Aus dem Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Untersuchungen zur Rolle von IKKβ und IKKγ in akuten Schädigungsmodellen der Leber
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Ulrike Barbara Aßmus
aus Gifhorn
Hannover 2004
Wissenschaftliche Betreuung:
Prof. Dr. med. vet. Achim Gruber, Ph.D.
Prof. Dr. med. Christian Trautwein
1. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Achim Gruber, Ph.D.
Prof. Dr. med. Christian Trautwein
2. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Hassan Y. Naim
Tag der mündlichen Prüfung: 24. November 2004
eingereicht:
LUEDDE*, T; ASSMUS*, U.B; WUESTEFELD*, T; MEYER ZU VILSENDORF, A;
ROSKAMS, T; MANNS, M.P; PASPARAKIS, M; TRAUTWEIN, C (2004):
Deletion of IKKβ in hepatocytes does not sensitize to TNF-α induced apoptosis, but protects from liver injury following hepatic ischemia-reperfusion
JCI. zur Publikation eingereicht
Für meine Eltern und Trevor
In Erinnerung an Kerstin
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 14
2 Literaturübersicht ... 15
2.1 Leberversagen... 15
2.2 Tumor Nekrose Faktor alpha (TNF-α)... 17
2.3 Der Nukleärer Faktor-kappa B (NF-kB)... 20
2.3.1 Strukturelle Eigenschaften von NF-kB... 20
2.3.2 NF-kB Aktivierung... 21
2.3.3 Bedeutung von NF-kB als Transkriptionsfaktor ... 22
2.3.4 Klinische Bedeutung von NF-kB... 24
2.4 Regulation der NF-kB Aktivität durch den IKK-Komplex ... 25
2.5 Leberschädigung induziert durch Ischämie/Reperfusion (I/R) ... 26
2.6 Geninaktivierung in Knockout-Mausmodellen... 27
3 Material und Methoden ... 30
3.1 Material ... 30
3.1.1 Tierexperimentelle Materialien... 30
3.1.1.1 Instrumente ... 30
3.1.2 Zellkulturmaterialien ... 30
3.1.2.1 Bakterienstämme ... 30
3.1.2.2 Medium ... 31
3.1.2.3 Adenoviren ... 31
3.1.3 Enzyme ... 31
3.1.4 Antikörper ... 31
3.1.5 Oligonukleotide und Plasmide ... 32
3.1.6 Allgemeine Materialien ... 32
3.1.7 Chemikalien... 33
3.1.7.1 Radiochemikalien... 35
3.1.9 Geräte ... 36
3.1.9.1 OP-Geräte... 36
3.1.9.2 Zentrifugen... 36
3.1.9.3 Allgemeine Geräte ... 36
3.2 Methoden... 37
3.2.1 Tierexperimentelle Methoden ... 37
3.2.1.1 Allgemeine Haltungsbedingungen... 37
3.2.1.2 Allgemeines zum Knockoutsystem... 38
3.2.1.2.1 Verwendete Mauslinien ... 38
3.2.1.2.2 Induktion der Cre-Rekombinase in vivo... 38
3.2.1.2.3 Zucht und Genotypisierung gentechnisch veränderter Mäuse... 39
3.2.1.3 Applikationstechniken ... 39
3.2.1.3.1 Intravenöse (i.v.) Injektion... 39
3.2.1.3.1.1 Aufbereitung von TNF-α für die i.v.-Injektion ... 39
3.2.1.3.2 Intraperitoneale (i.p.) Injektion ... 39
3.2.1.3.2.1 Aufbereitung von Poly(I)-Poly(C) für die i.p.-Injektion... 39
3.2.1.3.3 Orale (p.o.) Applikation ... 40
3.2.1.3.3.1 Aufbereitung von AS 602 868 für die p.o.-Applikation ... 40
3.2.1.4 Probennahme... 40
3.2.1.4.1 Blutentnahme... 40
3.2.1.4.2 Organentnahme... 40
3.2.1.5 Experimentelle Ischämie/Reperfusion (I/R)... 41
3.2.1.5.1 Versuchsaufbau... 41
3.2.1.5.2 Narkose ... 41
3.2.1.5.3 OP-Technik... 42
3.2.1.6 Primäre Hepatozytenkultur... 43
3.2.2.1 Allgemeine Zellkultur... 45
3.2.2.1.1 Kultivierung von HUH 7 oder 293 Zellen... 45
3.2.2.1.2 Transfektion nach Chen und Okayama ... 45
3.2.2.2 Adenoviren ... 46
3.2.2.2.1 Präparation ... 46
3.2.2.2.2 Infektion ... 47
3.2.3 Rekombinante DNA-Techniken ... 48
3.2.3.1 Plasmidtransformation ... 48
3.2.3.2 DNA-Minipräparation... 48
3.2.3.3 Restriktionsverdau ... 49
3.2.3.4 Lagerung transformierter E.coli-Stämme ... 49
3.2.4 Gewinnung und Untersuchung genomischer DNA ... 50
3.2.4.1 DNA Isolation ... 50
3.2.4.1.1 DNA-Isolation aus Mausschwanzbiopsien... 50
3.2.4.1.2 DNA-Isolation aus Lebergewebe ... 50
3.2.4.1.3 DNA-Isolation aus Zellkultur ... 51
3.2.4.2 Bestimmung der DNA Konzentration ... 51
3.2.4.3 DNA Analysen... 51
3.2.4.3.1 PCR (Polymerase Chain Reaction) ... 51
3.2.4.3.1.1 IKKβ-Genotypisierung ... 51
3.2.4.3.1.2 IKKγ-Genotypisierung... 52
3.2.4.3.1.3 Cre Genotypisierung... 52
3.2.4.3.2 Southern Blot ... 53
3.2.4.3.2.1 Radioaktives Markieren der IKKβ-Sonde ... 54
3.2.5 Isolation und Analyse von RNA ... 55
3.2.5.1 RNA-Isolation ... 55
3.2.5.1.2 RNA-Isolation aus Zellkultur ... 55
3.2.5.2 Bestimmung der RNA Konzentration ... 56
3.2.5.3 RNA Analysen... 56
3.2.5.3.1 Reverse Transcription PCR (RT-PCR) ... 56
3.2.5.3.1.1 Sequenz verwendeter GAPDH Primer ... 57
3.2.5.3.1.2 Nachweis des intakten IKKβ-Allels: ... 57
3.2.5.3.1.3 Nachweis des intakten IKKγ-Allels: ... 58
3.2.6 Isolierung und Aufreinigung von rekombinantem GST-RelA354-551 Protein 58 3.2.7 Proteingewinnung und -untersuchung ... 60
3.2.7.1 Proteinisolation... 60
3.2.7.1.1 Isolation von Gesamtzellprotein... 60
3.2.7.1.1.1 Isolation von Gesamtzellproteinen aus Lebergewebe ... 60
3.2.7.1.1.2 Isolation von Gesamtzellproteinen aus Zellkultur ... 60
3.2.7.1.1.3 Isolation von Gesamtzellproteinen mit NP-40 Lysepuffer... 60
3.2.7.1.1.4 Isolation von Gesamtzellproteinen mit Lysepuffer für Kinase Assays ... 61
3.2.7.1.1.5 Isolation von Gesamtzellproteinen für Caspase 3 Assays mit AFC-Lysepuffer... 62
3.2.7.1.2 Isolation nukleärer Proteine ... 62
3.2.7.1.2.1 Isolation nukleärer Proteine aus Lebergewebe ... 62
3.2.7.1.2.2 Isolation nukleärer Proteine aus Zellkultur... 64
3.2.7.2 Proteinbestimmungen ... 65
3.2.7.2.1 Proteinbestimmung mittels Bradford Assay ... 65
3.2.7.2.2 Proteinbestimmung mittels Optischer Dichte (OD230/260)... 66
3.2.7.3 Proteinanalysen ... 66
3.2.7.3.1 Coomassie-Brilliant-Blue Färbung ... 66
3.2.7.3.2 Western Blot ... 66
3.2.7.3.4 Elektromobilitätsshift Assay (EMSA)... 69
3.2.7.3.4.1 Synthese doppelsträngiger Oligonukleotide ... 69
3.2.7.3.4.2 Radioaktives Markieren doppelsträngiger Oligonukleotide... 70
3.2.7.3.4.3 Radioaktivitätsmessung markierter Oligonukleotide... 70
3.2.7.3.4.4 Gel... 71
3.2.7.3.4.5 Durchführung des EMSA... 71
3.2.7.3.5 Kinase Assay ... 72
3.2.7.3.6 Caspase 3 Assay... 73
3.2.8 Histologische Untersuchungen... 74
3.2.8.1 Präparation von Gefrierschnitten... 74
3.2.8.2 Hämosin/Eosin (HE) Färbung ... 75
3.2.8.3 DAPI-Färbung ... 75
3.2.8.4 TUNEL-Assay ... 75
3.2.8.5 Immunhistochemischer Nachweis von Rel A ... 76
3.2.9 Serologische Untersuchungen ... 77
3.2.9.1 Messung der Aspartat- bzw. Alanin-Amino-Transferase-Aktivitäten ... 77
4 Ergebnisse... 78
4.1 Etablierung konditional inaktivierbarer IKKβ- und IKKγ-Mauslinien ... 78
4.2 Untersuchung des IKK-Komplexes ... 81
4.3 Funktion von IKKβ und IKKγ in der TNF-α induzierten Apoptose ... 83
