Anhand der in Kapitel 4.3 und 4.4 beschriebenen Ergebnisse mit IKKβ(hep)-/- Mäusen wurde ein pharmakologischer IKKβ-Inhibitor (FRELIN et al., 2003) im Hinblick auf seine Wirkung analog zu den bisher beschriebenen Experimenten in akuten Schädigungsmodellen der Leber untersucht. Dazu wurden ebenfalls männliche, 8 bis 10 Wochen alte Mäuse des Stammes Black 6/C57 verwendet. AS 602 868 wurde nach den Angaben des Herstellers in einer Dosis von 100µg/gKG p.o. eingesetzt. Als Kontrolle dienten Wurfgeschwister, denen statt des Pharmakons nur IKKβ-Inhibitorpuffer des gleichen Volumens eingegeben wurde. Die Verabreichung des Inhibitors bzw. -puffers erfolgte 20 und 2 Stunden vor Durchführung der Versuche.
Zunächst wurde analog zu der Behandlung IKKβ defizienter Mäuse sowohl AS 602 868 vorbehandelten Tieren (AS 602 868 Tiere) als auch den mit Inhibitorpuffer
behandelten Tieren (Kontrollen) TNF-α verabreicht. Es wurden 6ng murines TNF-α/g KG in einem Gesamtvolumen von 200µl i.v. injiziert. Im Anschluss daran wurden nach 1, 2, 3 und 6 Stunden Blutproben gewonnen. Eine Messung der Serumspiegel leberspezifischer Enzyme (AST, ALT) ergab weder bei AS 602 868 Tieren noch bei Kontrolltieren einen Anstieg der Werte nach TNF-α Injektion (Abb. 21).
Abbildung 21: Untersuchung leberspezifischer Enzyme (AST/ALT) im Serum TNF-α behandelter AS 602 868 und Kontrolltiere. U/L entspricht der internationalen Einheit der Enzymaktivität Units/Liter.
Um die Wirkung des IKKβ-Inhibitors in entzündlich bedingten, akuten Schädigungen der Leber zu untersuchen, wurde AS 602 868 ebenfalls in der Ischämie/Reperfusion eingesetzt.
Sechs Stunden nach Reperfusion wurde Kontroll- und AS 602 868 Tieren Blut entnommen und die Transaminasen im Serum bestimmt (Abb.22). Es ergaben sich dabei signifikant (p<0,05) niedrigere Serumspiegel sowohl für AST, als auch für ALT in AS 602 868 vorbehandelten Mäusen im Vergleich zu den auf entsprechende Weise operierten Kontrolltieren.
Abbildung 22: Untersuchung der AST-/ ALT-Serumkonzentrationen in Kontroll- und AS 602 868 vorbehandelten Tieren 6 Stunden nach Reperfusion. U/L entspricht der internationalen Einheit der Enzymaktivität Units/Liter. * Kennzeichnung signifikanter Ergebnisse einer einfaktoriellen Varianzanalyse.
Histologische Untersuchungen, die weiteren Aufschluss über das Ausmaß der Leberschädigung geben sollten, korrelierten mit den Transaminasenwerten und ergaben einen deutlichen Unterschied zwischen den beiden Tiergruppen (Kontroll- und AS 602 868 Tieren) in Bezug auf das Ausmaß der Leberschädigung und die Entzündungssymptomatik (Abb. 23 (A)). Hierzu wurden aus den 6 Stunden nach Reperfusion aus AS 602 868 bzw. Kontrolltieren entnommenen Lebern Gewebeschnitte und eine HE-Färbung angefertigt. Eine statistische Auswertung morphologisch-histologisch feststellbarer nekrotischer Areale ergab einen Anteil nekrotisch veränderten Gewebes in AS 602 868 Tieren von ca. 10%, während dieser in Kontrolltieren ca. 40% des gesamten Lebergewebes ausmachte (Abb. 23 (B)). Die Auszählung neutrophiler Granulozyten zeigte mit 10 PMN pro Gesichtsfeld zudem eine deutlich geringere Infiltration des Lebergewebes in AS 602 868 Tieren als in den Kontrollen, wo im Mittel 35 PMN pro Gesichtsfeld bei 40-facher Vergrößerung gezählt wurden (Abb. 23 (C)). Sowohl für die Unterschiede in Bezug auf den Anteil nekrotischen Gewebes, wie auch die Anzahl PMN pro Gesichtsfeld zwischen AS 602 868 vorbehandelten und Kontrolltieren ergaben sich im Rahmen einer einfaktoriellen Varianzanalyse Signifikanzen von p<0,01.
