Fermentationskurve auf Kartoffelscheiben

Um die zeitliche Abfolge der Produktion von Iromycinen und Thaxtominen auf Kartoffelscheiben näher zu untersuchen, wurde eine Fermentationskurve – analog zu den Schüttelkulturen angelegt. Neben der Extraktion der Sekundärmetaboliten erfolgte zudem die Extraktion der Gesamt-DNA sowie die eine quantitative Real-Time PCR zur Ermittlung der bakteriellen Biomasse.

3.6.2.1 Gesamt-DNA-Extraktion aus Kartoffeln und Gelelektrophorese

Die DNA-Extraktion inokulierter Kartoffeln erfolgte aus einer 200 mg Mischprobe von vier Kartoffelscheiben, welche zuvor gefriergetrocknet und gemörsert wurden. Das übrige Kartoffelmehl wurde in Falcontubes gelagert und für die spätere Extraktion mit Ethylacetat eingefroren. Auch die CTAB basierte DNA-Extraktion erfolgte bei allen Proben auf identische Art und Weise. Zur Kontrolle des Extraktionserfolges wurden alle Proben mittels Gelelektrophorese getrennt und die Intensität der Anfärbung überprüft. Die Proben wiesen hierbei ein äußerst einheitliches Bild auf, wodurch auf eine uniforme Extraktion geschlossen werden konnte.

3.6.2.2 DNA-Extraktion aus Flüssigkulturen von Streptomyces spp.

(DNA-Standard für die quantitative real-time PCR)

Die DNA-Extraktion der Streptomyceten DNA erfolgte anhand einer Flüssigkultur in YMG-Medium. Vorreinigung der Zellen mit PBS-Puffer lieferte ein weißes Zellpellet, welches nur sehr geringe Restmengen an Medienbestandteilen enthielt. Die weitere DNA-Extraktion

erfolgte anleitungsgemäß mittels ‚High Pure PCR Template Preparation Kit‘ (ROCHE Applied Science). Lediglich beim ersten Lyseschritt mittels Lysozymlösung wurde die Konzentration auf 20 mg/mL in TE-Puffer erhöht. Je nach Streptomycetenstamm betrug die Inkubationszeit zwischen 30 Minuten (Streptomyces scabies 1/3) und 3 Stunden (Streptomyces bottropensis Dra 17).

3.6.2.3 DNA-Quantifizierung mittels UV/VIS Spektralphotometer

Für die Erstellung einer Standardreihe wurde die Konzentration an Streptomyceten-DNA mittels Nanodrop 2000c (THERMO SCIENTIFIC) mehrfach bestimmt und der Mittelwert errechnet.

Abbildung 25: Überprüfung der Standardreihe zur DNA-Quantifikation mittels Real-Time PCR für DNA Mengen zwischen 5 µg/mL und 500 ng/mL aus Streptomyces bottropensis Dra 17

Im Anschluss wurde die DNA fünf mal in 1:10 Stufen verdünnt. Die abschließende Verifizierung der Verdünnungsreihen erfolgte bis zur Detektionsgrenze ebenfalls spektralphotometrisch und bestätigte die einzelnen Verdünnungsstufen. Die Kontrolle der Verdünnungen außerhalb der Detektionsgrenze erfolgte mittels Real-Time PCR.

3.6.2.4 Extraktion von Sekundärmetaboliten aus Kartoffeln

Zur Extraktion der Kartoffelscheiben wurden im Vorfeld unterschiedliche Verfahren angewendet: Hierbei wurden die Kartoffelscheiben im Anschluss an die Inokulation in 50 mL Falcontubes überführt und mit 35 mL Aceton-Methanol 1:1 aufgefüllt. Die Zerkleinerung der Kartoffeln im organischen Lösungsmittel erfolgte mittels Ultrathorax. Die anschließende Extraktion erfolgte für 20 Minuten im Ultraschallbad. Hierbei war festzustellen, dass die Zerkleinerung der Kartoffeln stark von der Textur und dem Befallsgrad anhängig waren. Schwach befallene Kartoffelscheiben konnten mittels Ultrathorax nur schwer zerkleinert werden, was die anschließende Extraktion im organischen Lösungsmittel erschwerte. Ferner wurden bei der eigentlichen Extraktion durch das kartoffeleigene Wasser große Mengen an Stärke in das Eluat eingeschleppt. Diese Stärke musste daher vor der chemischen Analytik mittels Extraktion durch Ethylacetat bzw.

Chloroform entfernt werden.

