnelle Klonieren in unterschiedliche Expressionsvektoren z.B. für Insektenzellen, Mammalia oder aber auch zur Expression von unterschiedlichen E. coli‑Konstrukten erleichtert.
Die StarGate® Technologie nutzt für die einfache Klonierung unterschiedliche Restriktionsenzyme des Types 2S, diese schneiden die DNA eine bestimmte Nukleotidanzahl nach den Erkennungssequenzen. Da diese Nukleotide nicht vorgegeben sind können dadurch spezifische Überhänge entstehen, die eine gerichtete Ligation in die einzelnen Vektoren ermöglichen. Ebenso wird durch ein Wechsel der Antibiotikum‑Resistenzen gewährleistet, dass nur die E. coli Kolonien überleben, die den richtigen Vektor tragen. Die Vektorkarten der verwendeten Vektoren sind im Anhang aufgeführt.
Amplifikation und Anfügen der Restriktionserkennungssequenzen:
Zur Amplifikation der variablen Regionen der leichten Kette und der schweren Kette müssen zunächst die Zyklenzahl der PCR und die einzusetzende DNA Menge analysiert werden, da durch geringere Zyklen die Diversität der variablen Regionen erhalten bleibt. Es werden ebenfalls je 5 μl der Primäramplifikate der variablen Regionen der leichten und der schweren Kette eingesetzt und durch eine PCR mit 10 Zyklen die Restriktionsenzymerkennungssequenzen angefügt. Die so entstanden Amplifikate werden über ein 1%iges Agarosegel gelelektrophoretisch getrennt, die Bande in der Richtigen Größe ausgeschnitten und mittels des GeneJET™ Gel Extraction Kit (Fermentas GmbH, St. Leon Rot) gereinigt.
Donor Reaktion:
Zur Klonierung der variablen Region der schweren Kette, die sich abschließend in der 5’
Region des Akzeptorvektors befinden soll wird der upstream Vektor pNFUSE‑IBA‑
LINK2 verwendet, die leichte Kette befindet sich im endgültigen Konstrukt downstream, hierfür wird der Vektor pCFUSE‑IBA1 verwendet.
Donorvektor pNFUSE/pCFUSE 10 μl vH oder vL Fragment (2 ng/μl) 12 μl
StarSolution F1 1.0 μl
StarSolution F2 1.0 μl
StarSolution F3 1.0 μl
Zu dem Fusionsvektor pNFUSE‑IBA‑LINK2 wird das gereinigte PCR Produkt der vH bzw. zu dem Fusionsvektor pCFUSE‑IBA1 wird das gereinigte PCR Produkt der vL gegeben und die Reaktionen werden mit den StarSolution F1, F2 und F3 versehen, diese beinhalten neben einem geeigneten Puffer ebenfalls die Ligase und das entsprechende Restriktionsenzym. Die Reaktion wird 1 h bei 30 °C inkubiert anschließend wird das Produkt bei 4 °C über Nacht gelagert.
METHODEN
Am nächsten Tag werden die kompetenten E. coli Zellen z.B. TB1 oder XL1blue, die ein blau‑weiss‑screening ermöglichen, mit den Ligationen transformiert und auf TYE‑Amp‑
IPTG‑X‑Gal‑Platten ausgestrichen und bei 37 °C über Nacht inkubiert.
Fusionsreaktion:
Nachdem erfolgreich die schwere und die leichte Kette in die jeweiligen Vektoren insertiert wurden, werden die beiden variablen Regionen zu einem scFv fusioniert. Dies geschieht mit Hilfe des Vektors pENTRY‑IBA20.
Fusionvektor 10 μl
pNFUSE/pCFUSE (2 ng/μl) 12 μl
StarSolution F4 1.0 μl
StarSolution F5 1.0 μl
StarSolution F6 1.0 μl
Zu dem Fusionsvektor pENTRY‑IBA20 werden die gereinigten Vektoren pNFUSE‑IBA‑
vH‑LINK2 und pCFUSE‑IBA1‑vL gegeben und die Reaktion wird mit den StarSolution F4, F5 und F6 versehen, diese beinhalten neben einem geeigneten Puffer ebenfalls die Ligase und das entsprechende Restriktionsenzym. Die Reaktion wird 1 h bei 30 °C inkubiert anschließend wird das Produkt bei 4 °C über Nacht gelagert.