4.3.1 Einfluss von IKKβ und IKKγ auf die TNF-α vermittelte Apoptose ... 85
4.3.2 Einfluss von IKKβ und IKKγ auf die enzymatische Aktivität des IKK- Komplexes ... 87
4.3.3 Charakterisierung eines kinaseinaktiven IKKβ-Moleküls ... 91
4.4 Funktion von IKKβ in der Ischämie/Reperfusion ... 93
4.5 Erprobung eines chemischen IKKβ-Inhibitors in akuten Schädigungsmodellen der Leber... 101
6 Zusammenfassung ... 119
7 Summary ... 122
8 Literaturverzeichnis... 124
9 Anhang ... 145
9.1 Alignment der IKKβwt und IKKβ-/- cDNA-Sequenz... 145
10 Eidesstattliche Erklärung nach § 3 Abs. 2 Nr. 7 PromO... 148
11 Danksagung... 150
Abkürzungsverzeichnis
A Adenin
Abb. Abbildung
bp Basenpaare
C Cytosin
Cre (engl. Causes Recombination) d Destillata (einfach destilliert)
DNA Desoxyribonukleinsäure (engl. Desoxyribonucleic acid) EMSA Elektromobilitätsshift Assay
et al. Et alii (und andere)
Fa. Firma
FHF Akutes Leberversagen (engl. Fulminant Hepatic Failure)
G Guanin
GAPDH Glyceraldehyde-3-PhosphatDehydrogenase
HE Hämosin Eosin
I-kB Inhibitorisches-kappa B Protein
IKK-Komplex Inhibitorischer kappa B Kinase Komplex IKKβhep-/- Hepatozytenspezifische IKKβ-Deletion IKKβloxP/loxP mit loxP-Sequenzen flankiertes IKKβ-Allel IKKβ-/- Ubiquitäre IKKβ-Deletion
IP Immunopräzipitation
i.p. in die Bauchhöhle (lat. intra peritoneal) I/R Ischämie/Reperfusion
i.v. in die Vene (lat. intra venam)
kb Kilobasen
KG Körpergewicht
Min. Minute
mRNA Boten-Ribonukleinsäure (engl. messenger ribonucleic acid) NF-kB Nukleärer Faktor-kappa B
p.c. nach Konzeption (lat. post conceptionem) p.o. durch den Mund (lat. per os)
PCR Polymeraseketten Reaktion (engl. Polymerase Chain Reaction)
SPF Spezifiziert pathogenfrei TNF-α Tumor Nekrose Faktor-alpha
T Thymin
1 Einleitung
IKKβ und IKKγ bilden zusammen mit IKKα den I-kappaΒ-Kinase-Komplex (IKK- Komplex), dem eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung des Transkriptions- faktors NF-kB zukommt. Während von IKKα bekannt ist, dass es für die Aktivierung von NF-kB keine essentielle Bedeutung hat, scheinen IKKβ und IKKγ hingegen die für die Aktivität des IKK-Komplexes wesentlichen Bestandteile zu sein. Sowohl IKKβ wie auch IKKγ defiziente Mäuse sterben embryonal aufgrund massiver Apoptose der Leberzellen, weshalb davon ausgegangen wird, dass beide Komponenten essentiell für die Aktivierung von NF-kB und dem damit verbundenen Schutz vor zytokin- induzierter Apoptose sind. Ihre Funktion in Hepatozyten adulter Tiere jedoch ist bislang noch nicht geklärt. Zudem wird auch die Rolle von NF-kB, das als Transkriptionsfaktor die Expression inflammatorischer, zellzyklusregulierender und antiapoptotischer Gene beeinflusst, in Bezug auf verschiedene pathophysiologische Zusammenhänge kontrovers diskutiert. Ihm werden im Rahmen akuter Organ- schädigungen sowohl schädigende als auch schützende Effekte zugeschrieben.
Im Rahmen dieser Arbeit sollten deshalb die molekularen Mechanismen der NF-kB Regulation in der Leber unter besonderer Berücksichtigung der Funktionalität des IKK-Komplexes näher untersucht werden. Insbesondere wurde dazu die Funktion von IKKβ bzw. IKKγ für die Aktivierung von NF-kB mit Hilfe konditioneller Gendeletion in Hepatozyten adulter Tiere bestimmt. Mittels TNF-α war es möglich, NF-kB in Reaktion auf einen selektiven Reiz und definierten Signalweg zu aktivieren.
Nach dem heutigen Kenntnisstand resultiert dabei nur ein funktionsfähiger IKK- Komplex in einer Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kB, wodurch Apoptose verhindert wird. Zusätzlich zum zytokinvermittelten Leberversagen wurde hier die Rolle IKKβ/NF-kB abhängiger Signalwege in der durch Ischämie/Reperfusion vermittelten Leberschädigung, wie sie im Rahmen von Leberresektionen oder Lebertransplantationen auftritt, untersucht. Auf Grundlage der gewonnenen Ergebnisse sollte abschließend die Möglichkeit einer pharmakologischen Intervention als potentieller therapeutischer Ansatz beim Leberversagen evaluiert werden.
2 Literaturübersicht 2.1 Leberversagen
Die Leber, das zentrale Stoffwechselorgan des Körpers, erfüllt wichtige metabolische (Kohlenhydrat-, Protein- und Fettstoffwechsel), Synthese- (Glukoneogenese) sowie exkretorische Funktionen (Gallensekretion). Erkrankungen der Leber in Verbindung mit Funktionsstörungen des Organs rufen vielfältige Symptome hervor. Durch das außergewöhnlich hohe Kompensations- und Regenerationsvermögen der Leber wird eine Diagnose zusätzlich erschwert, da erst spät Symptome auftreten. Bis in die heutige Zeit stellen deshalb die frühzeitige Diagnose und effiziente Therapie von Leberfunktionsstörungen Probleme dar. Häufig wird eine Leberschädigung erst in fortgeschrittenem Stadium erkannt (SASS und SHAKIL, 2003).
Akute Schädigungen der Leber können durch Toxine wie z.B. Mykotoxine oder Pharmazeutika wie Paracetamol oder Halothan verursacht werden. Auch Septikämie bzw. Pyämie oder ischämische Hepatitis infolge eines operativen Eingriffes mit Unterbrechung der Blutversorgung des Organs können zu akutem Leberversagen führen. Die Leber hat die Fähigkeit, chronische Organerkrankungen wie Virusinfektionen (z.B. Hepatitis B), Parasitosen (z.B. Fasziolose, Nematodiasis) oder metabolische Störungen (z.B. Fettstoffwechselstörungen) über lange Zeit zu kompensieren. Reicht die Anzahl intakter Hepatozyten jedoch nicht mehr aus, um die Organfunktionen zu erfüllen, kommt es zu akutem Leberversagen. Eine Leberfunktionsstörung kann sich durch unspezifische Symptome wie z.B. Apathie, Inappetenz, Maldigestion, Leistungsminderung oder Photosensibilisierung äußern.
Das auffälligste Symptom, der Ikterus, tritt dagegen nicht zwingend auf. Als spezifischere Symptome treten Aszites, Ödeme oder Gerinnungsstörungen infolge herabgesetzter Leberfunktion auf. Im Endstadium des Leberversagens resultiert die Krankheit im hepatoenzephalen Syndrom (BAUER et al., 2004). Unter diesem Begriff werden alle zentralnervösen Symptome, die aus dem Leberversagen resultieren, zusammengefasst. Im Zuge der gestörten Leberfunktion wird Ammoniak im Rahmen des Proteinstoffwechsels nicht mehr in genügendem Ausmaß in Harnstoff umgewandelt. Es kommt zu einer Anreicherung des zytotoxischen Ammoniaks im
gesamten Körper. Die Blut-Hirn-Schranke passierend schädigt Ammoniak auch das zentrale Nervensystem. Auswirkungen dieser Schädigungen sind Ataxien, Exzitationen, Agressionen und Krämpfe bis hin zum (Leber-)Koma.
