3.2.1 Versuchstiere und Haltungsbedingungen
Zwölf Hennen der Legehybridrasse Lohmann Braun mit einer mittleren Lebendmasse von 1,89 ± 0,06 kg wurden für den Fütterungsversuch eingestallt. Die Tiere stammten vom insti-tutseigenen Versuchsgut. Mit einem Alter von sechs Monaten befanden sich die Legehennen im Maximum ihrer Legeintensität. Die zwölf Tiere wurden in einem 16 m2 großen Käfig in der Gruppe in Bodenhaltung gehalten. Der Käfig befand sich in einem gesonderten Stalltrakt des BfR-Versuchsguts und war mit Sägespänen eingestreut. Das Ausmisten des Käfigs erfolgte einmal wöchentlich. Zu den Einrichtungselementen des Käfigs gehörten außerdem eine drei-stöckige Sitzleiter sowie Einzellegenester. Der Käfig war durch die im Stalltrakt befindlichen Fenster natürlich beleuchtet, eine zusätzliche Beleuchtung erfolgte über Leuchtstoffröhren im Käfig, um den Legehennen trotz der kurzen Tage in den Wintermonaten zehn Stunden Licht
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zu gewährleisten. Während der gesamten Versuchszeit wurde mithilfe von Heizung und Lüf-tung der Stall auf eine Temperatur von 21 °C bei 68 % relativer Luftfeuchte erwärmt.
3.2.2 Zusammensetzung des Legehennenfutters und Fütterung
Für den Fütterungsversuch mit Legehennen wurde ebenfalls ein PFAA-freies Kontrollfutter und PFAA-haltiges Versuchsfutter hergestellt. Die Herstellung erfolgte wie unter Punkt 3.1.2 beschrieben. Der Energie- und Nährstoffgehalt der auf einer Mischung aus Gerste, Triticale und Sojaextraktionsschrot basierenden Legehennenration entsprach den Empfehlungen der GfE zur Energie- und Nährstoffversorgung der Legehennen und Masthühner (Broiler) (GFE 1999). Wie auch bei den Mastschweinen unterschied sich das Kontrollfutter der Legehennen vom Versuchsfutter lediglich in seinem Anteil an PFAA-freier Gerste und PFAA-freiem Heu.
Im Versuchs- und Kontrollfutter wurde als eiweißhaltige Komponente Sojaextraktionsschrot 6323 des regionalen Futtermittelherstellers Gerswalder Mühle GmbH & Co.KG verwendet sowie für die bedarfsgerechte Versorgung der Tiere mit Vitaminen und Spurenelementen das aminosäurenhaltige Mineralfutter SALVANA Herdbuch 23. Zur Unterstützung der Eischalen-bildung wurde zusätzlich Calciumcarbonat in die Legehennenration eingemischt. Die Zu-sammensetzung der Versuchsration für Legehennen sowie die durch die Weender Futtermit-telanalyse ermittelten Inhaltsstoffe sind der
Tab. 8 zu entnehmen.
Tab. 8: Zusammensetzung und Inhaltsstoffe der Ration für Legehennen
Futterkomponente Anteil in der Ration (%)
Gerste 37,0
Triticale 28,0
Sojaextraktionsschrot (44% XP) 19,0
Heu 8,0
Öl 1,5
Mineralfutter* 3,0
Calciumcarbonat 3,5
Inhaltsstoffe Kontrollfutter Versuchsfutter
Trockenmasse (%) 90,4 90,4
Rohasche (% TM) 8,6 9,4
Rohprotein (% TM) 18,9 18,8
Rohfaser (% TM) 6,4 6,4
NfE (% TM) 62,0 62,5
Rohfett (% TM) 4,8 3,4
* Inhaltsstoffe: 3,5% Lysin, 1,5% Threonin, 1,5% Methionin, 75,0% Rohasche, 16,5% Calcium, 4,0% Phosphor, 7,0% Natrium, 1,5% Magnesium; Zusammensetzung: 39,2% Calciumcarbonat, 18,5% Natriumchlorid, 10,0% Weizengrießkleie, 10,0%
Monocalciumphosphat, 8,5% Calcium-Magnesiumphosphat, 1,25% Magnesiumoxid, 1,0% Sojaöl; Zusatzstoffe je kg
Mineralfutter: 500.00 I.E. Vitamin A, 5.000 I.E. Vitamin D3, 2.000 mg Vitamin E (α-Tocopherolacetat), 375 mg Kupfer-(II)-sulfat, Pentahydrat, 12.00 FTU 6-Phytase Phyzyme EG-Nr. E1640
Während des gesamten Fütterungsversuchs stand den Hennen Wasser über eine Stülpträn-ke zur freien Aufnahme zur Verfügung. Die Fütterung erfolgte über einen Rundautomaten.
