2.8.1 Vorbereitung der Experimente und allgemeine Versuchsbedingungen
Vor Beginn der Experimente wurden die Meereisorganismen aus den Kulturflaschen übe eine 20 um-Gaze angereichert und in Petrischalen überführ
Nematoden, Turbellarien und Ciliaten wurden mit der Pipette aussortiert und in Zellkul- turschalen (CORNING, cell wells, 3 ml) überführ Die sortierten Kulturen wurden bei Temperaturen von 0 bis 1° und einem hell-dunkel Zyklus von 12:12 Stunden gehaltert;
der Beleuchtungstakt wurde auch währen der Experimente beibehalten. Die Salzgehal- te wurden mit einem ATAGO Handrefraktometer ( l % o Auflfisung) gemessen. D a das Gerä Promilleeinheiten angibt, wurde diese Einheit fü die Beschreibung der Experi- mente beibehalten, obwohl sie nicht mehr üblic ist. Die übrige Salzgehaltsangaben in dieser Arbeit sind deshalb einheitlich ebenfalls in %G angegeben. Der Vorteil bei der Ver- wendung eines Refraktometers liegt jedoch darin, da fü jede Messung nur ein Tropfen Wasser bentitigt wird. Ein grfi§ere Volumen, wie es fü die konduktometiische Messung erforderlich ist, stand unter diesen Versuchsbedingungen nicht zur Verfügung
Währen der Experimente wurde täglic die Anzahl der überlebende Organismen, ihr Verhalten und ihr Aussehen kontrolliert. In grfifieren Zeitabstände wurden a u k r d e m Videoaufnahmen der Organismen gemacht. Währen des Sortierens und der tägliche Kontrolle der Versuchsansätz wurden die Zellkulturschalen auf einer zu diesem Zweck angefertigten Binokularkühlplatt auf der entsprechenden Versuchstemperatur gehalten.
2.8.2 Generationszei ten von Meereisciliaten
Die Generationszeit wurde bei einem hiiufig in den Kulturen vorkommenden Ciliaten bestimmt. Zu diesem Zweck wurden 24 Ciliaten ieweils einzeln in Zellkulturschalen
(16 mm Durchmesser) mit sterilfiltriertem Seewasser mit einem Salzgehalt von 30%
gesetzt. Die Kulturen wurden bei Temperaturen von 0 bis 1° und einem hellldunkel- Beleuchtungstakt von 12:12 Stunden gehaltert. Den Organismen wurden Bakterienkul- turen, die auf Reisktjrnern gezüchte worden waren, und Eisalgenmischkulturen als Nah- rung zugegeben. In den folgenden 19 Tagen wurde die Anzahl der Ciliaten in den Zell- kulturschalen tiiglich zur selben Zeit bestimmt. Am Ende des Versuchs wurden die Cilia- ten zur Artbestimmung fixiert. Die Berechnung der Wachstumsrate erfolgte gemä der allgemeinen Wachstumsfosmel
N - N * e p * t
t - 0 mit Nt = Anzahl Ciliaten zum Zeitpunkt (t),
No = Anzahl Ciliaten zu Versuchsbeginn,
= Wachstumsrate (llh bzw. Ud).
2.8.3. Salzgehaltstoleranz von Meereisturbellarien und -nematoden
In diesem Experiment wurde der Eintluà des Salzgehaltes auf das überlebe von Meer- eisturbellarien und -nematoden untersucht. Die Organismen fü dieses und die beiden folgenden Experimente zur Salzgehalts- und Temperaturtoleranz wurden auf der Reise ARK XI1 auf den Stationen 195, 196, 200,201, 202,204 und 216 gesammelt.
Die in den Experimenten zum Aufsalzen verwendete Sole wurde durch Einfrieren von 0.2 um-filtriertem arktischem Seewasser bei einer Temperatur von -30° in 5 0 ml Eppendorf ,,Combitips" hergestellt. Nach kurzem Auftauen bei Raumtemperatur konnte die konzentrierte Sole herausgepreß werden und zum Ansetzen der verschiedenen Sali- nitäte durch Mischen mit filtriertem Seewasser verwendet werden. Das verbleibende Eis wurde unter Zugabe von destilliertem Wasser zur Herstellung von Seewasser mit geringen Salzgehalten verwendet. Auf diese Weise konnten Salzgehalte von 1 bis 100%0 erreicht werden.
