Erzeugung von Plbd1- und Plbd2-defizienten Mausmodellen

Nachdem die Funktionalität der erstellen CRISPR-Guides in Zellkultur gezeigt werden konnte, wurden die Guide-RNAs Plbd1-GuideB und Plbd2-GuideB mit den zugehörigen repair-templates für die Erzeugung der knockout-Mausmodelle verwendet. Die Guide-RNAs wurden in einen Expressionsvektor kloniert und zur Injektion in murine Zygoten an PD Dr. Irm Hermans-Borgmeyer, ZMNH/UKE Hamburg geschickt. Von den Tieren, die sich aus den behandelten Zygoten entwickelten, wurde Biopsiematerial entnommen und genotypisiert.

Abbildung 49: Sequenz des Plbd2-GuideB Inserts für den pUC57-Vektor.

Schematisch dargestellt ist die Sequenz der Restriktionsschnittstelle im Vektor pUC57 nach Verdau mit BsaI sowie die Sequenz des Inserts von Plbd2-GuideB. Neben der 20 nt Guidesequenz sind die 5‘-Überhänge in Blau und das für den Transkriptionsstart benötigte Guanin in Rot dargestellt.

Während bei der Anwendung der CRISPR-Konstrukte in der Zellkultur ein Plasmid eingesetzt wurde, von dem die mRNA der Cas9-Endonuklease und die single-guide (sg)-RNA transkribiert werden konnte, wurde in die Zygote zur Erzeugung der knockout-Mausmodelle direkt die entsprechende RNA injiziert. Um die sgRNA in vitro zu transkribieren, wurden die ausgewählten RNAs in einen pUC57-Expressionsvektor (Shen et al., 2014) kloniert, in dem 5‘ der Guide-RNA eine T7-Promotorsequenz lokalisiert ist. Die Insertion der Guide-Guide-RNA vor die tracrGuide-RNA im Vektor-Rückgrat erfolgte über BsaI-Schnittstellen, die wie das BbsI im Vektor PX459 5‘-Überhänge erzeugte. Um die Guide-RNAs in die Schnittstelle zu klonieren, wurde ein sense-Strang mit einem 5‘-TAGG-Überhang verwendet. Der antisense-Strang musste wie auch im PX459 mit einem 5‘-AAAC-Überhang versehen werden. Der Transkriptionsstart des T7-Promotors liegt bei dem ersten Guanin nach der Promotorsequenz (Weston et al., 1997), welches durch den 5‘-Überhang im sense-Strang gegeben war. Das Anfügen eines zusätzlichen Guanin wäre für die Transkription aus dem pUC57-Vektor somit nicht nötig gewesen, wurde jedoch beibehalten, um die für den PX459-pUC57-Vektor erstellten antisense-Stränge weiter verwenden zu können. Die Sequenz des geschnittenen pUC57-Vektors und des Inserts sind beispielhaft für Plbd2-GuideB in Abbildung 49 gezeigt.

Die erzeugten Vektoren wurden durch den Kooperationspartner mit DraI linearisiert und über Phenol-Behandlung und DNA-Fällung gereinigt. Die sgRNAs wurde in vitro transkribiert und mit in vitro transkribierter Cas9-mRNA und den repair-templates bei jeweils 10 ng/µL in den Vorkern von befruchteten Oozyten aus C57Bl6/J-Mäusen (Jax Stock 000664) injiziert. Die Oozyten wurden in den Eileiter von scheinschwangeren Ammentieren transplantiert und ausgetragen. Zur Genotypisierung wurden Schwanzspitzenbiopsien der Tiere nach Bielefeld übersandt.

Vektor 20 nt Guide-Sequenz Vektor

...CACTA-3‘ 5‘-TAGGGCTGCTGCTGGACGCCGCGTC-3‘ 5‘-GTTTTAGAG...

||||| |||||||||||||||||||| |||||

...GTGATATCC-5‘ 3‘-CGACGACGACCTGCGGCGCAGCAAA-5‘ 3‘-ATCTC...