Abbildung 23: Exemplarische Darstellung histologischer Untersuchungen HE gefärbter Gefrierschnitte von Lebern aus Kontroll- und AS 602 868 Tieren 6 Stunden nach I/R (A). Statistische Erfassung der Anzahl neutrophiler Granulozyten pro Gesichtsfeld bei 40-facher Vergrößerung 6 Stunden nach I/R (B). Statistische Erfassung des Anteils nekrotischen Gewebes an dem gesamten Gewebeschnitt 6 Stunden nach I/R. * Kennzeichnung signifikanter Ergebnisse einer einfaktoriellen Varianzanalyse. → Kennzeichnung nekrotischer Areale; P Kennzeichnung von Zentralvenen
5 Diskussion
Der IKK-Komplex steht seit seiner Entdeckung durch DiDonato (DIDONATO et al., 1997) im Zentrum intensiver wissenschaftlicher Forschung. Durch seine entscheidende Funktion bei der Aktivierung von NF-kB hat der IKK-Komplex Einfluss auf die durch NF-kB regulierten Gene (KARIN und BEN NERIAH, 2000) und weckt damit als mögliches Ziel pharmakologischer Interventionen reges wissenschaftliches Interesse. Infolge der Komplexität der NF-kB Regulation und der weitreichenden, in den verschiedensten Zelltypen bisweilen widersprüchlichen Funktionen besteht bis heute Forschungsbedarf in Bezug auf die Zusammenhänge, die zur Aktivierung von NF-kB führen sowie hinsichtlich der NF-kB Funktion in den verschiedensten experimentellen Modellen. Vor allem Daten aus Tiermodellen sind für die Entwicklung gezielter pharmakologischer Therapiemöglichkeiten von Bedeutung.
Das in dieser Arbeit verwendete Mausmodell ermöglichte es, die Funktion einzelner Bestandteile des IKK-Komplexes nicht nur isoliert im Zellkulturmodell, sondern auch im Zusammenhang mit dem Gesamtorganismus zu untersuchen. Mit Hilfe des albuminabhängigen Cre-Promotors konnte darüber hinaus die Funktion von IKKβ im Rahmen der untersuchten Schädigungsmodelle selektiv in Hepatozyten analysiert werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde aufgrund embryonaler Letalität konstitutiver IKKβ bzw. IKKγ Knockoutmodelle (LI et al., 1999a; LI et al., 1999c; RUDOLPH et al., 2000;
SCHMIDT-SUPPRIAN et al., 2000; TANAKA et al., 1999) ein konditionales Knockoutsystem verwendet. Unter Verwendung des Cre-lox-Systems, d.h. der albuminabhängigen (KELLENDONK et al., 2000) bzw. interferonabhängigen (KUHN et al., 1995) Expression der Cre-Rekombinase, wurde ein Gendefekt erzeugt. Die effiziente Deletion von IKKβ bzw. IKKγ bestätigten sowohl DNA-, RNA- als auch Proteinuntersuchungen des Lebergewebes (Abb. 5 (A) bis (H)). Eine durchgeführte Sequenzanalyse des deletierten IKKβ-Allels erbrachte zwar Hinweise auf zwei potentielle Restproteine, doch konnte diesen mit Hilfe einer Datenbankrecherche keine bekannten funktionellen Domänen zugeordnet werden. Es war folglich möglich die Rolle von IKKβ bzw. IKKγ für die Funktionalität des IKK-Komplexes und die
Auswirkungen der Deletion dieser Gene auf die Aktivierung von NF-kB im adulten Tier zu untersuchen.
Die allgemeine Entwicklung (Größe und Gewicht), Fruchtbarkeit und Lebensdauer der IKKβ defizienten Tiere ließ analog zu den Beobachtungen anderer Arbeitsgruppen (MAEDA et al., 2003) keinen Unterschied zu ihren für alle Versuche als Kontrollen verwendeten Geschwistern ohne Gendefekt erkennen.