Im Hinblick auf die molekularen Grundlagen der Leberschädigung werden zwei unterschiedliche Mechanismen diskutiert. Durch die plötzliche Unterbrechung des Zellstoffwechsels, hervorgerufen z.B. durch Toxine, kommt es zu ATP-Mangel und Dysregulation des Ionenhaushaltes in Verbindung mit dem Anschwellen der Zelle.
Letztlich rupturiert die Zellmembran, wodurch intrazelluläre Proteine, Ionen und Metaboliten freigesetzt werden (LEMASTERS et al., 1999). Dieser als Nekrose bezeichnete Zelluntergang tritt meist in Verbindung mit Entzündungssymptomen (BAUER, 2002) auf.
Als weiterer Mechanismus des Zelluntergangs im Rahmen von Leberversagen wird der programmierte Zelltod (Apoptose) diskutiert. Dieser tritt in physiologischem Zusammenhang während der embryonalen Entwicklung, sowie im Rahmen der Zellmauserung (z.B. Darmepithel) auf. Hierbei kommt es zu geordnetem Zelluntergang ohne Beeinflussung des umliegenden Gewebes. Intrazellulär werden so Signalwege angesprochen, die in der Aktivierung von Caspasen (Cystein Aspartat Proteasen) resultieren (NEUMAN, 2001). Apoptose wird im Rahmen viraler Infektionen zudem als Abwehrmechanismus durch Zytokine, z.B. Tumor Nekrose Faktor alpha (TNF-α), induziert. TNF-α konnte überdies mit unterschiedlichen pathologischen Leberveränderungen in Zusammenhang gebracht werden, darunter Leberschädigungen nach Ischämie/Reperfusion (COLLETTI et al., 1990), alkoholbedingte Hepatitis (FELVER et al., 1990), chronische, virale Hepatitis (GONZALEZ-AMARO et al., 1994) und Toxinvergiftungen (LEIST et al., 1997). Stark erhöhte TNF-α Serumspiegel konnten bei Patienten mit fulminantem Leberversagen (FHF) nachgewiesen werden (MUTO et al., 1988), wobei Patienten, die an Leberversagen verstarben, wiederum signifikant höhere TNF-α Werte als überlebende Patienten aufwiesen (BIRD et al., 1990). Die Tatsache, dass die Anzahl apoptotischer Hepatozyten in direktem Zusammenhang mit der Expression von TNF- α gebracht werden konnte (STREETZ et al., 2000), unterstreicht die bedeutende Rolle von TNF-α in diesem Zusammenhang.
Die Therapiemöglichkeiten bei Leberfunktionsstörungen sind bis heute unzureichend.
Im Wesentlichen beschränken sie sich auf begleitende, symptomatische Maßnahmen. Um die weitere Schädigung des Organs zu verhindern, werden primäre Erkrankungen wie Virusinfektionen, Parasitosen, Septikämien oder Toxikosen behandelt. Zur Entlastung der Leber wird leicht verdauliche, hochwertige Nahrung verabreicht und alle eingesetzten Medikamente werden auf ihre Lebertoxizität hin überprüft. Die eigentliche „Leberschutztherapie“ umfasst neben körperlicher Schonung und Wärmetherapie verschiedene Faktoren (Glucose zum Auffüllen der Hepatozytenspeicher, Vitamine B, C, K), die die Leberzellfunktionen erhalten und die Selbstheilung der Leber unterstützen sollen. Bisher sind jedoch keine Substanzen bekannt, die die Leberregeneration nachweislich fördern, stattdessen ist man gezwungen, auf das Regenerationsvermögen der Leber zu vertrauen. Als Ersatz für verlorene Organfunktion kann in der Humanmedizin übergangsweise eine Apparatur verwendet werden, die das Patientenblut außerhalb des Körpers künstlich von seinen Giftstoffen reinigt. Als dauerhafte Therapieform verbleibt jedoch nur die Organtransplantation (SASS und SHAKIL, 2003).
2.2 Tumor Nekrose Faktor alpha (TNF-α)
Tumor Nekrose Faktor alpha (TNF-α) ist ein überwiegend von Makrophagen sezerniertes Zytokin. Es wurde in den 70er Jahren aufgrund seiner Fähigkeit in transplantierten Maustumoren hämorrhagische Nekrosen zu entwickeln entdeckt (CARSWELL et al., 1975). Das aus 157 Aminosäuren bestehende Protein wird durch unterschiedlichste Pathogene wie z.B. bakterielle oder virale Infektionen aktiviert.
Wegen seiner schnellen Induzierbarkeit spielt es als proinflammatorisches Zytokin eine wichtige Rolle in der unspezifischen Immunantwort. TNF-α induziert über zwei unterschiedliche Signalwege entweder pro- bzw. antiapoptotische (z.B. im Rahmen viraler Abwehrmechanismen (SMITH et al., 1994)) oder proinflammatorische Gene.
Eine verlängerte TNF-α Aktivierung führt allerdings zu schweren Erkrankungen, die mit überschießender Immunreaktion und Entzündungssymptomatik einhergehen.
Demzufolge ist TNF-α unter anderem auch ein wichtiger Faktor im Rahmen des
fulminanten Leberversagens (MUTO et al., 1988) oder bei chronisch viralen Hepatitiden (GONZALEZ-AMARO et al., 1994).
TNF-α bindet an zwei verschiedene Oberflächenrezeptoren (Abb. 1): TNF-Rezeptor1 (GRELL et al., 1999) und TNF-Rezeptor 2 (TNF-R1 und TNF-R2) (SMITH et al., 1994; WONG und CHOI, 1997). Lösliches TNF-α bindet bevorzugt an TNF-R1, wohingegen membrangebundenes TNF-α eine höhere Affinität zu TNF-R2 aufweist (GRELL et al., 1999; YAMADA et al., 1997). Diese Rezeptoren enthalten intrazellulär statt einer Kinasedomäne rezeptorassoziierte Proteine, durch die das TNF-α vermittelte Signal weitergeleitet wird. TNF-R1 ist mit einem als TNF-Receptor1- associated-Death-Domain (TRADD) bezeichneten Protein assoziiert (Abb. 1). Durch die Induktion zweier unterschiedlicher Signalwege kommt es zu Apoptose oder zur Aktivierung von NF-kB und Jun-Kinase (HSU et al., 1995; HSU et al., 1996; LIU et al., 1996b). Die Apoptoseinduktion wird durch ein weiteres, C-terminal an TRADD gebundenes Protein vermittelt, das als Fas-Associated-Death-Domain (FADD) bezeichnet wird und die Caspase-Kaskade aktiviert (Abb. 1). Caspasen sind Proteasen, die als inaktive Zymogene im Zytoplasma der Zellen vorliegen und durch Abspaltung von Propeptiden aktiviert werden (COHEN, 1997). FADD kann durch zwei unterschiedliche Signalwege Apoptose induzieren. Einerseits wird durch direkte Interaktion mit FADD Caspase 8 aktiviert (BOLDIN et al., 1996; MUZIO et al., 1996).
Diese führt über verschiedene Zwischenschritte zur Induktion von Caspase 3, wodurch wiederum Proteine aktiviert werden, die zur Degradierung des Zytoskeletts, zur Fragmentierung der DNA und somit zur Apoptose führen (ENARI et al., 1998;
KOTHAKOTA et al., 1997; TEWARI et al., 1995). Andererseits kann FADD über eine weitere Signalkaskade ebenfalls durch Aktivierung von Caspase 8 eine Permeabilitätsveränderung der Mitochondrienmembran bewirken. Dadurch wird Cytochrom-C freigesetzt, das Caspase 9 aktiviert, wodurch wiederum eine Aktivierung von Caspase 3 erfolgt (BRADHAM et al., 1998; LI et al., 1997; WANG et al., 1996; YOSHIDA et al., 1998). Auch durch Bindung von Fas-ligand an Fas- Rezeptor, der ebenfalls FADD rekrutiert, kann diese Aktivierung erfolgen (Abb. 1) (CHINNAIYAN et al., 1995).