Um dieses Problem zu vermeiden, wurden die Kartoffelscheiben nach der Probenahme direkt eingefroren und anschließend gefriergetrocknet. Dies hatte ferner den Vorteil, dass die Kartoffelscheiben einzeln gemörsert auch direkt für die weitere Anwendung bei der DNA-Extraktion zum Einsatz kommen konnten. Die DNA-Extraktion der gefriergetrockneten und gemörserten Kartoffelscheiben erfolgte zwei Mal mittels Ethylacetat im Ultraschall. Die im Vakuum eingeengten Proben wurden einheitlich für die anschließende Untersuchung mittels HPLC bzw. HPLC-MS in 2 mL LC-MS Grade Methanol aufgenommen. Analog zur ursprünglichen Extraktionsvariante war bei der Wahl des Lösungsmittels darauf zu achten, stets frisch destilliertes Ethylacetat bzw. Ethylacetat p.a. zu verwenden, da anderenfalls erhöhte Wassermengen im Lösungsmittel eine Verschleppung von Stärke zur Folge hatten.

3.6.2.5 Zeitlicher Verlauf der Produktion von Sekundärmetaboliten auf Kartoffelscheiben

Abbildung 26: Zeitlicher Verlauf der Produktion der Sekundärmetaboliten Thaxtomin A (rot), Iromycin A (blau) und Iromycin B (grün) des Stammes Streptomyces bottropensis Dra 17 auf Kartoffelscheiben der Sorte ‚Cinena‘ in [mg/kg] (n=3). Die Produktionsraten von Iromycin A sowie Thaxtomin A sind hierbei auf der primären Vertikalachse, Iromycin B auf der sekundären Vertikalachse aufgetragen.

Der zeitliche Verlauf der Bildung der einzelnen Sekundärmetaboliten zeigt eine deutliche Differenzierung. Aus Abbildung 27 wird ersichtlich, dass der Gehalt von Iromycin A binnen der ersten 16 Stunden stark ansteigt und bis zur 40. Stunde nach Inokulation in ähnlich starkem Maße wieder abfällt. Zeitlich analog mit der Abnahme von Iromycin A nach etwa 16 Stunden ist das Oxidationsprodukt Iromycin B in Kartoffelscheiben detektierbar. Parallel zur Oxidation von Iromycin A zu Iromycin B ist ferner ein Anstieg der Thaxtomin A Produktion feststellbar, welches bis dahin nur in Spuren nachweisbar war. Das Maximum

R² = 0,8507

Iromycin A Thaxtomin A Iromycin B

der Gehalte von Thaxtomin A wird nach 50 Stunden erreicht, während Iromycin A bis etwa zur 60. Stunde zu Iromycin B oxidiert wird und der Stamm ferner weiterhin das Oxidationsprodukt zu synthetisieren scheint. Der stetige Rückgang aller Einzelmetaboliten bis zur 85. Stunde nach Inokulation manifestiert sich im weiteren zeitlichen Verlauf.

3.6.2.6 Zeitlicher Verlauf der Nachweisbarkeit bakterieller Biomasse auf Kartoffelscheiben

Abbildung 27: Zeitlicher Verlauf der bakteriellern Biomasse des Stammes Streptomyces bottropensis Dra 17 auf Kartoffelscheiben der Sorte ‚Cilena‘ in [µg/mg], ermittelt durch quantitative Real-Time PCR. Signifikante Unterschiede zwischen den Mittelwerten nach dem Newman-Keuls-Test sind in vereinfachter Form mit den entsprechenden Buchstaben kenntlich gemacht (n=3).

R² = 0,465 0

5 10 15 20 25 30 35 40 45

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

bakterielle Biomasse [ µg/mg]

Zeit [hpi]

D A

BCD ABC

ABC

Der zeitliche Verlauf der Biomassenproduktion auf Kartoffelscheiben zeigt eine deutliche Abgrenzung in einzelne Wachstumsstadien. Aus Abbildung 28 wird ersichtlich, dass sich die bakterielle Biomasse binnen der ersten 20 Stunden nach Inokulation nahezu verzehnfacht und für weitere 5 Stunden stagniert. Binnen der folgenden 25 Stunden ist ein linearer Rückgang der Biomasse auf etwa 10 µg/mg festzustellen, welcher für weitere 25 Sunden konstant bleibt. An der 80. Stunde verringert sich die bakterielle Biomasse zusehends und ist ab der 85. Stunde nicht mehr nachweisbar.

Vergleicht man den zeitlichen Verlauf der Biomassenproduktion mit der Biosynthese der gemessenen Sekundärmetaboliten, so ist eine direkte Korrelation der Synthese von Iromycin A und der bakteriellen Biomasse zu vermuten. Weiterhin ist im weiteren Verlauf feststellbar, dass die Produktion des Phytotoxins Thaxtomin A offenbar keinen Einfluss auf das weitere Wachstum des Pathogens zu haben scheint.