Zunächst wurde der Frage nachgegangen, ob sich der IKK-Komplex ohne die fehlenden Komponenten IKKβ bzw. IKKγ bilden kann. Andere Arbeitsgruppen hielten IKKγ auch deshalb für die Funktion des IKK-Komplexes für wesentlich, weil vermutet wurde, dass es IKKα und IKKβ nach Stimulation durch TNF-α bzw. IL-1 in den IKK-Komplex rekrutiert (MAKRIS et al., 2000; ROTHWARF et al., 1998; RUDOLPH et al., 2000; YAMAOKA et al., 1998). Diese Hypothese konnte allerdings bislang nicht verifiziert werden. Durch Immunopräzipitation (FAN et al., 2004) wurde im Rahmen dieser Arbeit nun nachgewiesen, dass sich sowohl im Falle eines IKKβ-, als auch eines IKKγ-Defekts die verbliebenen Komplexbestandteile formieren (FAN et al., 2004), (C), (D)). Außerdem konnte festgestellt werden, dass IKKα-IKKγ-Komplexe nach TNF-α Stimulation nicht vermehrt entstehen (FAN et al., 2004)), dieser Komplex scheint vielmehr auf einem konstitutiven Niveau vorzuliegen.
In weiteren Untersuchungen sollten die Auswirkungen der einzelnen Gendefekte (IKKβ bzw. IKKγ) im Rahmen einer definierten Aktivierung des NF-kB Signalweges durch einen spezifischen Stimulus (TNF-α) erforscht werden. TNF-α führt über die Bindung an TNF-Rezeptor1 (TNFR1) und die Aktivierung des IKK-Komplexes zur Aktivierung von NF-kB. Gleichzeitig aktiviert TNF-α Caspasen, die zu einer Apoptose der Zielzelle führen. NF-kB induziert in diesem Modell die Expression antiapoptotischer Gene (c-IAP1, c-IAP2, TRAF1, TRAF2 (CHU et al., 1997; WANG et al., 1998) und XIAP (WU et al., 1998)), die für Caspase Inhibitoren kodieren und so Apoptose verhindern sollen (BARKETT und GILMORE, 1999). Eine fehlende Aktivierung NF-kB abhängiger Gene nach TNF-Stimulation resultiert daher in massiver Apoptose. In früheren Untersuchungen wurde dies anhand zeitgleicher Applikation von TNF-α und D-Galactosamin, einem unspezifischen Transkriptionsinhibitor, gezeigt (BRADHAM et al., 1998; DECKER und KEPPLER,
1974). Die Bestimmung leberspezifischer Enzyme (Transaminasen: AST, ALT) im Serum TNF-α behandelter Mäuse ergab ausschließlich in IKKγ-/- Tieren einen massiven Anstieg der Werte. Infolgedessen starben alle IKKγ-/- Tiere innerhalb von vier Stunden nach TNF-α Applikation, während sowohl die Transaminasenwerte als auch das Überleben der IKKβ defizienten Tiere sowie der Kontrolltiere von der TNF-α Stimulation unbeeinflusst waren (Abb. 7). Für die massive Schädigung der Leber IKKγ defizienter Tiere konnten die Aktivierung apoptotischer Faktoren, wie aktivierte Caspase 3 (JAESCHKE et al., 1998) (Caspase 3 Assay; Abb. 8) und Fragmentierung nukleären Chromatins (KONAT, 2002) (TUNEL Assay; Abb. 9) verantwortlich gemacht werden. Die durch den Anstieg der Transaminasen festgestellte massive Schädigung der Leber konnte somit eindeutig auf apoptotische Vorgänge zurückgeführt werden.
Als mögliche Ursache der Apoptose wurden die Funktionalität des IKK-Komplexes und die damit verbundene Regulation des Transkriptionsfaktors NF-kB untersucht.
Die Aktivierung des IKK-Komplexes durch TNF-α Stimulation resultiert in I-kBα Phosphorylierung, woraufhin dieses ubiquitiniert und degradiert wird (KARIN und BEN NERIAH, 2000; TAN et al., 1999; TRAENCKNER et al., 1995). NF-kB wird aus dem Komplex mit dem inhibitorischen Protein (I-kB) freigesetzt und gelangt aufgrund seiner nukleären Lokalisationssequenzen (NLS) in den Zellkern, wo es an spezifische DNA-Sequenzen bindet und die Transkription seiner Zielgene induziert (MERCIE et al., 1998). Die Phosphorylierung und Degradierung von I-kBα wurde dementsprechend durch Western Blot Analysen und die Aktivierung und nukleäre Translokation von NF-kB durch EMSA untersucht. Entgegen allgemeiner Erkenntnisse (LI et al., 1999a; LI et al., 1999c; MAEDA et al., 2003; SCHWABE et al., 2001) wurde dabei festgestellt, dass sowohl die Phosphorylierung und Degradierung von I-kBα (Abb. 10 (A), (B)) als auch die Aktivierung von NF-kB (Abb.