Um die Tiere schrittweise an das pelletierte Legehennenfutter zu gewöhnen, wurde in der ersten Woche der 14-tägigen Eingewöhnungsphase das gewohnte Mischfutter sukzessive durch das Kontrollfutter substituiert (100 % auf 75 % – 50 % – 25 % – 0 %). Die Eingewöh-nungsphase diente gleichzeitig als Kontrollphase, in der bereits Eier gesammelt und auf den Gehalt an PFAAs analysiert wurden.
46 Bundesinstitut für Risikobewertung Der eigentliche Fütterungsversuch an Legehennen gliederte sich in zwei Fütterungsphasen:
eine 24-tägige PFAA-Fütterungsperiode (Tag 1–24) und eine 42-tägige Auswaschphase (Tag 25–66). In der PFAA-Fütterungsperiode erhielten alle 12 Tiere ein PFAA-haltiges Lege-hennenfutter. Anschließend wurden vier von zwölf Legehennen geschlachtet, die übrigen acht Tiere durchliefen eine Auswaschphase, in der das PFAA-haltige Legehennenfutter durch ein PFAA-freies Legehennenfutter (Kontrollfutter) ersetzt wurde, bevor auch sie ge-schlachtet wurden. Um eine maximale Futteraufnahme zu gewährleisten, wurden die Tiere ad libitum gefüttert. Dafür wurde für die Futtereinwaage eine tägliche Futteraufnahme von 120 g pro Tier angenommen. Die Fütterung der Legehennen erfolgte einmal täglich morgens um 8:00 Uhr. Vor Einwaage des Futters am Folgetag wurden mögliche Restfuttermengen quantitativ erfasst, um die Gesamtfutteraufnahme der Gruppe errechnen zu können. Zum Zeitpunkt der morgendlichen Futtereinwaage wurden täglich Proben von 50 g gezogen und zu einer Wochensammelprobe vereinigt. Die Wochenproben des Futters wurden bis zur PFAA-Analyse in PFAA-freie PP-Tüten luftdicht aufbewahrt. In Tab. 9 sind die Ergebnisse der PFOA- und PFOS-Gehalte des Legehennenfutters dargestellt.
Tab. 9: PFOA- und PFOS-Gehalte des Legehennenfutters (90,4 % TM)
Futter
PFOA (µg/kg TM)
PFOS (µg/kg TM) PFAA-haltiges Legehennenfutter (n = 4) 8,0 ± 0,2 51,9 ± 1,6
Kontrollfutter (n = 8) < NG* < NG
*Nachweisgrenze (NG): 0,2 µg/kg
3.2.3 Gesundheitsstatus
Der allgemeine Gesundheitsstatus der Tiere wurde täglich visuell bei der Fütterung beurteilt und Auffälligkeiten protokolliert.