Die Induktion antiapoptotischer Gene durch TNF-α erfolgt, indem TRADD N-terminal ein anderes Protein bindet, welches als TNF-Receptor-Associated-Factor (TRAF) 2 bezeichnet wird (Abb. 1). TRAF 2 vermittelt die Aktivierung des IKK-Komplexes (siehe 2.4), wodurch die kB-Inhibierenden-Proteine (I-kB) phosphoryliert und schließlich degradiert werden. Das auf diese Weise aktivierte NF-kB induziert im Nukleus die Transkription verschiedener antiapoptotischer Gene (LIU et al., 1996b).
Bei Inhibition des antiapoptotischen Signalweges, der zur NF-kB Aktivierung (siehe 2.3) und der Expression NF-kB abhängiger Zielgene führt, kommt es in der Zielzelle nach TNF-α Stimulation verstärkt zu Apoptose.
Abbildung 1: TNF-α abhängige Signalkaskaden
Quelle: Ulrike Aßmus
2.3 Der Nukleärer Faktor-kappa B (NF-kB) 2.3.1 Strukturelle Eigenschaften von NF-kB
Der Nukleäre Faktor-kappa B (NF-kB) wurde in Zellkernen von B-Lymphozyten entdeckt. Der Name liegt in seiner Fähigkeit begründet, an die κB-Sequenz des murinen Immunoglobulingens zu binden (SEN und BALTIMORE, 1986). Daran anschließend wurde NF-kB in vielen weiteren Zelltypen nachgewiesen. Es handelt sich um eine Familie von Transkriptionsfaktoren, die anhand struktureller Merkmale in zwei Gruppen eingeteilt werden kann. Allen gemein ist die 300 Aminosäuren umfassende „Rel-Homology-Domain“ (RHD). Hier finden DNA-Interaktion, I-kappa-B- alpha (I-kBα) Bindung sowie Dimerisation mit anderen Mitgliedern der NF-kB Familie statt. Zur ersten Gruppe gehören p105 und p100, die sich im Bereich der C- terminalen Domäne durch einen langen Ankyrinrest mit inhibitorischer Funktion auszeichnen. Die zweite Gruppe stellt mit Rel A (SIZEMORE et al., 2002), p50, p52, Rel B und c-Rel die aktive Klasse der NF-kappaB Familie dar. Sie zeichnet sich durch eine kürzere DNA Bindungsdomäne und eine C-terminale, die Transkription aktivierende Domäne aus. Einige Komponenten entstehen aus Proteinen der Gruppe 1 durch beschränkte Proteolyse oder abgebrochene Translation (p50 aus p105 und p52 aus p100) (BALDWIN, Jr., 1996; CHEN und GHOSH, 1999; FINCO und BALDWIN, 1995).
Die Mitglieder der NF-kB-Familie liegen in den unterschiedlichsten Zellen zumeist als Homo- oder Heterodimere vor. Das häufigste und somit klassische Dimer ist p50/RelA, gefolgt von den Homodimeren p50/p50 und RelA/RelA. Die verschiedene Häufigkeit dieser Dimere liegt in ihrer unterschiedlichen Primärstruktur begründet (GANCHI et al., 1993; KUNSCH et al., 1992). Zudem haben die einzelnen Dimere Affinität zu unterschiedlichen κB-DNA Motiven, wodurch sich die große Spannbreite der regulierten Gene erklärt (FUJITA et al., 1992; KUNSCH et al., 1992). Die DNA- Zielsequenz des NF-kB-Transkriptionsfaktors umfasst ein aus 10 Basen bestehendes Motiv (5’-GGGRNNYYCC-3’ oder 5’-HGGARNYYCC-3’; folgende Kombinationen sind möglich: H = Adenin oder Cytosin oder Thymin; R = Adenin oder Guanin; Y = Cytosin oder Thymin).
2.3.2 NF-kB Aktivierung
NF-kB kann durch eine Vielzahl von Stimuli, beispielsweise Zytokine (TNF-α, IL-1), Radikale, UV-Strahlen sowie bakterielle oder virale Substanzen, aktiviert werden, die in einer Aktivierung des I-kappa-B-Kinase-Komplexes (IKK-Komplex; siehe 2.4) resultieren (KARIN und BEN NERIAH, 2000). Die NF-kB bestimmenden Eigenschaften sind die schnelle Induzierbarkeit sowie das schnelle Abklingen seiner Aktivierung, da auch potentiell toxische Mediatoren durch NF-kB induziert werden.
In seiner inaktiven Form liegt NF-kB im Zytoplasma an I-kB Proteine gebunden vor.
Mitglieder der I-kB Familie zeichnen sich strukturell durch Wiederholungen von Ankyrinresten aus, die zur Interaktion mit anderen Proteinen dienen. In diesem Fall bindet I-kB an die RelHomologyRegion (RHD) der NF-kB Proteine (GHOSH et al., 1998).
Die klassische NF-kB Aktivierung durch TNF-α, Interleukin-1 oder Lipopolysaccharide resultiert in einer Aktivierung des IKK-Komplexes. Dieser Komplex phosphoryliert die I-kB Proteine spezifisch, I-kBα an Serinrest 32 und 36 und I-kBβ an Serinrest 19 und 23. Auf diese Weise gekennzeichnet, erfolgt eine Polyubiquitinierung durch die spezifische Ubiquitinligase der SCF (Skp-1/Cul/Fbox) Familie und anschließend eine Degradierung von I-kB an 26S Proteosomen (BEN NERIAH, 2002; TAN et al., 1999). NF-kB wird freigesetzt und kann in den Zellkern translozieren, wo es an spezifische DNA-Sequenzen bindet und die Transkription seiner Zielgene induziert (BAEUERLE und HENKEL, 1994; COLLINS et al., 1995;
SIEBENLIST et al., 1994; VERMA et al., 1995). Zentrale Rolle der NF-kB abhängig induzierten Transkription ist somit die nukleäre Translokation von NF-kB (BAEUERLE et al., 1988).
Als Zielgen von NF-kB wird unter anderem auch die I-kB Transkription induziert. Neu synthetisiertes I-kB kann auf diese Weise in den Nukleus gelangen und aktiviertes NF-kB von seinen Zielsequenzen lösen (ARENZANA-SEISDEDOS et al., 1995;
BROWN et al., 1993; CHIAO et al., 1994; GANCHI et al., 1993). Durch Nukleäre- Export-Sequenzen (NES) innerhalb des I-kB Proteins wird der Komplex wieder zurück in das Zytoplasma transportiert, wodurch das schnelle Abklingen der NF-kB
Aktivierung zu erklären ist (ARENZANA-SEISDEDOS et al., 1997; RODRIGUEZ et al., 1999).
Alternativ, und nach dem heutigen Kenntnisstand IKK-unabhängig, kann die NF-kB Aktivierung z.B. durch UV-Strahlen erfolgen. Ein weiterer Signalweg wird im Zusammenhang mit der inflammatorischen NF-kB Aktivierung z.B. bei Ischämie- Reperfusion der Leber diskutiert. Hierbei wird I-kB ebenfalls phosphoryliert, jedoch nicht degradiert (IMBERT et al., 1996; LI und KARIN, 1998).
2.3.3 Bedeutung von NF-kB als Transkriptionsfaktor
NF-kB reguliert als Transkriptionsfaktor eine Vielzahl von Genen. Die Spezifität der Genaktivierung in vivo begründet sich nicht nur durch Unterschiede der κB-DNA- Zielsequenz, sondern wird zudem durch Protein-Protein Interaktionen mit anderen Promotor gebundenen Faktoren beeinflusst (HOFFMANN et al., 2003). Zielgene von NF-kB sind unter anderem Zytokine (IL-1, IL-6, TNF-α, LTα), Adhäsionsmoleküle (VANDERMEEREN et al., 1997), Akute-Phase-Proteine (SAA), Inducible Effector Enzymes (iNOS, COX-2) und MHC-Proteine (GHOSH et al., 1998; HATANO et al., 2001; KOPP und MEDZHITOV, 1999; ZHANG und GHOSH, 2001).
Eine herausragende Rolle spielt NF-kB bei der Kontrolle von Zellproliferation und Apoptose in der Leber. Hier reguliert es die Expression verschiedener antiapoptotischer Gene, wie c-IAP-1 und c-IAP-2, welche die Aktivierung von Procaspase 9, Caspase 3 und 7 hemmen (DEVERAUX et al., 1998; MERCURIO et al., 1997; WANG et al., 1998). Proapoptotische Gene werden ebenfalls reguliert, wie z.B. Fas-L (CD95L) (KARIN und LIN, 2002; KASIBHATLA et al., 1999; MATSUI et al., 1998) oder TRAIL (BAETU et al., 2001; RIVERA-WALSH et al., 2001;
SIEGMUND et al., 2001). Auch proapoptotische Rezeptoren wie Fas (CHAN et al., 1999; KASIBHATLA et al., 1998) oder Trail-Rezeptor-1 bzw. -2 (RAVI et al., 2001) werden durch NF-kB verstärkt exprimiert.