Jeweils 15 Turbellarien und Nematoden wurden 12 verschiedenen Salzgehalten ausge- setzt (gesamt: 180 Nematoden und 180 Turbellarien). Die Tiere eines Ansatzes wurden auf 3 Versuchsgefäà (je 5 Tiere) verteilt, um die Beobachtungen und Zählunge dieser schnell beweglichen Organismen zu erleichtern. Zu Beginn des Experiments hatten die Kulturen Salzgehalte von 25 bis 30760. Davon ausgehend wurden die Salzgehalte im ersten Teil des Experiments in 5%0 Schritten täglic durch den teilweisen Austausch von Wasser mit Protistenkulturen jeweils htjherer oder niedrigerer Salinitä verändert bis nach 8 Tagen 12 verschiedene Salzgehalte von 10 bis 65% erreicht waren. Die Verwen- dung von bereits angepafiten Protistenkulturen gewährleistet eine ausreichende Nah- rungszufuhr fü die Metazoen.
Die Meereisprotisten-Kulturen (Ciliaten, Algen u.a.) wurden vor Beginn der Expesi- mente durch Zugabe von Seewasser entsprechender Salinitä in tägliche 5% bzw. l%o
Schritten allmählic auf Salzgehalte von 1 bis 100 %O eingestellt, bis 21 Kulturen unter- schiedlicher Salzgehalte etabliert waren. Nährstoff wurden, wie in Kapitel 2.3 beschrie- ben, zugesetzt.
Die Turbellarien und Nematoden wurden fü 11 Tage bei diesen Salinitäte belassen und täglic kontrolliert, um den Einfluà der verschiedenen Salzgehalte übe die Zeit zu untersuchen. Nach der Kontrolle am 12. Experimenttag wurden im zweiten Teil des Experiments die Salzgehalte der Versuchstiere weiter verändert bis schließlic nach 9 zusätzliche Tagen Salzgehalte von 1 bis 100960 erreicht waren. Die Metazoen wurden wenigstens 12 Tage bei den jeweiligen Salzgehalten belassen. Das Schema des Ver- suchsaufbaus ist in Tab. 2.3 dargestellt. Dieser zweiteilige Versuchsaufbau ermöglicht die Untersuchung eines solch breiten Salinitätsspektrum trotz der begrenzten Anzahl an zur Verfügun stehenden Eisorganismen. Fehlende Tiere wurden, soweit möglich nach Ende des ersten Versuchsteils ersetzt. Da aber währen der darauf folgenden Adaptati- onszeit einige Tiere starben, standen zum Beginn des zweiten Experimentteils nicht in allen Ansätze 15 Tiere zur Verfügung Die Ergebnisse beider Versuche wurden zur bes- seren Vergleichbarkeit in % Überlebend dargestellt, und die Anzahl der Versuchstiere zu Beginn des zweiten Experimentteils wurde als 100% bezeichnet.
Die Turbellarien und Nematoden wurden bei den tägliche Kontrollen als tot betrachtet, wenn keine Bewegung des Tieres bzw. der Cilien bei 50facher Vergrößeru mehr sicht- bar war oder schon deutliche Zersetzungsprozesse auftraten. Unbewegliche Nematoden wurden außerde mit einem Wasserstrom aus einer Pasteuipipette gereizt, da die Tiere dann häufi wieder Lebenszeichen zeigten. Inaktive aber sonst intakte Organismen wur- den wenigstens eine Woche kontrolliert, da sich gelegentlich einzelne Tiere erst nach dieser Zeit wieder bewegten. Eindeutig tote Tiere wurden sofort aus den Kulturen ent- fernt und fü die Untersuchung der Arten fixiert (siehe Kapitel 2.3). Am Ende des Expe- riments wurden extrem hohe und niedrige Salinitäte in 5%0 Schritten zu gemäßigter Salzgehalten geändert um zu Überprüfe ob inaktive Organismen sich wieder vom Salz- streà erholten. Die meisten der in diesem Experiment überlebende Tiere wurden fü die beiden nachfolgenden Experimente zur Salz- und Temperaturtoleranz übernommen lediglich einzelne Exemplare aus verschiedenen Salzgehalten wurden fü die Identifika- tion der Arten fixiert.
