Evaluierung von 20 Kandidatengenen für primäre Katarakt beim Deutschen Pinscher

Einleitung

Primäre Katarakt ist eine häufig auftretende Erkrankung bei Rassehunden, über 120 Rassen weltweit sind betroffenen. Die Erblichkeit von nicht kongenitaler primärer Katarakt (CAT) wurde bereits bei vielen Rassen nachgewiesen. Der Deutsche Pinscher ist ebenfalls eine Rasse mit Prädisposition für die Entwicklung einer primären Katarakt, daher wird angenommen, dass die Erkrankung auch hier einen

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genetischen Hintergrund besitzt. Die Prävalenz von CAT in der Deutschen Pinscher Population in Deutschland wurde in einer anderen Studie auf 15,33% geschätzt. Die Mehrheit der Deutschen Pinscher entwickelt eine beidseitige Katarakt, die am Häufigsten im vorderen kortikalen Teil der Linse lokalisiert ist. Das durchschnittliche Alter bei der Erstdiagnose von CAT liegt bei den hier untersuchten Deutschen Pinschern bei 3,8 Jahren. Aufgrund des relativ späten Manifestationsalters und des vermutlich rezessiven Erbgangs ist es schwierig Merkmalsträger rechtzeitig zu erkennen und von der Zucht auszuschließen sowie Anlageträger zu erkennen. Ein DNA-Test, der zeigt ob ein Tier homozygot für eine CAT verursachende Mutation oder eine heterozygoter Anlageträger oder frei von CAT verursachenden Mutationen ist, wäre sehr hilfreich und könnte in Kombination mit einem effektiven Zuchtprogramm die Prävalenz von CAT beim Deutschen Pinscher erheblich senken.

Heute sind über 20 Gene beim Hund bekannt, die als potentielle Kandidatengene für CAT angesehen werden, da sie beim Menschen oder bei der Maus mit dieser Erkrankung assoziiert sind. In der vorliegenden Studie wurden die 20 Kandidatengene nach Mellersh et al. (2006) untersucht.

Material und Methoden

Die Ergebnisse ophthalmologischer Untersuchungen von Deutschen Pinschern wurden vom Dortmunder Kreis (DOK) zur Verfügung gestellt. Alle Untersuchungen wurden von spezialisierten und zertifizierten Tierärzten basierend auf einem standardisierten Untersuchungsprotokoll durchgeführt. Nur primäre Katarakte wurden dabei berücksichtigt. Der Pinscher-Schnauzer-Klub 1895 e.V. (PSK) stellte die Abstammungsdaten für alle Tiere zur Verfügung. Wir wählten insgesamt 45 Hunde aus fünf verschiedenen Familien aus, darunter 15 von CAT betroffene Tiere. Bei den meisten dieser erkrankten Hunde (86,67%) war die Trübung im vorderen kortikalen Bereich der Linse lokalisiert. Bei 11 Tieren (73,33%) waren beide Augen betroffen, während bei den restlichen vier Hunden nur das rechte oder nur das linke Auge betroffen waren. Die Mehrheit der Probanden (70%) wurde zweimal oder dreimal ophthalmologisch untersucht. Mindestens ein nicht betroffenes Tier aus jeder Familie wurde ebenfalls untersucht. Nicht betroffene Tiere, bei denen die letzte

ophthalmologische Untersuchung im Alter unter 4,5 Jahren erfolgte, wurden als Hunde mit unbekanntem Phänotyp klassifiziert. zusätzlich testeten wir drei nicht an CAT erkrankte Hunde anderer Rassen als Kontrolltiere. Zwei Milliliter EDTA-Blut wurde von jedem Tier gesammelt, aus dem dann die DNA isoliert wurde.

Zur Untersuchung der 20 Kandidatengene verwendeten wir die 36 Mikrosatelliten sowie PCR-Bedingungen nach Mellersh et al. (2006). Zur Feinkartierung der gekoppelten Region auf Chromosom 28 wählten wir acht weitere Mikrosatelliten aus.

Alle Mikrosatelliten wurden für alle 45 untersuchten Tiere typisiert. Eine nicht-parametrische Kopplungsanalyse wurde basierend auf dem identical-by-descent Verfahren unter Verwendung der Software MERLIN 1.1.2 durchgeführt. Die Markerallele wurden dabei auf Kosegregation mit dem CAT-Phänotyp beim Deutschen Pinscher getestet. Alle Marker wurden bezüglich Allelfrequenzen, Heterozygotiegrad und Polymorphismus-Informationsgehalt charakterisiert. Für den Assoziationstest wurde eine case-control Analyse basierend auf χ^2-Tests für Genotypen und Allele durchgeführt. Außerdem wurde eine Sequenz- und Mutationsanalyse für das Gen PITX3 bei 10 Tieren durchgeführt, deren Ergebnisse ebenfalls in die Kopplungs- und Assoziationsanalysen mit einbezogen wurden.