11 (A), (B)) im Lebergewebe IKKβ defizienter Tiere uneingeschränkt funktionierte.
IKKγ-/- Tiere zeigten im Gegensatz dazu keine I-kBα Phosphorylierung und Degradierung und ebenso keine NF-kB Aktivierung. Folglich ist für die TNF-α induzierte NF-kB Aktivierung in Hepatozyten adulter Mäuse IKKβ, im Gegensatz zu IKKγ, nicht essentiell. Die Funktion von IKKβ wurde sowohl in
hepatozyten-spezifischen (AlbCre: Abb. 11 (A)) als auch in exogen induzierbaren (MxCre: Abb. 11 (B)) Knockoutmodellen untersucht. Unterschiede aufgrund der Verwendung verschiedener Knockoutsysteme können somit ausgeschlossen werden. Zusätzlich wurde die Aktivierung von NF-kB in primären Hepatozytenkulturen untersucht. Auf diese Weise konnten systemische bzw. durch nicht-parenchymatöse Zellen in der Leber verursachte Nebeneffekte ausgeschlossen werden und gleichzeitig anhand der durchgeführten Experimente mit IKKγ-/- Tieren die Hypothese widerlegt werden, nach der eine fehlende NF-kB Aktivierung nach TNF-α Stimulation nicht zu Apoptose führt. Maeda und Mitarbeiter zogen diese Schlussfolgerung aus Versuchen mit IKKβ defizienten Mäusen, denen sie LPS applizierten (wodurch es zu einer Freisetzung endogenen TNF-α kommt), wobei sie keine NF-kB Aktivierung aber auch keine Leberschädigung oder Apoptose festgestellt hatten (MAEDA et al., 2003). In dieser Arbeit konnte jedoch anhand der verwendeten IKKγ-/- Tiere bewiesen werden, dass TNF-α in Kombination mit fehlender NF-kB Aktivierung zu massiver Leberzellapoptose und einem dramatischen Anstieg leberspezifischer Enzyme im Serum verbunden mit letalem Verlauf führt.
Eine weitere Funktion des IKK-Komplexes, die Phosphorylierung des zur NF-kB Familie gehörenden Rel A an Serinrest 536 (MERCURIO et al., 1997; MERCURIO et al., 1999; SAKURAI et al., 1999; SCHWABE et al., 2001), wurde mit Hilfe eines Kinase Assays untersucht. Das Ergebnis belegt, dass die Induktion der Rel A Phosphorylierung unabhängig von IKKγ, jedoch abhängig von IKKβ erfolgt (Abb. 10 (C)). In IKKβ-/- Tieren konnte durch TNF-α Stimulation keine Rel A Phosphorylierung induziert werden. Zwar hatten bereits andere Arbeitsgruppen IKKβ mit der Phosphorylierung von Rel A in Verbindung gebracht (SAKURAI et al., 1999;
SCHWABE et al., 2001), aber es überraschte, dass diese unabhängig von IKKγ erfolgen kann. Die Funktion der Phosphorylierung des Rel A ist noch nicht eindeutig geklärt, wird aber mit der Induktion transkriptioneller Aktivität der NF-kB Familie in Verbindung gebracht (SCHMITZ et al., 1995; VANDEN BERGHE et al., 1998; WANG und BALDWIN, Jr., 1998). Aus der Familie der NF-kB Transkriptionsfaktoren besitzen nur Rel A und cRel potentielle Transaktivierungsdomänen, wobei aktiviertes Rel A als einziger Faktor nicht durch ein anderes Mitglied der Familie ersetzt werden
kann (BEG et al., 1995). Die Regulation der transkriptionellen Rel A Aktivität könnte daher eine entscheidende Rolle für die Aktivierung NF-kB abhängiger Gene spielen (SCHMITZ und BAEUERLE, 1991). Zumindest auf die Regulation antiapoptotischer Gene trifft dies, ausgehend von den in dieser Arbeit erhobenen Befunden, jedoch nicht zu. Anhand der Ergebnisse IKKγ defizienter Tiere konnte gezeigt werden, dass eine fehlende Aktivierung antiapoptotischer Gene in dem hier untersuchten Zytokinmodell (TNF-α) unzweifelhaft zu massiver Apoptose führt. Aufgrund fehlender NF-kB Aktivierung war keine Regulation NF-kB abhängiger Zielgene möglich, was zu stark erhöhten Leberenzymen (Abb. 7 (C)), Apoptose (Abb. 8, 9) und zum Tod der Tiere führte (Abb. 7 (D)).