Da das Auftreten zweier identischer Mutationen auf beiden Allelen bei der Reparatur der induzierten Doppelstrangbrüche durch NHEJ statistisch unwahrscheinlich ist, wurde die Analyse auf zufällige Mutationen durch PCR-Amplifikation der relevanten Genabschnitte und Verdau mit T7EN durchgeführt. Würde ein Allel oder beide Allele Mutationen aufweisen, so sollten sich nach reannealing der PCR-Amplifikate Fehlpaarungen bilden, die durch die T7EN geschnitten würden und im Agarosegel nachweisbar wären. Im Fall einer Reparatur anhand injizierter repair-templates, könnten über HDR auf beiden Allelen die gleiche Mutation erzeugt werden, die über die eingeführten XbaI-Schnittstellen jedoch ebenfalls identifizierbar wären.

Die Genotypisierung der Tiere Nr. 81, 82 und 83 ist beispielhaft in Abbildung 50 gezeigt. Bei dem Verdau der PCR-Amplifikate des Plbd1-Genabschnittes konnte nach Behandlung mit T7EN für Tail 81 eine Bande nachgewiesen werden (Abbildung 50A), die in unbehandelten Amplifikaten nicht auftrat. Die Bande lag etwa auf derselben Höhe im Agarosegel wie die Bande des Spaltproduktes der biologischen Kontrolle in N2a-Zellen und resultierte somit höchstwahrscheinlich aus einer Mutation in dem mit dem Plbd1-GuideB adressierten Genabschnitt. Wie in Abbildung 50B zu erkennen ist, traten bei dem Verdau der PCR-Amplifikate des Plbd2-Gens neben der ungeschnitten Bande bei 690 bp keine zusätzlichen Fragmentbanden auf.

Abbildung 50: Agarosegel der Genotypi-sierung von putativen Plbd1- und Plbd2-knockout Tieren.

Die genomische DNA aus Schwanzspitzen-Biopsien (Tail) von drei transgenen Mäusen wurde extrahiert und die relevanten Genbereiche über PCR amplifiziert. 150 ng der Amplifikate wurden mit XbaI oder nach reannealing mit T7EN verdaut und über Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Als biologische Kontrolle dienen Amplifikate aus N2a-Zellen, die wie in Abschnitt 4.4.2 beschrieben mit den PX459-Konstrukten transfiziert wurden. Die Abbildungen wurden an den gestrichelten Linien geschnitten.

A 442 443 444 445 446 447 448 449 450 451 452 453 454 455 456 457 458 459 460 WT-Allel: G G G G A C G C C

T T A A

C C T G

A G C C

G T G A

C C T T

A 2.Allel:

forward

B 442 443 444 445 446 447 448 449 450 451 452 453 454 455 456 457 458 459 460 WT-Allel: G

G G G G

A G C A

G C C G

T C

A C T A C G G C T A C T

2.Allel:

reverse

Abbildung 51: Pherogramm der Sequenzierung der Mutation im Plbd1-Tier 81.

Der genomische DNA-Abschnitt im Plbd1-Gen, der von dem erstellten Plbd1-GuideB adressiert wird, wurde aus der Schwanzspitzen-Biopsie des Plbd1-Tier 81 über PCR amplifiziert und mit Primern vom 5‘-Ende (forward) oder dem 3‘-Ende (reverse) sequenziert (Sequencing Core Facility, CeBiTec, Universität Bielefeld). Die Sequenz eines WT-Allels konnte annotiert werden, die Nummerierung entspricht der Position der Basen in der resultierenden mRNA. In der foward-Sequenz (A) treten ab Base 450 überlagernde Signale auf, in der reverse-foward-Sequenz (B) ab Base 449.