Währen des Experiments Überlebte verschiedene Ciliatenarten aus den Protistenkultu- ren. Um Information übe das Artenspektrum zu erhalten, wurden einige Exemplare jeder Salzgehaltsstufe mit Bouin fixieit.
Währen des Experiments wurden zu verschiedenen Zeiten Videoaufnahmen der Proti- sten bei 400facher Vergrökrun gemacht. Da die Ciliaten aufgrund ihrer relativ gerin- gen Konzentration und ihrer Beweglichkeit schwer zu zähle waren, wurde nur die
Tab. 2.3: Salzgehalte des Salzgehaltstolermz-Experiments in den 12 Ansätze übe die Zeit, hergangs-
Abundanz der Algen erfaßt Die Auswertung der Videoaufnahmen erfolgte mit einem Video-Bildanalysesystem (LEICA Q500MC) durch Quing Zhang (Second Institute of Oceanography, Hangzhou, China), der zu dieser Zeit als Gastwissenschaftler an unserem Institut täti war.
2.8.4 Salzgehalts- und Temperaturtoleranz von Meereisturbellarien und nematoden
(1)In diesem Experiment sollte der kombinierte Einfluà der Parameter Temperatur und Salzgehalt auf das überlebe der Metazoen untersucht werden.
Entsprechend der im vorigen Experiment ermittelten Salinitätstoleranze wurden jeweils 4 Ansätz mit Turbellarien und Nematoden Salinitäte von 5 , 2 5 , 4 5 und 65%0 und Tem- peraturen von 0 bis -6OC ausgesetzt. Jeder Ansatz bestand aus 15 Turbellarien (insge- samt: 60) bzw. 9 juvenilen und 9 adulten Nematoden (insgesamt: 72).
Die Temperaturen wurden mittels einer regelbaren Kühlplatt (REICHERT JUNG, Tis- sue Cool Plate COP 20) erzielt. Da die Kühlplatt nicht an allen Stellen gleiche Tempe- raturen erreichte und deutliche Temperaturschwankungen zeigte, gewährleistet folgen- der Versuchsaufbau (Abb. 2.3) eine gleichmäßi Temperaturverteilung in allen Zellkul- turschalen, ein Abpuffem der zeitlichen Temperaturschwankungen sowie eine effektive Temperaturübertragung Die Kühlplatt wurde an den Ränder mit Styropor isoliert und nach oben mit 2 Acrylglasplatten abgedeckt. In den so entstandenen Raum wurden zwei mit konzentrierter NaCl-L6sung gefüllt Plastikbeutel mit einer dazwischenliegenden
(T)
Zellkulturschalen mit Eisorganismen(D
Deckplatte aus Acrylglas@
Kunststoffbeutel, mit konzentrierter Kochsalzlösun gefüll@
Aluminiumplat t e(5)
Kühlplatt@
St yroporisolat ion(?)
Kryostat mit stufenloser TemperaturregelungAbb. 2.3: Übersich übe den Versuchsaufbau in den Experimenten zur Salzgehalts- und Teinperaturtole- ranz von acoelen Turbellarien und Nematoden.
Aluminiumplatte gelegt. Auf den oberen Beutel wurden die Zellkulturschalen aufgelegt.
Die Lufttemperatur in der Versuchskammer betrug ca. O°C Die Temperatur in den Kul- turen wurde taglich mit einem Digitalthermometer (POLZIN, 0.1 'C Auflösung kontrol- liert.
Beginnend mit O° wurde die Temperatur jeden zweiten Tag um Ca. 1° erniedrigt bis nach 14 Tagen -6OC erreicht waren. Temperatur und überlebe der Organismen wurden dreimal taglich kontrolliert. Entgegen der Erwartung gab es in keinem der Ansätz Eis- bildung. Da die Ursache fü diese starke Unterkühlun unklar war, wurde die Osmola- ritä des Seewassers der Versuchsansätz im Vergleich zu sterilfiltriertem Seewasser gleicher Salzgehalte gemessen. Hiermit sollte geklär werden, ob eventuell von den Organismen freigesetzte osmotisch wirksame Substanzen den Gefrierpunkt der Proben erniedrigt haben. Die Messungen erfolgten mit einem Microosmometer (DINKEL- BERG-LABORTECHNIK, ADVANCED INSTRUMENTS, Inc., Modell 3 MO) am IfM Kiel, Abteilung Meereszoologie.