Die bisher beschriebenen Differenzen zu Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen im Hinblick auf die Funktion von IKKβ für die zytokininduzierte NF-kB Aktivierung sollten durch weiterführende Untersuchungen näher charakterisiert werden. Den Forschungen liegen verschiedene Untersuchungsansätze zugrunde. Zum Einen können zellartspezifische Unterschiede bei der Aktivierung von NF-kB von Bedeutung sein, da alle bisherigen Erkenntnisse fast ausschließlich nicht in Hepatozyten, sondern in B-Zellen (LI et al., 2003b; PASPARAKIS et al., 2002a), epidermalen Keratinozyten (PASPARAKIS et al., 2002b), primären Fibroblasten (AUPPERLE et al., 2001) oder murinen embryonalen Fibroblasten (MEF) (SCHMIDT-SUPPRIAN et al., 2000) gesammelt worden sind. Zum Anderen führten andere Arbeitsgruppen ihre Untersuchungen an transfizierten (DELHASE et al., 1999) oder mit Adenovirus infizierten (SCHWABE et al., 2001) Zellen durch. Schwabe und Mitarbeiter isolierten für ihre Studie primäre Hepatozyten aus Ratten, in die mit Hilfe adenoviralen Gentransfers mutierte Komponenten des IKK-Komplexes eingeschleust wurden. Die Mutationen waren dabei in der Kinasedomäne des jeweiligen Enzyms vorgenommen worden. Durch eine etwa 50-fache Überexpression des mutierten Enzyms (IKKαK44M bzw. IKKβK44M) sollte das endogene, intakte Enzym aus dem IKK-Komplex verdrängt werden. Ergebnis der Untersuchungen waren sowohl ein deutlicher Defekt der NF-kB Aktivierung und Phosphorylierung als auch eine fehlende I-kBα Phosphorylierung und Degradierung in IKKβK44M bildenden Hepato-zyten nach TNF-α Stimulation. IKKαK44M exprimierende HepatoHepato-zyten zeigten
dagegen nur eine leichte Abschwächung im Vergleich zu anderen mit Kontrollvirus infizierten Hepatozyten. Schwabe und Mitarbeiter schlussfolgerten daraus, dass IKKβ für die zytokinabhängige Aktivierung von NF-kB essentiell sei. Zur Klärung der Widersprüche zu den hier vorgelegten Daten stellte Dr. Schwabe freundlicherweise den von ihm verwendeten Adenovirus (Ad5IKKβdn) zur Verfügung. Auf diese Weise war es möglich, das hier eingesetzte Knockoutsystem direkt mit der Expression einer kinaseinaktiven IKKβ Mutante zu vergleichen. Eine Western Blot Untersuchung bewies vorab den Erfolg der Infektion mit Ad5IKKβdn, indem sie eine deutliche IKKβ-Überexpression in den mit Ad5IKKβdn infizierten Hepatozyten aufzeigte (Abbildung 9 (A)). Durch den Nachweis von IKKβ-IKKγ-Komplexen (Immunopräzipitation) auch in IKKβ defizienten Hepatozyten wurde deutlich, dass adenovirales IKKβ an IKKγ binden konnte. Ein NF-kB EMSA nach TNF-α Stimulation ergab analog zu den Daten der Arbeitsgruppe Schwabe und Mitarbeiter eine fehlende NF-kB Aktivierung in mit Ad5IKKβdn infizierten Hepatozyten (Abbildung 10). Zellen, die mit dem Kontrollvirus (Ad5β-Gal) infiziert worden waren bzw. nicht infizierte Hepatozyten aktivierten NF-kB uneingeschränkt. Dabei ist die Tatsache, dass, unabhängig von ihrem Genotyp, ausschließlich die mit Ad5IKKβdn infizierten Hepatozyten einen Defekt in der Aktivierung von NF-kB zeigten, besonders hervorzuheben. Mit diesen Analysen konnte bewiesen werden, dass ein genetischer IKKβ Defekt andere Auswirkungen auf die Funktionalität des IKK-Komplexes hat, als die Überexpression eines dominant negativen Moleküls. Der IKK-Komplex ist demnach in Hepatozyten adulter Mäuse unabhängig von IKKβ funktionsfähig und bewirkt zytokininduziert (TNF-α oder IL-1) eine Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kB, was wiederum verbunden ist mit einem ausreichenden Schutz der Zelle vor Apoptose. Im Gegensatz