Ergebnisse und Diskussion

Mittels der nicht-parametrischen Kopplungsanalyse der Mikrosatelliten konnte eine signifikante Kopplung der Marker CF28_16.26, PITX3_28_16.97 und CF28_17.89 mit dem CAT-Phänotyp beim Deutschen Pinscher festgestellt werden. Diese Marker sind alle auf Chromosom 28 in unmittelbarer Nähe des PITX3-Genes lokalisiert.

Mittels Sequenz- und Mutationsanalysen von PITX3 konnten insgesamt sieben Zwischenrasse-SNPs gefunden werden, von denen fünf in Exon 3 lokalisiert waren.

Die anderen zwei lagen im Bereich von Intron 2. Es konnten keine Polymorphismen innerhalb der Rasse Deutscher Pinscher gefunden werden. Die Sequenzierung von Exon 2 und 3 erfolgte trotz mehrmaligen Versuchen mit unterschiedlichen Bedingungen nur unvollständig, so dass diese Teile des Gens nur teilweise untersucht werden konnten. Die Ursache dafür könnte im GC-Reichtum der untersuchten Sequenzen liegen. Die Sequenzierung der vollständigen genomische

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Sequenz von PITX3 sollte vorgenommen werden, um möglicherweise Polymorphismen zu finden, die mit dem CAT-Phänotyp beim Deutschen Pinscher gekoppelt sind.

Auch die Analyse von cDNA des PITX3-Gens wäre ein weitere Ansatz. Hierfür müsste allerdings Linsengewebe von erkrankten Tieren gesammelt werden, das momentan leider nicht zur Verfügung steht.

CHAPTER 9

Appendix

Appendix

Laboratory paraphernalia:

A . Equipment

A.1. Thermocycler

PCT-100^TM Programmable Thermal Controller (MJ Research, Watertown, USA) PCT-100^TM Peltier Thermal Cycler (MJ Research, Watertown, USA)

PCT-200^TM Peltier Thermal Cycler (MJ Research, Watertown, USA) Biometra Professional Thermocycler (Biometra, Göttingen, Germany)

A.2. Automated sequencers

LI-COR Gene Read IR 4200 DNA Analyzer (LI-COR Inc., Lincoln, NE, USA) LI-COR Gene Read IR 4300 DNA Analyzer (LI-COR Inc., Lincoln, NE, USA) MegaBACE 500 (Amersham Biosciences, Freiburg, Germany)

A.3. Centrifuges

Sigma centrifuge 4-15 (Sigma Laborzentrifugen GmbH, Osterode, Germany) Desk-centrifuge 5415D (Eppendorf, Hamburg, Germany)

Speed Vac^® Plus (Savant Instruments, Farmingdale, NY, USA)

A.4. Agarose gel electrophoresis and pulsed field gel electrophoresis

Electrophoresis chambers OWL Separation Systems, Portsmouth, NH, USA

Biometra, Göttingen, Germany

BioRad, München, Germany

Generators 2301 Macrodrive 1 (LKB, Bromma, Sweden) Gel document system BioDocAnalyze 312 nm, Göttingen, Germany

A.5. Pipettes

Multipipette^® plus (Eppendorf AG, Hamburg, Germany)

pipetus^®-akku (Hirschmann^® Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germany)

Pipetman^® (P2, P10, P100, P200, P1000) (Gilson Medical Electronics S.A., le-bel, France)

Pipettor^®, Multi 12 Channel (0.1 – 10 µl) (Micronic^® systems, Lelystadt, The Netherlands)

12 Channel Manual Pipettor (0.5 – 10 µl) (Matrix Technologies Corporation,

Cheshire, UK)

12 Channel Manual Pipettor (25 – 200 µl) (Matrix Technologies Corporation,

Cheshire, UK)

8-channel gel loading syringe (Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz, Switzerland)

A.6. Others

Milli-Q biocel water purification systems (Millipore GmbH, Eschborn, Germany) Incubator VT 5042 (Hereaus, Osterode, Germany)

UV-Illuminator 312 nm (Bachhofer, Reutlingen, Germany) B. Kits

B.1. Isolation of DNA

QIAamp 96 DNA Blood Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)

NucleoSpin Kit 96 Blood Qiuck Pure Kit (Macherey-Nagel, Düren, Germany)

B.2. DNA amplification

GenomiPhi ^TM DNA Amplification Kit (GE Healthcare, Freiburg, Germany)

B.3. Preservation of DNA

RNAlater Solution (Qiagen, Hilden, Germany) B.4. Isolation of RNA

Nucleospin RNA II-Kit (Macherey-Nagel, Düren, Germany)

Appendix

B.5. DNA purification

Montagne PCR96 Cleanup Kit (Millipore GmbH, Eschborn, Germany) MinElute^R 96 UF Plate (QIAGEN, Hilden, Germany)

AutoSeq^TM 96 Plate (GE Healthcare, Freiburg, Germany)

B.6. Sequencing

DYEnamic-ET-Terminator Cycle Sequencing Kit (GE Healthcare, Freiburg, Germany)