Fütterung von NOS-Inhibitoren an S. bottropensis Dra 17

Iromycin A ist als unspezifischer Inhibitor von humanen NO-Synthase Isoformen patentiert (Japan Pat., 1998) (Japan Patent, 98, 237, 044, CA, 129, 244203s). Wie bereits in den Kapiteln zur Biosynthese sowie zu genetischen Untersuchungen zum Thaxtomin A Gencluster beschrieben, weisen die humane und bakterielle NOS eine hohe Similarität auf (WANG et al., 2007, LORIA et al., 2008). Hierauf aufbauend entstand die Hypothese, dass Iromycin A aus Streptomyces bottropensis Dra 17 bei der Biosynthese des Phytotoxins Thaxtomin A regulative Aufgaben zukommen könnten (SURUP, 2007). Aus diesem Grund wurde zu einer Kultur des Stammes in einem für die Thaxtomin A Produktion optimiertem Medium in regelmäßigen Zeitabständen Iromycin A zugefüttert. Hierbei wurde der Effekt auf die Thaxtomin A Produktion mittels Dünnschichtchromatographie, HPLC bzw. HPLC-MS Messungen beobachtet.

Im Vorfeld der Untersuchungen wurden hierzu Optimierungsversuche zur Thaxtominproduktion in Schüttelkulturen sowie eine Fermentationskurve von Thaxtomin A im Flüssigmedium aufgenommen. Dies geschah vordergründig um die optimalen Zeitpunkte zur Fütterung von Iromycin A zu terminieren.

Nach einheitlicher Aufarbeitung des Kulturfiltrates unterschiedlicher Medien sowie dem gebildeten Mycel, zeigten die Medien YMG sowie Hafer die größten Ausbeuten an Thaxtomin A. Diese Ergebnisse deckten sich auch mit Untersuchungen von KING et al.

(1989), welcher S. scabies erstmals in Hafermedium kultivierte und damit die zur Strukturaufklärung des Phytotoxins erreichte. Auch SHIOMI et al. (2006) konnte aus Hafermedium Thaxtomin A isolieren und ebenfalls dessen Biosynthesevorläufer detektieren.

Untersuchungen zur Thaxtominproduktion von BEAUSÉJOUR et al. (1999) auf unterschiedlichen Medien ergaben, dass Thaxtomin A vornehmlich auf ‚natürlichen‘ Medien wie beispielsweise Hafer und YMG produziert wird. Der Grund für die mangelnde Biosyntheseleistung auf synthetischen Medien konnte hierbei nicht abschließend geklärt werden. Auch in eigenen Versuchen (Ergebnisse nicht dargestellt) konnte die Zugabe des Disaccarides Cellobiose, welches für die Expression der Biosynthese verantwortlich ist (JOSHI

et al., 2007) auch auf synthetischen Medien keine Produktion des Phytotoxins auslösen.

Seither gilt das Hafermedium als Standardmedium für die Erforschung der Thaxtomin A Biosynthese sowie deren Regulation (vgl. Kapitel 3.5).

Bei der Optimierung der Thaxtomin A Produktion im Hafermedium für den Stamm S. bottropensis Dra 17 wurden Veränderungen unterschiedlicher Fermentationsparameter (Kolbenvolumen, Optimierung der Belüftung (Schikanen), Füllvolumen, Schüttel-geschwindigkeit) miteinander kombiniert. Hierbei zeigte sich, dass vor allem hohe Schüttelgeschwindigkeiten sowie die Verwendung von Kolben mit Schikanen die Thaxtomin A Produktion positiv beeinflussen. Dies lässt auf einen fördernden Einfluss von Luftsauerstoff auf die Biosynthese schließen. Da in der Biosynthese von Thaxtomin A zwei durch P450

Neben der Produktion des Phytotoxins mussten zusätzlich praktische Gesichtspunkte für den weiteren Versuchsaufbau berücksichtigt werden. Aufgrund des geringen Füllvolumens bei 100 mL Kolben und dem begrenzten Platz an Schüttelplätzen bei 1000 mL Kolben, wurden für die folgende Fermentationskurve sowie den Fütterungsversuchen fortan 300 mL Schüttelkolben verwendet.

-Oxygenasen vermittelte Oxidationen enthalten sind (HEALY et al., 2000, KERS et al., 2004), spricht diese Beobachtung für einen hohen Sauerstoffbedarf dieser Reaktionsschritte.