zu seiner essentiellen Funktion in der Embryonalentwicklung scheint IKKβ für die zytokininduzierte NF-kB Aktivierung bei adulten Tieren ersetzbar zu sein. Für IKKγ gilt jedoch analog zu den bereits bekannten Untersuchungen (ROTHWARF et al., 1998; SCHMIDT-SUPPRIAN et al., 2000; YAMAOKA et al., 1998), dass es auch im adulten Tier für die zytokininduzierte Aktivierung von NF-kB und das Überleben der Zelle essentiell bleibt. Vermutungen über eine vom IKK-Komplex unabhängige NF-kB Aktivierung (PETERS et al., 2000) konnten durch die fehlende NF-kB Aktivierung in
IKKγ-/- Tieren ebenso widerlegt werden. Es wurde deutlich, dass eine zytokininduzierte Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kB in direktem Zusam-menhang mit einem funktionsfähigen IKK-Komplex steht. Die molekularen Mechanismen der IKKγ Funktion für die Aktivierung des IKK-Komplexes sind jedoch weiter ungeklärt. Bislang wird vermutet, dass IKKγ mit außerhalb des IKK-Komplexes liegenden Bestandteilen des Signalweges (IHA et al., 2003), wie z.B. RIP (LI et al., 1999b) oder A20 (ZHANG et al., 2000) interagiert und auf diese Weise die Aktivierung des IKK-Komplexes vermittelt. Diese Vermutung wird gestützt durch Ergebnisse, bei denen ein I-kBα-Kinase-Komplex entdeckt wurde, der in vitro durch Ubiquitinierung aktiviert werden konnte (CHEN et al., 1996) und durch weitere Untersuchungen, die eine parallel zur I-kBα Degradierung (TANG et al., 2003), TNF-α induzierte Ubiquitinierung des IKKγ ergaben. Diese durch cIAP1 vermittelte Ubiquitinierung der Zinkfingerdomäne des IKKγ, die keinen Einfluss auf die Integration von IKKγ in den Kinasekomplex hat und zudem nicht zu einer IKKγ Degradierung führt, induziert vielmehr die Phosphorylierung des IKKβ an Serinrest 181, wodurch es zu einer Aktivierung des IKK-Komplexes kommt (LI et al., 2001;
TANG et al., 2003; YAMAMOTO et al., 2001). Auf diese Weise könnte IKKγ für die Aktivierung des Komplexes verantwortlich sein. Doch auch weitere, dem IKK-Komplex assoziierte Kinasen (NAK, IKKε) phosphorylieren und aktivieren IKKβ (LI et al., 2003a). IKKβ wiederum phosphoryliert IKKγ zytokininduziert an Serinrest 369 und in einer zentralen, noch nicht näher definierten Region des Moleküls (PRAJAPATI und GAYNOR, 2002), wodurch es zu einer negativen Rückkopplung kommt, da sich die aktivierende Wirkung von IKKγ auf IKKβ und den gesamten Kinasekomplex reduziert. Als Gründe für die negative Rückkopplung werden dabei eine veränderte Konformität des IKKγ und daraus resultierend eine reduzierte Oligomerisierungs-fähigkeit mit anderen Proteinen vermutet (POYET et al., 2000). Eine weitere Funktion des IKKγ ist es die Assoziierung von IKKβ und I-kB zu unterstützen (YAMAMOTO et al., 2001). In einem weiteren Experiment zeigen Yamamoto und Mitarbeiter, dass unter Verwendung einer kinaseinaktiven IKKβ-Mutante IKKγ nicht mehr in der Lage ist IkBα an den IKK-Komplex zu binden. In dieser Tatsache könnten die beobach-teten Unterschiede zwischen der Verwendung eines kinaseinaktiven IKKβK44M
Moleküls (SCHWABE et al., 2001) und der Verwendung eines konditionellen Knockoutsystems im Rahmen dieser Doktorarbeit begründet liegen. Es wäre möglich, dass im Modell der zytokininduzierten Apoptose ein nicht vorhandenes IKKβ durch ein anderes Molekül soweit funktionell ersetzt wird, dass eine Aktivierung von NF-kB erfolgt. Ein mutiertes, kinaseinaktives IKKβ Molekül hingegen blockiert die Anlagerung von I-kBα an den IKK-Komplex und verhindert auf diese Weise eine Phosphorylierung mit nachfolgender Degradierung und Freisetzung von NF-kB.