Das PCR-Amplifikat des Plbd1-Genabschnitts von Tier 81 wurde mit Primern vom 5‘-Ende (forward) oder dem 3‘-Ende (reverse) sequenziert. Die resultierenden Pherogramme und die Zuordnung der Nukleotide sind in Abbildung 51 gezeigt. In den Pherogrammen war die Plbd1-WT-Sequenz zu erkennen, bis in der forward-Sequenzierung ab der Base 450 eine Überlagerung von zwei Signalen auftrat. In der reverse-Sequenzierung trat die Überlagerung ausgehend vom 3‘-Ende dem entsprechend ab Base 449 auf. In der Sequenzüberlagerung war neben den Signalen eines WT-Allels die gleiche Sequenz mit einer Verschiebung von zwei Nukleotiden zu erkennen. Die Verschiebung im zweiten Allel resultierte somit aus einer Insertion von zwei Nukleotiden zwischen den Basen 449 und 450, die in der Sequenzierung als zusätzliche Thymin- und Adenin-Basen identifiziert werden konnten. Um die Sequenzierung der einzelnen Allele zu bestätigen, wurden die PCR-Amplifikate in einen pCRII-TOPO-Vektor kloniert, in E.coli-DH5 transformiert und durch Sequenzierung der so isolierten einzelnen Allele die Insertion der TA-Nukleotide bestätigt. Die Insertion von zwei Nukleotiden in Exon 2 des Plbd1-Gens führt bei der Translation der resultierenden mRNA zu einer Verschiebung des Leserasters, die ab Aminosäure 68 nach dem Translationsstart zu missense-Mutationen führt und nach weiteren 65 Aminosäuren mit einem artifiziellen Stopcodon in Exon 3 endet.

Nach der Injektion des PX459-Plbd1-GuideB und des PX459-Plbd2-GuideB mit den entsprechenden repair-templates in murine Oozyten konnte nur in einem von 83 geborenen Tieren eine Mutation des Plbd1 festgestellt werden, keines der Tiere trug Mutationen im Gen des Plbd2. Um die geringe Effizienz des verwendeten Plbd2-Guides in den Oozyten zu umgehen, wurde auf die übrigen vorhandenen Plbd2-Guides C, D und E zurückgegriffen. Die Guide-RNAs wurden wie zuvor beschrieben in den pUC57-sgRNA-Expressionsvektor kloniert, in vitro transkribiert und mit

Cas9-mRNA und dem repair-template der Guides D und E in die Vorkerne von befruchteten Oozyten injiziert. Es wurden 13 Tiere geboren und auf Mutationen analysiert (Abbildung 52). Um heterozygote Mutationen nachzuweisen, wurden die PCR-Amplifikate der genomischen Bereiche mit T7EN verdaut. Damit auch homozygote Mutationen nachgewiesen werden können, die möglicherweise durch die Verwendung des repair-templates entstanden waren, wurden die Amplifikate mit 50 % WT-DNA-Amplifikaten zum reannealing eingesetzt und somit Fehlpaarungen für die Spaltung der T7EN erzeugt.

Abbildung 52: Agarosegel der Genotypisierung von putativen Plbd2-knockout Tieren.

Die genomische DNA aus Schwanzspitzen-Biopsien (Tail) von putativen Plbd2-knockout-Mäusen wurde wie beschrieben extrahiert und die relevanten Genbereiche über PCR amplifiziert. 150 ng der PCR-Amplifikate oder 150 ng mit 50 % WT-DNA-Amplikon wurden nach reannealing mit T7EN verdaut und über Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Die gestrichelten Linien dienen der Übersichtlichkeit.

Wie in Abbildung 52 zu sehen, unterschied sich das Bandenmuster der PCR-Amplifikate nach T7EN-Verdau bei Tail 5, 9, 10 und 13 nicht von dem der WT-Amplikons. Für alle übrigen Amplifikate waren nach T7EN-Behandlung Fragmentbanden zu detektieren, die auf das vorliegen von Mutationen hindeuteten. Um die vorliegenden Mutationen zu charakterisieren, wurde sowohl der genomische Abschnitt um Exon 5, als auch um Exon 1 durch Sequenzierung untersucht. Der codierende Bereich für das aktive Zentrum des Proteins in Exon 5 wurde von den Plbd2-Guides D und E adressiert, der Plbd2-Guide C adressierte das Exon 1. Die Mutationen der genomischen DNA wurden analog zu der in Abbildung 51 dargestellten Methode identifiziert und sind in Tabelle 23 aufgeführt.