Mit Hilfe von Knockoutmäusen wurde die Rolle der NF-kB Mitglieder für die Leberentwicklung und den Leberstoffwechsel im Einzelnen untersucht. Rel A defiziente Mäuse starben zwischen Embryonaltag 15,5 und 16,5 aufgrund massiver Apoptose der Hepatozyten (BEG und BALTIMORE, 1996).
Rel A / p50 Doppelknockoutmäuse starben bereits am Embryonaltag 13 (HORWITZ et al., 1997). Auch Rel A / c-Rel Doppelknockoutmäuse starben vorzeitig, weshalb eine partielle Substitution von Rel A durch c-Rel zu vermuten ist (GROSSMANN et al., 1999; GROSSMANN et al., 2000). Da Doppelknockoutmäuse (Rel A / TNF-α) überlebensfähig sind, ist die massive Apoptose der Leberzellen in Rel A defizienten Mäusen auf eine Überempfindlichkeit gegenüber zirkulierendem TNF-α zurückzuführen (ALCAMO et al., 2001; DOI et al., 1999).
Im Rahmen des Immunsystems spielt NF-kB sowohl für die spezifische als auch für die unspezifische Immunantwort eine kritische Rolle. NF-kB führt zur verstärkten Rekrutierung und Transmigration von Makrophagen und zur Ausreifung von Lymphozyten (KARIN und LIN, 2002; MERCURIO et al., 1997; WIDMER et al., 1993). Des Weiteren fördert es die Differenzierung von B-Zellen zu Plasmazellen (GERONDAKIS et al., 1998). Durch erhöhte IL-2 Ausschüttung induziert NF-kB die Proliferation und Differenzierung von T-Lymphozyten (GERONDAKIS et al., 1998;
PAHL, 1999).
NF-kB beeinflusst außerdem den Zellzyklus. Durch Bindung an Promotoren zellzyklusrelevanter Gene induziert es die Expression von Cyclin D1, das den Übergang der G1 zur S Phase reguliert (WANG et al., 1999). Störungen in der NF-kB Aktivierung führen zu einem verzögerten G1S Phase Übergang und somit zu einem verlangsamten Zellzyklus, was durch ektopische Cyclin D1 Expression aufgehoben werden kann (HINZ et al., 1999).
Des Weiteren hat NF-kB Einfluss auf Zell-Zell-Kontakte (AHMAD et al., 1995;
AOUDJIT et al., 1997; LEE et al., 1996; PAXTON et al., 1997; SEN und BALTIMORE, 1986; VANDERMEEREN et al., 1997) und die Verstärkung und Verbreitung pathogener Signale (BLACKWELL und CHRISTMAN, 1997).
Neben der direkten Funktion als Transkriptionsfaktor sind indirekte Regulations- mechanismen durch NF-kB über Interaktionen mit anderen Transkriptionsfaktoren wie p53 (WU und LOZANO, 1994), STAT (MERCURIO et al., 1997; OHMORI et al., 1997), AP-1 (HANDEL, 1997) oder c-Myc (DUYAO et al., 1990; LA ROSA et al., 1994) beschrieben worden.
2.3.4 Klinische Bedeutung von NF-kB
Aufgrund seiner weitreichenden regulatorischen Funktionen spielt NF-kB bei vielen Erkrankungen eine wesentliche Rolle. So ist eine erhöhte NF-kB Aktivität bei viralen Erkrankungen, wie Hepatitis B oder C (SHRIVASTAVA et al., 1998; SU und SCHNEIDER, 1996; WEIL et al., 1999) festgestellt worden. Im Zusammenhang mit Morbus Crohn und Ulzerativer Kolitis wird NF-kB eine bedeutende Rolle zugeschrieben (PODOLSKY, 1991). NF-kB ist auch im Rahmen anderer entzündlich bedingter Krankheitsgeschehen als proinflammatorischer Faktor interessant. Bei Asthma ist die NF-kB Aktivität (BOCHNER et al., 1994), bei rheumatischer Arthritis sind die TNF-α Werte erhöht (FELDMANN et al., 1996; TAK und FIRESTEIN, 2001).
Bei der Alzheimer Erkrankung findet sich in frühen neuritischen Plaques eine erhöhte NF-kB Aktivität, während diese in ausgereiften Plaques herabgesetzt ist (KALTSCHMIDT et al., 1999; MATTSON und CAMANDOLA, 2001). Hinzu kommen Erkrankungen durch Fehlfunktionen des Immunsystems, wie z.B. Leukämie oder Lymphome. Aber auch allgemein bei Krebserkrankungen (MERCURIO et al., 1997), wie etwa Brust-, Eierstock-, Prostata- oder Kolonkrebs ist NF-kB oftmals fehlreguliert (RAYET und GELINAS, 1999). Für eine effektive Krebstherapie ist es wichtig, die Aktivierung von NF-kB zu verhindern (GARG und AGGARWAL, 2002; YAMAMOTO und GAYNOR, 2001). Bisherige Entwicklungen, darunter beispielsweise ein I-kBα Superrepressor erbrachten in transgenen Mausmodellen bereits deutlich positive Effekte, doch ist der therapeutische Einsatz von Transgenen nicht praktikabel.
Wie aus den dargestellten Funktionen sowie Fehlfunktionen ersichtlich wird, ist eine sensitive, komplexe Regulation der NF-kB Aktivierung von höchster Bedeutung. Das intensive wissenschaftliche Interesse erklärt sich ebenfalls aus der großen physiologischen und pathophysiologischen Bedeutung von NF-kB, das deshalb bei verschiedensten Erkrankungen potentielles Ziel pharmakologischer Interventionen ist.
2.4 Regulation der NF-kB Aktivität durch den IKK-Komplex
Proteinkinasen, die Aktivitäten von Transkriptionsfaktoren regulieren, sind im Besonderen Ziel intensiver Forschung, nicht zuletzt weil sie als mögliche Ziele pharmakologischer Interventionen in Frage kommen. Eine solche Proteinkinase ist die I-kappaB Kinase (IKK), welche als zentraler Faktor die Aktivität des, in verschiedensten Zusammenhängen wichtigen, Transkriptionsfaktors NF-kB beeinflusst. DIDONATO et al entdeckten 1997 einen Kinasekomplex, der I-kBα spezifisch an den Serinresten 32, 36 und I-kBβ an den Serinresten 19, 23 phosphoryliert. Dieser 900kDa umfassende, durch Phosphorylierung zu aktivierende Komplex phosphorylierte I-kB zudem in Abhängigkeit bekannter NF-kB aktivierender Stimuli.
Der I-kB Kinase Komplex (IKK-Komplex) besteht aus drei Untereinheiten. Die katalytisch aktiven Kinasen werden IKKα (bzw. IKK1) und IKKβ (bzw. IKK2) genannt.
Die IKKγ Untereinheit, die auch als NF-kB Essential MOdulator (NEMO) bezeichnet wird, besitzt regulatorische Funktion, vermittelt jedoch keine Kinaseaktivität.
(MERCURIO et al., 1997; ROTHWARF et al., 1998; ROTHWARF und KARIN, 1999;
ZANDI et al., 1997). Die beiden katalytischen Untereinheiten umfassen 745 bzw. 756 Aminosäuren und ein Molekulargewicht von ca. 85 bzw. 87kDa. Ihre Struktur ist zu 52% homolog. Beide besitzen N-terminal eine Kinasedomäne (zu 64% identisch) und proteininteragierende Leuzinreste sowie Helix-loop-Helix Motive an ihrem C- Terminus (zu 44% identisch) (ROTHWARF und KARIN, 1999). Beide Kinasen sind in vitro in der Lage I-kB an den spezifischen Serinen zu phosphorylieren, wobei IKKα jedoch besser I-kBβ phosphoryliert und IKKβ eine höhere Affinität zu I-kBα aufweist (LEE et al., 1998; ZANDI et al., 1998). Die regulatorische Untereinheit IKKγ besteht aus 419 Aminosäuren (50kDa) und weist C-terminal mehrere für die Proteininteraktion notwendige Motive auf (ROTHWARF et al., 1998; YAMAOKA et al., 1998).