Der Effekt der Unterkühlun gab die Mtiglichkeit, den Einfluà der kalten Temperaturen auf das überlebe der Organismen ohne den Effekt der Eiskristallbildung zu untersu- chen. Eisbildung wurde dann schliefilich durch Zugabe kleiner Eiskristalle initiiert.
Nach langsamem Auftauen bei O° (ca. 15 bis 2 0 min) wurde das überlebe der Orga- nismen kontrolliert. Anschließen wurden die Ansätz auf -6.2OC gekühl und wiederum durch Zugabe von Eiskristallen Eisbildung initiiert. Nach 2 Tagen wurden die Proben bei O° aufgetaut, die Freisetztung der Tiere aus dem Eis wurde hierbei beobachtet und gefilmt und ihr überlebe kontrolliert. Parallel zu diesem Experiment wurden Kontrol- len beider Taxa bei 0 bis 1° und den vier verschiedenen Salzgehalten untersucht. Bei den adulten Nematoden mu§te wegen der begrenzten Menge an zur Verfügun stehen- den Organismen die Ergebnisse aus dem vorhergehenden Salzgehaltstoleranz-Expesi- ment als Kontrolle herangezogen werden.
2.8.5. Salzgehalts- und Temperaturtoleranz von Meereisturbellarien und nematoden (2)
In diesem Experiment sollte der Einfluà von Temperatur und Salzgehalt entsprechend der natürliche Relation dieser Parameter im Eis (Neumann und Pierson 1966) auf die beiden Taxa untersucht werden. Ausgehend von 30%0 und einer Gleichgewichtstempe- ratur von - 1.6OC wurde der Salzgehalt täglic um 5% erhöh und die Temperatur auf den entsprechenden Gefrierpunkt gesenkt (siehe Tab. 2.4). Auch in diesem Experiment trat keine Eisbildung auf. Zwei Ansgtze mit jeweils 15 Turbellarien wurden auf diese Weise behandelt, bis 75960 bzw. 85% erreicht waren. D a die Nematoden eine höher Salzge- haltstoleranz (siehe Ergebnisse 3.8.2) zeigten, wurden zwei Ansätz mit jeweils 9 juve-
Tab. 2.4: Salzgehalte und entsprechende Temperaturen in Salzgehalts-und Temperaturtoleranzexperiment (2) und theoretischer Gefrierpunkt nach Neumann und Pierson (1966); X= Mittelwert, SD=Stan-
Temperatur (¡C im
nilen und adulten Nematoden Salinitaten bis zu 85%0 bzw. 95%0 und der entsprechenden Gleichgewichtstemperatur ausgesetzt. Da alle Ansätz zur selben Zeit in der Kühlkarn mer waren, wurde die Temperatur bis zum Gefrierpunkt von 9 5 % ~ Seewasser gesenkt, so da die 75%0 und 8 5 % ~ Ansatze leicht unterkühl wurden. Die Metazoen wurden fü 10 Tage (12 Tage bei dem 75960 Ansatz) bei den entsprechenden Temperaturen und Salzge- halten belassen und täglic kontrolliert. Am Ende des Experiments wurden alle Ansatze fü 2 Tage bei -6.8'C durch Zugabe kleiner Eiskristalle gefroren, dann bei Raumtempe- ratur aufgetaut und das überlebe der Tiere bestimmt. Da nicht mehr genügen Meta- zoen zur Verfügun standen, dienten die Ergebnisse des Salzgehaltstoleranz-Experi- ments als Kontrolle. Es liegen daher keine Kontrollwerte fü juvenile Nematoden vor.
Theoretischer
Bei der graphischen und tabellarischen Darstellung wurden die Daten zumeist durch Bil- den von Mittelwert (X), Standardabweichung (s), Median (M), Minimum (xmin) und Maximum (xmãà und Anzahl der Werte (n) zusammengefaBt. Bei der tabellarischen Darstellung der Abmessungen der Ciliaten wurde außerde der Standardfehler des Mit- telwertes (Sã und der Variabilitätskoeffizien (V) angegeben (Sachs 1984, Lozan 1992).
Der Median (mittleres Quartil xos0) wurde statt des Mittelwerts bei kleiner Stichpro- bengröß asymmetrischer Verteilung der Daten und Verdacht auf Ausreiße verwendet.