3.2.4 Kontrolle der Lebendmasse
Die mittlere Lebendmasse der Legehennen wurde zu Beginn der Eingewöhnungsphase (Tag -14), am ersten Tag der PFAA-Fütterungsperiode (Tag 1) und Auswaschphase (Tag 25) sowie am Tag der Schlachtung (Tag 67) bestimmt. Zur Wägung wurden jeweils sechs Tiere (PFAA-Fütterungsperiode) bzw. vier Tiere (Auswaschphase) in eine Box gesperrt und auf einer Digitalwaage gewogen. Während des Fütterungsversuchs wurden keine Einzeltier-wägung durchgeführt, da durch die Gruppenhaltung der Legehennen die individuelle Fut-teraufnahme und damit mögliche Effekte auf die Lebendmasse des Einzeltieres nicht ermit-telt werden konnten. Eine Einzelwägung der Legehennen fand nur am Tag der Schlachtung statt.
3.2.5 Sammlung und Aufarbeitung der Eier
Während der Versuchsdauer wurden die Eier an jedem zweiten Versuchstag gesammelt, mit dem Legedatum versehen und bis zur Trennung in Eigelb und Eiweiß bei 6 °C gelagert. Die Trennung in Eigelb und Eiweiß erfolgte zeitnah im Labor, hierbei wurde in einem ersten Schritt das mittlere Eigewicht pro Tag dokumentiert. Nach dem Zerschlagen der Eischale wurden Eigelb und Eiweiß getrennt in Bechergläsern aufgefangen, gewogen und mit dem Eigelb bzw. Eiweiß aller Eier des gleichen Legedatums gepoolt. Anschließend wurden Eigelb bzw. Eiweiß mit dem Ultra-Turrax 1 min homogenisiert. Ein Aliquot von 50 ml wurde in eine PP- Schraubdeckeldose (Firma Carl Roth GmbH & Co. KG) abgefüllt, luftdicht verschlossen
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und bis zur PFAA-Analyse bei -20 °C tiefgefroren. Vor jeder Trennung der Eier mit neuem Legedatum wurde das gesamte verwendete Labormaterial in einem dreifachen Waschschritt mit destilliertem Wasser ausgespült und getrocknet.
3.2.6 Gewinnung von Plasma und Schlachtproben
Vor der Schlachtung wurden die Tiere individuell markiert, um nach der Schlachtung die ge-wonnen Proben von Blut, Ei, Muskel- und Organgewebe den Tieren zuordnen zu können.
Die Schlachtung der Legehennen wurde in der institutseigenen Geflügelschlachthalle des Fachbereichs Lebensmitteltechnologie des BfR durchgeführt. Die Tiere wurden elektrisch betäubt und durch Durchtrennung der Halsschlagader getötet. Eine Probe des beim Ausblu-ten herausfließenden Blutes wurde in EDTA-Röhrchen aufgefangen und zur Plasmagewin-nung bei Raumtemperatur (20 °C) und 3000 g für 10 min zentrifugiert. Nach dem Entbluten folgten das Rupfen der Federn, das Eröffnen des Tierkörpers und die Entnahme der inneren Organe. Dabei fand sich in elf von zwölf Tieren ein noch nicht gelegtes, vollständig entwi-ckeltes Ei, das gemäß Punkt 3.3.4 für die PFAA-Analyse weiterverarbeitet wurde. Von allen Tieren wurden Leber und Nieren entnommen und dessen Gewicht ermittelt. Für die PFAA-Analytik wurden die gesamte Leber (31 ± 9 g), beide Nieren (8 ± 3 g) sowie 31 ± 9 g des lin-ken Brustmuskelgewebes (Musculus pectoralis) entnommen. Alle Proben wurden in PP-Schraubdeckeldosen der Firma Carl Roth GmbH & Co. KG bei -20 °C bis zur PFAA-Analyse gelagert. Um indirekte PFAA-Kontaminationen während der Schlachtung zu vermeiden, wur-den vor jeder neuen Schlachtung und Probenahme alle Werkzeuge und Arbeitsflächen gründlich gesäubert. Eine Übersicht zum Versuchsdesign und dem Schema der Probenah-me gibt Abb. 7.
Abb. 7: Versuchsdesign und Schema der Probenahme des Fütterungsversuchs an Legehennen