Am nächsten Tag werden die kompetenten E. coli Zellen z.B. TB1 oder XL1blue, die ein blau‑weiss‑screening ermöglichen, mit den Ligationen transformiert und auf TYE‑Kan‑
IPTG‑X‑Gal‑Platten ausgestrichen und bei 37 °C über Nacht inkubiert.
Transferreaktion:
Nachdem erfolgreich die schwere und die leichte Kette zu einem scFv fusioniert wurden, mussten diese in den Akzeptorvektor pASG‑IBA102‑p3 transferiert werden. Dieser Vektor ermöglicht durch das GenIII die Darstellung einer Phagenbibliothek.
Akzeptorvektor 10 μl
pENTRY‑IBA20‑scFv (2 ng/μl) 12 μl
StarSolution A1 1.0 μl
StarSolution A2 1.0 μl
StarSolution A3 1.0 μl
Zu dem Akzeptorvektor pASG‑IBA102‑p3 wird der gereinigte Vektor pENTRY‑IBA20‑
scFv gegeben und die Reaktion wird mit den StarSolution A1, A2 und A3 versehen, diese beinhalten neben einem geeigneten Puffer ebenfalls die Ligase und das entsprechende Restriktionsenzym. Die Reaktion wird 1 h bei 30 °C inkubiert anschließend wird das Produkt bei 4 °C über Nacht gelagert.
Am nächsten Tag werden die kompetenten E. coli Zellen z.B. XL1blue, die ein blau‑weiss‑
screening ermöglichen, mit den Ligationen transformiert und auf TYE‑Amp‑IPTG‑X‑Gal‑
Platten ausgestrichen und bei 37 °C über Nacht inkubiert.
3.1.16.2. Klonierung mittels Gateway™ Technologie
Ausgehend vom Ligationsprodukt der Fusionsreaktion der StarGate® Technologie erfolgt die Amplifikation und das Anfügen der attB sites mit Hilfe spezifischer Oligonukleotide. Hierzu wird die DNA mit ihren terminalen Oligonukleotiden amplifiziert. Die so erhaltene DNA wird nach der Auftrennung über ein Agarose‑Gel mittels des GeneJET™ Gel Extraction Kit (Fermentas GmbH, St. Leon Rot) gereinigt, und durch Phenol/Chloroform‑Extraktion und Alkoholpräzipitation konzentriert.
Ortsspezifische Rekombination mittels Gateway™ Technologie
Die Gateway™ Technologie nutzt das Lambda Rekombinationssystem, welches die Integration des Phagengenoms in das E. coli‑Chromosom und den Wechsel zwischen
METHODEN
attachment sites flankiert ist, zwischen unterschiedlichen Vektorsystemen zu erlauben109,
110. Für die BP‑Reaktion wird zunächst das Ziel‑Gen mit Oligonukleotiden amplifiziert, die attB1 bzw. attB2 sites einführen. Das Amplifikat mittels des GeneJET™ Gel Extraction Kit (Fermentas GmbH, St. Leon Rot) gereinigt.
BP Reaktion:
PCR‑Produkt mit attB1/attB2 sites x μl (100 fmol)
pDONR x μl (100 fmol entspricht 150 ng)
10x Puffer 4 μl
BP Clonase Enzym Mix 4 μl
ddH2O ad 20 μl
Der BP‑Rekombinationsansatz wird für 1 h bei 25° C (für maximale Effizienz über Nacht) inkubiert. Durch Zugabe von 1 μl Proteinase K und Inkubation für 10 min bei 37° C werden die Enzyme des BP Clonase Enzym Mixes verdaut und 2 μl des Reaktionsansatzes werden für die Transformation eines E. coli F‑‑Zellstamms wie TB1, TOP10 oder DH5eingesetzt.
LR Reaktion:
pENTR x μl (100 fmol)
pHenDEST x μl (100 fmol entspricht 300 ng)
10x Puffer 4 μl
BP Clonase Enzym Mix 4 μl
ddH2O ad 20 μl
Der LR‑Rekombinationsansatz wird für 1 h bei 25° C (für maximale Effizienz über Nacht) inkubiert. Durch Zugabe von 1 μl Proteinase K und Inkubation für 10 min bei 37° C werden die Enzyme des LR Clonase Enzym Mixes verdaut und 2 μl des Reaktionsansatzes für eine Transformation eines E. coli F‑‑Zellstamms eingesetzt. Für eine Phagenselektion der gewonnenen Expressions‑Klone muss die Plasmid DNA isoliert und anschließend E. coli TG1 transformiert werden.