Die entscheidenden molekularen Mechanismen der Aktivierung des IKK-Komplexes werden bis heute kontrovers diskutiert. Während zunächst angenommen wurde, dass IKKα eine Schlüsselfunktion im Rahmen des Komplexes und somit der NF-kB Aktivierung zukommt (REGNIER et al., 1997), ist von anderen IKKγ als das
entscheidende Molekül postuliert worden, das übergeordnete Signale empfängt und den Komplex aktiviert (ROTHWARF et al., 1998). Auch eine Phosphorylierung von IKKβ an den Serinresten 177 und 181, ist als die den IKK-Komplex aktivierende Reaktion vermutet worden (DELHASE et al., 1999; KARIN und DELHASE, 1998).
Mit Hilfe konstitutiver Knockoutmäuse konnte für IKKα eine wichtige Rolle im Zusammenhang der epidermalen Embryonalentwicklung, speziell der Kontrolle von Proliferation und Differenzierung epidermaler Keratinozyten aufgezeigt werden (HU et al., 1999; TAKEDA et al., 1999). Es traten keine Störungen in der NF-kB Aktivierung oder der Induktion durch NF-kB regulierte Gene auf. Konstitutive IKKβ Knockoutmäuse starben dagegen bereits während der Embryonalentwicklung (Embryonaltag 12 bis 13) an massiver Apoptose der Leberzellen (LI et al., 1999a).
Dieses Erscheinungsbild wurde auf eine Überempfindlichkeit gegenüber endogenem TNF-α, aufgrund gestörter NF-kB Aktivierung, zurückgeführt (LI et al, unpublizierte Daten).
2.5 Leberschädigung induziert durch Ischämie/Reperfusion (I/R)
Leberversagen bzw. –fehlfunktion ist bis heute ein bedeutendes klinisches Problem nach Leberoperationen, die mit einer Unterbrechung der Blutversorgung der Leber einhergehen. Dabei handelt es sich um Operationen, wie z.B. Teilresektionen, Leberlebendspenden oder Lebertransplantationen.
Die genauen molekularen Mechanismen der Leberschädigung infolge einer Ischämie mit sich anschließender Reperfusion sind bis heute umstritten. In diesem Zusammenhang kommt erwiesenermaßen der massiven Entzündungsreaktion eine entscheidende Rolle zu (JAESCHKE et al., 1998; WANG et al., 1996). Diese tritt, ebenso wie der Gewebeschaden, erst während der Reperfusionsphase auf.
Als Zeichen der Entzündung ist histologisch eine Infiltration und Häufung von neutrophilen Granulozyten im Bereich von Sinusoiden bzw. postsinusoidalen Venulen erkennbar (VOLLMAR et al., 1994).
Durch chemotaktische Faktoren sowie eine verstärkte Expression von Adhäsions- molekülen (z.B. ICAM, VCAM) erfolgt die Aktivierung der neutrophilen Granulozyten und Kupfferschen Sternzellen. Entlang der von Endothelzellen exprimierten Adhäsionsmoleküle wandern die aktivierten Immunzellen in das umliegende Gewebe ein (GRANGER und KUBES, 1994). Aufgrund massiver Proteinfreisetzung während der frühen Reperfusionsphase wird außerdem das Komplementsystem (z.B. C5a) aktiviert, was zusätzlich die Transmigration von Immunzellen in das Lebergewebe fördert (BAJT et al., 2001).
Weitere Faktoren, die für die massive Leberschädigung verantwortlich gemacht werden, sind reaktive Sauerstoffverbindungen (z.B. Wasserstoffperoxid, Hypochlor- säure, Peroxinitrit). Diese von Kupfferschen Sternzellen (BILZER et al., 1999a) und neutrophilen Granulozyten (JAESCHKE et al., 1999) ausgeschütteten hochtoxischen Verbindungen dienen im Rahmen des Entzündungsgeschehens dazu, im Plasma enthaltene Antiproteasen zu inaktivieren. Auf diese Weise sind die von Entzündungszellen produzierten Proteasen vor Inaktivierung geschützt (WEISS, 1989). Reaktive Sauerstoffverbindungen induzieren die Expression von TNF-α, NO (inducible nitric oxide), iNOS (inducible nitric oxide synthase), Hemoxigenase 1, Chemokinen und Adhäsionsmolekülen (BAUER, 2002; CHOSAY et al., 1997;
JAESCHKE, 1999; RENSING et al., 2001; ZWACKA et al., 1998b). Außerdem werden verschiedenste Transkriptionsfaktoren, wie NF-kB oder AP 1 aktiviert (FAN et al., 1999; JAESCHKE, 2000). Mit Hilfe protektiv wirkender Antioxidantien wie Glutathion, die reaktive Sauerstoffverbindungen neutralisieren, konnte eine deutlich reduzierte Entzündungsreaktion und geringere Leberschädigung erreicht werden (BILZER und LAUTERBURG, 1994; LIU et al., 1994).
2.6 Geninaktivierung in Knockout-Mausmodellen
Zur Untersuchung von Genfunktionen in vivo sind verschiedene Methoden zur funktionellen Inaktivierung der zu untersuchenden Gene im Mausmodell etabliert worden, die in der Literatur mit dem Sammelbegriff „Knockout“ bezeichnet werden.
Zur Herstellung von Knockout-Mauslinien werden zunächst aus Blastozysten pluripotente embryonale Stammzellen (ES) gewonnen. Diese werden auf speziellen Ammenzellen kultiviert und mit dem Konstrukt, das in das Zielgen integriert werden soll, transfiziert. Durch homologe Rekombination wird dieses in das Genom eingeschleust. Durch bestimmte Faktoren (z.B. Neomycinresistenz), die ebenfalls in dem Konstrukt enthalten sind, können transgene ES von solchen, die das Transgen nicht in ihr Genom integriert haben, selektioniert werden. Durch Injektion in Blastozysten können sich die transgenen ES in jedem Organ bzw. Gewebe des Embryos ansiedeln und so zur Geburt chimärer Tiere führen. Sofern auch die Keimzellen der Tiere aus ES hervorgehen, wird der gewünschte Gendefekt an nachfolgende Generationen weitergegeben (JOYNER et al., 1993). Diese Methode, als „Gene Targeting“ bezeichnet, ermöglicht es Tiere mit speziellen Gendefekten („Knockout“) zu züchten.
In einigen Fällen jedoch ist die Funktion eines Gens für die embryonale Entwicklung des Tieres essentiell. Ein konstitutiver Knockout führt in diesem Fall zur embryonalen Letalität. Um die Funktion solcher Gene im späteren Lebensverlauf des Tieres mit Hilfe eines Knockouts untersuchen zu können, wird das konditionale Knockout- system verwendet. Hierbei wird der Gendefekt erst durch Aktivierung einer Rekombinase zu einem definierten Zeitpunkt oder nur in einem spezifischen Zelltyp induziert.
Das Cre-loxP-System ist das erste sequenzspezifische Rekombinationssystem zur Erzeugung induzierbarer konditioneller Gendefekte (LAKSO et al., 1992; ORBAN et al., 1992) und wurde 1993 zum ersten Mal mit der embryonalen Stammzell- technologie kombiniert (GU et al., 1993). Als „Cre“ („causes recombination“) wird ein Enzym bezeichnet, das ursprünglich aus dem Bakteriophagen P1 isoliert wurde.
Diese Rekombinase erkennt spezifische, 34 Basenpaare umfassende, so genannte
„loxP“ (locus of crossover P1) Sequenzen. Diese enthalten eine 8 Basenpaare umfassende Core-Region, die von zwei palindromischen, aus 13 Basenpaaren bestehenden Sequenzen flankiert wird (HAMILTON und ABREMSKI, 1984; HOESS et al., 1982). Für einen konditionellen Knockout wird das zu deletierende Gen von zwei loxP-Sequenzen flankiert. Ist es aus experimentellen Gründen nicht möglich das
gesamte Gen zu deletieren, werden häufig nur einzelne Exons, die essentielle, funktionale Domänen kodieren, mit loxP-Sequenzen flankiert. In diesen Fällen ist darauf zu achten, dass keine Genprodukte mit veränderter oder Restfunktion entstehen. Zudem dürfen die eingeschleusten loxP-Sequenzen nicht mit wichtigen transkriptionellen Regulationselementen interferieren.