Die Untersuchung zur Optimierung der Fütterungszeitpunkte ergab eine Produktion von Thaxtomin A ab der 16. Stunde. Die Konzentration des Phytotoxins verlief bis zur 60. hpi stetig und stagnierte anschließend. Aus diesem Grund wurden für den folgenden Fütterungsversuch die Injektionszeitpunkte der NOS-Inhibitoren gleichmäßig auf diesen Zeitraum verteilt. Parallel zur Untersuchung der Thaxtomin A Produktion wurde der pH-Wert der Kulturen vor der Aufarbeitung überprüft. Hierbei zeigte sich ein für Streptomyceten typischer zeitlicher pH-Verlauf (SURUP, 2007).

Das Fütterungsexperiment mit NOS Inhibitoren erfolgte unter den identischen Bedingungen wie bei dem vorangegangen Untersuchungen. Zur Darstellung einer Dosis-Wirkungs-Beziehung wurden unterschiedliche Mengen Iromycin A (6 mg, 2 mg, 0,6 mg, 0,2 mg, 0,06 mg) in jeweils 2 mL Methanol gelöst und in sieben Etappen zwischen der 16. und 60. hpi mittels Einwegspritze zugefüttert. Methanol erwies sich hierbei als optimales

Lösungsmittel, da Iromycine hierbei eine gute Löslichkeit besaßen. Ferner diente das Methanol gleichzeitig als Desinfektionsmittel zur Sterilisation des Iromycins, wodurch große Verluste des Fütterungsdetergenz bei der Sterilfiltration ausblieben. Als Kontrollen wurden neben Methanol auch die literaturbekannten NOS-Inhibitoren NNA und NMMA (NUSZKOWSKI, 2001, SCHLEICHER, 2005) auf identische Weise zugefüttert.

Die analytische Auswertung der Kulturfiltrate, welche zuvor einheitlich aufgearbeitet wurden, ergab erwartungsgemäß eine starke Inhibition durch die beiden Positivkontrollen (NNA, NMA). Die Fütterungsvarianten mit stammeigenen Iromycin A konnten hingegen nur sehr geringe Effekte auf die Bildung des Phytotoxins Thaxtomin A ausüben. Gleichzeitig wurden in den Varianten mit Iromycin A als Fütterungsdetergenz große Mengen von dessen Abbauprodukt Iromycin B detektiert, welche mit zunehmender Fütterungsmenge an Iromycin A zunahmen. Dieses lässt vermuten, dass Iromycin A ab einem gewissen Zeitpunkt des Fütterungsexperimentes rasch zu Iromycin B oxidiert wurde. In diesem Fall korrelieren die vorliegenden Ergebnisse mit Untersuchungen von SURUP,SCHLEICHER und OESS (2007), welche ebenfalls nur geringe Effekte bei der NOS-Inhibition von Iromycin B an Eierstöcken des Chinesischen Hamsters feststellten. Aufgrund des extrem schnellen Abbaus des zugesetzten Iromycin A kann man eine enzymatische Reaktion des Streptomyceten nicht ausgeschlossen werden. Untersuchungen von LORIA et al. (2008) geben darüber Aufschluss, dass die Biosynthese von Thaxtomin A sehr fein reguliert ist. Auf dieser Grundlage, dass Iromycin A bei S. bottropensis in die Regulation von Thaxtomin A einbezogen ist, kann man vermuten, dass die Biosynthesegene von Iromycin A während der Thaxtomin A Produktion inhibiert sind bzw. spezifische Enzyme dafür sorgen, dass lediglich das oxidative und inaktive Abbauprodukt Iromycin B gebildet wird. Im Falle dieses Fütterungsversuches könnte das zugefütterte Iromycin A direkt enzymatisch durch den Streptomyceten

‚detoxifiziert‘ worden sein. Diesen Sachverhalt unterstützt auch die Tatsache, dass in

‚Thaxtomin A potenten Medien‘ Iromycin A in sehr geringen Mengen produziert wurde, wobei größere Mengen des oxidativen Abbauprodukts Iromycin B in diesen Medien zu finden waren.

Um diese Tatsache zu untermauern, wurde der Versuch an einem phytopathogenen Streptomyceten wiederholt, welcher selber nicht in der Lage ist, Iromycine zu bilden und

somit auch nicht über einen entsprechenden Enzymapparat verfügt, welcher die Iromycin-Bildung inhibiert bzw. Iromycin A ‚detoxifiziert‘.