Tabelle 23: Mutationen im Plbd2-Gen von knockout-Mäusen.

Die PCR-Amplifikate der 13 Tiere mit potentiellen Plbd2-Mutationen wurden durch Sequenzierung überprüft. Zwei Tiere trugen Deletionen im Exon 1, zehn Tiere trugen Mutationen im Bereich der für das aktive Zentrum um Cystein249 codiert, drei Tiere trugen keine Mutationen in den untersuchten Genabschnitten.

Exon 1 Exon 5

Tier 1 - 8 nt Cys249 deletiert, Stopp nach 10 AS Tier 2 - 9 nt Cys249 deletiert, "knock-in"-Mutation Tier 3 - 4 nt Cys249 deletiert, Stopp nach 140 AS Tier 4 - 12 nt Cys249 deletiert, S250 noch intakt

Tier 5 WT

Tier 6 - 8 nt Mosaike, Stopp nach 13 AS

Tier 7 - 3 nt Deletion Val, Mutation Asp zu Glu - 17 nt Cys249 deletiert, Stopp nach 8 AS Tier 8 - 16 nt Stoppcodon nach 17 AS - 4 nt Stopp nach 140 AS

Tier 9 ? Mutation, durch Mosaike nicht zu erkennen

Tier 10 WT

Tier 11 - 8 nt Cys249 deletiert, Stopp nach 140 AS

Tier 12 - 33 nt Cys249 intakt

Tier 13 WT

Wie in Tabelle 23 aufgeführt ist, konnte bei 2 der 13 untersuchten Tiere eine Mutation im Exon 1 des Plbd2-Gens identifiziert werden, was einer Mutationsrate von 15 % für den Guide C entspricht. Im Exon 5 wiesen 10 der 13 Tiere Deletionen auf, wobei die Deletion von 17 Nukleotiden bei Tier 7 an der vorausgesagten Spaltstelle des Guides D lag, die Deletion von 33 Nukleotiden bei Tier 12 schloss die Schnittstellen von Guide D und E ein. Die übrigen kleineren Mutationen (4 – 12 Nukleotide) lagen an der vorausgesagten Spaltstelle des Guide E. Die Effizienzen der Guides in Exon 5 lagen somit bei 2/13 (15 %) für Guide D und 9/13 (69 %) für Guide E. Zur Erhaltung der Zuchten wurde das Tier Nr. 81, das eine Insertion im Exon 2 des Plbd1-Gens trägt, sowie die Plbd2-Tiere Nr. 1, 2, 6, 7 und 8 in die zentrale Tierhaltung der Universität Bielefeld überführt.

Mittels CRISPR-Cas9 konnten Mausmodelle erzeugt werden, die Mutationen in den Genen für Plbd1 oder Plbd2 tragen. Während die verwendeten Guide-RNAs bei Vorversuchen in Zellkultur eine gute Mutationsrate aufwiesen, konnten bei der Verwendung in murinen Oozyten abweichende Effizien-zen beobachtet werden. Die ursprünglich ausgewählten sgRNAs hatten in der Maus einen geringen (Plbd1-GuideB 1/83 Tieren, 1,2 %) oder keinen (Plbd2-GuideB 0/83 Tieren) Effekt. Durch die Injektion einer Kombination aus drei sgRNAs gegen das Plbd2-Exon 1 und Exon 5 konnte eine Mutationsrate von 77 % (10/13 Tieren) erzielt werden.

4.4.4 Etablierung von Plbd1- und Plbd2-defizienten Inzuchtstämmen