Diese Vermutung wird auch durch die Daten gestützt, die in der vorliegenden Arbeit bei der Verwendung des pharmakologischen IKKβ Inhibitors AS 602 868 erhoben worden sind. Nach Stimulation durch TNF-α ergaben sich keine signifikant erhöhten Transaminasen, die für eine Schädigung der Leber nach Applikation des Inhibitors gesprochen hätten. AS 602 868 blockiert spezifisch die IKKβ Kinasefunktion, durch kompetetive Hemmung der ATP bindenden Domäne (FRELIN et al., 2003). Die spezifische Inhibition des ansonsten intakten IKKβ-Moleküls innerhalb des IKK-Komplexes führt demnach, nach Zytokinstimulation, ebenfalls nicht zu einer verstärkten Apoptose der Hepatozyten. Da keine erhöhten Transaminasen festgestellt wurden, lässt sich im Zusammenhang mit den an IKKβ defizienten Tieren erhobenen Daten schlussfolgern, dass auch die Funktionalität des Kinasekomplexes und die Aktivierung von NF-kB durch AS 602 868 nicht beeinträchtigt wurden. Im Gegensatz dazu hatten Frelin et al in Jurkat Leukämiezellen keine NF-kB Aktivierung nach TNF-α Stimulation festgestellt (FRELIN et al., 2003). Dies unterstreicht die wahrscheinlich von anderen Zellarten differierende Funktion des IKK-Komplexes und seiner Bestandteile für die Regulation der NF-kB Aktivierung in Hepatozyten.
Im Rahmen der Ischämie/Reperfusion (I/R) zeigt sich ein ganz anderes, bislang unbekanntes Bild der Funktion von IKKβ bei der Aktivierung des Transkriptions-faktors NF-kB. In der experimentellen I/R werden Vorgehensweisen simuliert, die bei bestimmten Leberoperationen, wie Resektion von Leberlappen oder Organtrans-plantationen Anwendung finden (KEEFFE, 2001). Bis heute ist die durch I/R vermittelte Schädigung des Organs ein großes Problem und stellt einen den Erfolg einer solchen Operation limitierenden Faktor dar: Nach zunächst erfolgreicher Operation kann es zu Leberversagen mit Todesfolge kommen (GONZALEZ et al.,
1994; HUGUET et al., 1994; LIU et al., 1996a). Insbesondere bei der Transplantation von Leberlappen im Rahmen der Lebendspende spielt die I/R eine große Rolle (STRASBERG et al., 1999). Die Lebendspende, bei der einem lebenden Organspender ein Leberlappen entnommen und einem Empfänger transplantiert wird, wurde entwickelt, um den beschränkten Pool von Organspendern zu erweitern (KEEFFE, 2001; STRASBERG et al., 1999). Allerdings erweist sich die Regeneration des transplantierten Leberlappens oftmals als problematisch. Aufgrund der bei der
1994; HUGUET et al., 1994; LIU et al., 1996a). Insbesondere bei der Transplantation von Leberlappen im Rahmen der Lebendspende spielt die I/R eine große Rolle (STRASBERG et al., 1999). Die Lebendspende, bei der einem lebenden Organspender ein Leberlappen entnommen und einem Empfänger transplantiert wird, wurde entwickelt, um den beschränkten Pool von Organspendern zu erweitern (KEEFFE, 2001; STRASBERG et al., 1999). Allerdings erweist sich die Regeneration des transplantierten Leberlappens oftmals als problematisch. Aufgrund der bei der