Für die Effizienz des konditionellen Knockouts und die sichere Induzierbarkeit zu definierten Zeitpunkten in bestimmten Zellen ist der Promotor der Rekombinase entscheidend. Hierbei sind die Promotorstärke und die Spezifität für einzelne Zelltypen von Bedeutung. Zur induzierbaren Geninaktivierung kann die cre- Rekombinase unter Kontrolle des Mx1-Promotors exprimiert werden. Der Mx1- Promotor ist durch Injektion von Interferon α/β bzw. Poly-(I)-Poly-(C) (doppel- strängige Poly-Inosin-Poly-Cytidilin Nukleinsäure) exogen induzierbar. Hierbei handelt es sich um den ersten exogen induzierbaren Promotor, der besonders in Hepato- und Leukozyten zu einem effizienten Knockout führt (KUHN et al., 1995).
Zur selektiven Geninaktivierung in Hepatozyten wird ein cre-Transgen verwendet, in dem cre unter die Kontrolle des hepatozytenspezifischen Albuminpromotors gestellt wird. Die Induktion erfolgt so an Tag 13,5 p.c. mit hoher Effektivität ausschließlich in Hepatozyten (KELLENDONK et al., 2000).
Abbildung 2: Illustration konstitutiver Gendeletion mit Hilfe des Cre-loxP-Systems. Als Beispiel sind zwei unterschiedliche Promotoren der cre-Rekombinase dargestellt, (A) Albuminpromotor, (B) Mx1- Promotor.
Quelle: Ulrike Aßmus
3 Material und Methoden
3.1 Material
3.1.1 Tierexperimentelle Materialien
Faden (Fa. Ethicon; Ethibond® Excel geflochten, beschichtet, nicht resorbierbar; 6/0 metric 0,7)
Alleinfutter für Nager (Fa. Altromin)
sterile Gaze (Fa. Beese; Sterilkompresse®) Heparin (Fa. Roche; Liquemin®)
Isofluran (Fa. Abbott; Forene®) Ketamin (Fa. Albrecht; Ketamin®)
Poly(I)-Poly(C) (Fa. Pharmacia-Biotech) Xylazin (Fa. Bayer; Rompun®)
3.1.1.1 Instrumente
Kanüle (Fa. Sterican®; Gr.17 24Gx25mm; 0,4x12mm)
Gebogene Knopfkanüle (Fa. Harvard Apparatus, 38,1x1,25mm) Mikrohämatokritkapillare (Fa. Brand)
Operationsbesteck (Fa. Aesculap)
Venenverweilkatheter (Fa. Terumo; Surflo® 24Gx¾; 0,67x19mm)
3.1.2 Zellkulturmaterialien 3.1.2.1 Bakterienstämme
Chemisch kompetente Zellen (TOP 10F) wurden von der Fa. Invitrogen bezogen und zur Transformation rekombinanter Plasmide verwendet.
3.1.2.2 Medium
Die Kultivierung der humanen Hepatomzelllinie HUH 7, 293-Zellen sowie primärer Hepatozyten erfolgte in DMEM-Medium® (Fa. Gibco/Invitrogen), dem 10 %Fetales Kälber Serum (FCS) (Fa. Gibco/Invitrogen) und 5 %Penicillin-Streptomycin (0,1 mg/ml) (Fa. PAA) zugesetzt wurden.
3.1.2.3 Adenoviren
Es wurde ausschließlich mit replikationsdefizienten, humanen Adenoviren des Serotyps 5 gearbeitet. Die verwendeten Adenoviren Adv5-dnIKKβ bzw. Adv5-LacZ wurden freundlicherweise von Dr. Brenner (Chapel Hill, North Carolina, USA) bzw.
der AG Kubicka (Hannover) zur Verfügung gestellt.
3.1.3 Enzyme
Restriktionsendonukleasen (Fa. Biolabs)
Kollagenase (Fa. Gibco/Invitrogen, Kollagenase-I) Proteinase K (Fa. Roche;15 µg/ml))
T4-Kinase (Fa. Biolabs; Polynukleotidkinase)
3.1.4 Antikörper
Anti-IKKα (Fa. Santa Cruz; sc-7184; Kaninchen; polyclonal) (Fa. Imgenex; IMG-136; Maus; monoclonal) Anit-IKKβ (Fa. Santa Cruz; sc-7607; Kaninchen; polyclonal) Anti-IKKγ (Fa. Santa Cruz; sc-8330; Kaninchen; polyclonal) Anti-IkBα (Fa. Santa Cruz; sc-371; Kaninchen; polyclonal)
Anti-Phospho-IkBα (Fa. Cell Signaling; #9241; Kaninchen; polyclonal) Anti-Phosphotyrosin (Fa. Upstate; #05-321; Maus; monoclonal)
Anti-p50 (Fa. Santa Cruz; sc-114; Kaninchen; polyclonal) Anti-p65 (Fa. Santa Cruz; sc-109; Kaninchen; polyclonal)
(Fa. Santa Cruz; sc-372; Kaninchen; polyclonal; für Immunhistochemie)
Anti-rabbit-IgG Cy3-gekoppelt (Fa. Sigma)
Anti-mouse-IgG Peroxidase gekoppelt (Fa. Dianova) Anti-rabbit-IgG Peroxidase gekoppelt (Fa. Dianova)
3.1.5 Oligonukleotide und Plasmide
NF-kB Oligonukleotide (Fa. MWG-Biotech):
sense 5’-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3’
antisense 5’-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-3’
Gst-p65 Plasmid: pGEX5x3p65354-551 (Fa. Invitrogen)
3.1.6 Allgemeine Materialien
Bioradreagenz® (Fa. Biorad)
Centricon® (Fa. VivaScience, Vivaspin MWCO RC) Coomassie-Brilliant-Blue® (Fa. Roth)
Dialyseschläuche (MWCO 6000-8000)
DNA-Marker (Fa. Invitrogen; 1kbplus Leiter®)
Einbettungsmedium für Gefrierschnitte (Fa. Sakura; Tissue-Tek®)
Eindeckelmedium mit Dapi (Fa. Vector Laboratories; DAPI-Mounting Medium®) Eindeckelmedium (Fa. Vector Laboratories, Mounting Medium®)
Filmkassetten mit Verstärkerfolie (Fa. Kodak) Homogenisator mit Kolben (Fa. Braun)
Kanüle (Fa. Braun; Gr.17 24Gx 1“; 0,55 x 25mm)
Microspin Minisäulen (Fa. Amersham; Microspin S200 HR Mini Columns®) Nylonmembran (Fa. Milllipore; Immobilon-P®)
Nylonmembran (Fa. NEN Life Science; Gene-Screen®) Unbeschichtete Objektträger (Fa. Menzel-Gläser)
Proteinmarker (Fa. Biorad ; Prestained SDS-Page Standard®, LowRange) Röntgenfilme (Fa. Amersham)
Spin down Säule (Fa. Amersham; MicroSpin Columns®) Substratansatz (Fa. Amersham; ECL-Western-Blot-analysis®) 250ml-Zellkulturflasche (Fa. Greiner Bio-One)
Zentrifugenröhrchen (Fa. Beckmann; 17 x 102mm)
3.1.7 Chemikalien
Produktname Firma
Aceton J.T.Baker
Agarose Invitrogen
Acrylamid Invitrogen
Ammoniumsulfat (biochem.Zwecke) Merck
Ammoniumacetat AppliChem
ATP (Adenosintriphospat) Sigma
BES (N,N-Bis(2-Hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure) Sigma
Bromphenol Blau Serva
BSA (Bovines Serum Albumin) Sigma
Cacodylat-Natrium Fluka
Carboxymethylzellulose Sigma
Cäsiumchlorid AppliChem
CHAPS ([(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonsäure) Sigma
Diethylether J.T.Baker
DTT (Dithiotreitol) Promega
EDTA (N,N;N’,N’-Ehtylendiamin-tetraacetat) Calbiochem
Eisen(II) – chlorid Merck
Eisen(II) – sulfat Merck
Eisen(III) – chlorid – Hexahydrat Merck
Entellan J.T.Baker
Eosin Sigma
Ethanol, unvergällt 100 % J.T.Baker
Produktname Firma
Ethidiumbromid Sigma
D(-) – Fructose Merck
Ficoll Fluka
D(+) – Glucose – Monohydrat Merck
Glutathionsepharosebeads Sigma
Glycerol (plant) Serva
ß-Glycerophosphat Sigma
Hämosin Merck
Hydrochlorid, 1M J.T.Baker
HEPES (2-[4-2-hydroxyethyl-1-piperazinyl]-ethansulfonsäure) Merck
Isopropylalkohol Riedel-de Häen
Kaliumacetat Fluka
di-Kaliumhydrogenphosphat – Trihydrat Merck
di-Kaliumoxalat Merck
Kaliumchlorid Merck
Kaliumdihydrogenphosphat Merck
Kaliumhydrogencarbonat Merck
Kalziumcarbonat Merck
Kalziumchlorid Sigma
Kalziumchloriddihydrat Merck
Magermilchpulver Merck
Magnesiumchlorid – Hexahydrat AppliChem
β-Mercaptoethanol Sigma
Methanol J.T.Baker
Methylrot Merck
Natriumacetat Merck
Natriumbicarbonat Sigma
Natriumborat Sigma
Natriumcarbonat wasserfrei J.T.Baker
Natriumcitratdihydrat J.T.Baker
Produktname Firma
Natriumdihydrogenphosphat – Monohydrat Merck
Natriumdisulfit trocken Merck
Natriumfluorid Merck
Natriumhydroxyd, 1M Merck
Natriumhydroxyd kristallin Sigma
SDS (Natriumlaurylsulfat) Sigma
Natriumorthovanadat Fluka
Natriumsulfat wasserfrei Merck
Natriumthiosulfat wasserfrei Fluka
Nonidet P – 40 Sigma
Paraformaldehyd Merck
Pefablock Boeringer
PBS (Phosphatgepufferte Saline) Biochrom KG
Phenolrot Sigma
Phenyl-Methyl-Sulfonyl-Fluorid Sigma
Poly(dI-dC)*Poly(dI-dC) Pharmacia
Proteinase Inhibitoren (Complete Mini®Tabletten) Roche
Succrose Pharmacia Biotech
Salicylsäure Sigma
TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin) Sigma
Trichloressigsäure Sigma
Tris-hydroxymethyl-aminomethan Pharmacia Biotech
Triton X-100 Sigma
TWEEN-20 Sigma
TWEEN-80 Sigma
Xylol J.T.Baker
3.1.7.1 Radiochemikalien
[32P]-γ-ATP (Fa. Amersham) [32P]-α-dCTP (Fa. Amersham)
3.1.8 Testsysteme
Labelling System für DNA Sonden (Fa. Amersham; RediprimeTMII®) DNA-Minipräparation (Fa. Qiagen; MiniKit®)
RNA-Präparation (Fa. Peqlab; peqGOLD-RNAPure®)
TUNEL-Kit zur Apoptosedetektion (Fa. Roche; In Situ Cell Death Detection Kit®)
3.1.9 Geräte 3.1.9.1 OP-Geräte
Inhalationsnarkosegerät (Fa. Dräger; Sulla 808V)
Doppelläufiges Operationsmikroskop (Fa. Zeiss; OPMI1-DFC) Bipolare Pinzette mit Generator (Fa. Hüttinger; Minicutter 80)
3.1.9.2 Zentrifugen
Kühlzentrifuge (Fa. Eppendorf)
Megafuge (Fa. Heraeus; Megafuge R1.0)
Spezielle Tischzentrifuge (Fa. Jouan; Tischzentrifuge GR 4.2.2) Tischzentrifuge (Fa. Eppendorf)
Ultrazentrifuge (Fa. Beckmann, LE BOK Ultrazentrifuge) Rotor: TI 70, SW 28 (Fa. Beckmann)
Zentrifuge (Fa. Beckmann; J2-21)
3.1.9.3 Allgemeine Geräte
Bakterienschüttler (Fa. Edmund Bühler) β-Counter (Fa. Berthold)
Bio-Imaging Analyser Fuji Bas 1000 (Fa. Fuji Photo Film Co.) Brutschrank (Fa. Heraeus)
Cryostat (Fa. Omega; Microm HM500 OM) Elektropotter (Fa. Heidolph)
Elektrophorese Apparatur (Fa. Pharmacia Biotech) Heizblock (Fa. Eppendorf)
Hybridisierungsofen (Fa. Bachofer)
Standard-Nassblotkammer (Fa. Biometra) Photometer (Fa. Kontron; UVIKON 810) Netzgeräte (Fa. Pharmacia Biotech)
Fluoreszenzphotometer (Fa. MWG-Biotech; Lambda Fluoro 320) Spektralphotometer (Fa. MWG-Biotech; Lambda Scan 200e) Szintillationszähler (Fa. Wallac; Liquid Scintillation counter 1409) Thermomixer (Fa. Eppendorf; Thermomixer 5436®)
Über-Kopf-Schüttler (Fa. Heidolph) Ultraschallstab (Fa. Heidolph)
UV-Crosslinker (Fa. Statagene; UV-Stratagene 1800) Vortex (Fa. Omnilab)
Wasserbad (Fa. Julabo; UC)
PC-Programm (Fa. Isotopenmeßgeräte GmbH; PCBAS Version 2.09f)
3.2 Methoden
3.2.1 Tierexperimentelle Methoden
Alle Versuche wurden an acht bis zehn Wochen alten, männlichen Mäusen unter Einhaltung tierschutzrechtlicher Bedingungen durchgeführt. Dabei wurden Wurfgeschwister bevorzugt verwendet.
3.2.1.1 Allgemeine Haltungsbedingungen
Die Versuchstiere wurden unter standardisierten Bedingungen im zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover gehalten. In zentral klimatisierten Räumen wurde stets eine Temperatur von 20-24°C, eine Luftfeuchtigkeit von 50-60 % und ein 12 Stunden Tag-Nacht-Rhythmus eingehalten. Die Tiere wurden in Makrolonkäfigen
in Gruppen von bis zu 5 Tieren, nach Elterntieren und Geschlecht getrennt, gehalten.
Futter und Trinkwasser wurden ad libitum zur Verfügung gestellt.
3.2.1.2 Allgemeines zum Knockoutsystem
Tiere mit konstitutivem Knockout für IKKβ sowie auch IKKγ sterben bereits embryonal aufgrund massiver Apoptose der Hepatozyten. Aus diesem Grund wurde das konditionelle Cre/loxP-Knockoutsystem verwendet. Die genetisch veränderten Mäuse wurden freundlicherweise von Dr. Manolis Pasparakis (EMBL, Monterotondo/Rom) zur Verfügung gestellt. In dieser Mauslinie wurden die Exons 6 und 7 des IKKβ- bzw. das Exon 2 des IKKγ-Gens mit loxP-Sequenzen flankiert. Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit wurde in diese Mäuse das mx-Cre bzw. das alb-Cre Allel eingekreuzt.
3.2.1.2.1 Verwendete Mauslinien
Es wurden ausschließlich spezifisch-pathogen-freie (SPF) Mäuse des Stammes Black 6/C57 verwendet. Zur Verfügung standen dabei alb-Cre und mx-Cre induzierte IKKβ (AlbIKKβ bzw. MxIKKβ) und mx-Cre induzierte IKKγ (MxIKKγ) transgene Mauslinien.
3.2.1.2.2 Induktion der Cre-Rekombinase in vivo
Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit zwei unterschiedlichen Cre-Transgenen gearbeitet. Während für IKKβ sowohl hepatozytenspezifische (alb-Cre) als auch exogen induzierbare (interferonabhängig, mx-Cre) Mauslinien generiert wurden, erfolgte der IKKγ Knockout ausschließlich interferonabhängig.
Die Induktion der mx-Cre Rekombinase in den entsprechenden Mauslinien erfolgte während der 6. bis 8. Lebenswoche durch eine einmalige, intraperitoneale Injektion von 200 µg Poly(I)-Poly(C) bei der IKKβ- bzw. 80 µg bei der IKKγ-transgenen Mauslinie. Zwei Wochen (IKKβ) bzw. vier Tage (IKKγ) nach Induktion wurden die Tiere für Versuche eingesetzt.
3.2.1.2.3 Zucht und Genotypisierung gentechnisch veränderter Mäuse
Zur Genotypisierung der Tiere wurde die aus Schwanzbiopsien isolierte DNA mit Hilfe einer standardisierten Polymerasekettenreaktion (PCR) (siehe 3.2.4.3.1) auf hetero- oder homozygote Flankierung des jeweiligen Zielallels mit loxP-Sequenzen untersucht (Primer: siehe 3.2.4.3.1.1 bzw. 3.2.4.1.2). Mit Hilfe einer weiteren PCR wurde das Cre-Transgen (Primer: siehe 3.2.4.3.1.3) nachgewiesen.
3.2.1.3 Applikationstechniken
3.2.1.3.1 Intravenöse (i.v.) Injektion
Zum Zweck der intravenösen Injektion wurde die Maus in einer Plexiglasröhre so gelagert, dass der Schwanz herausragte. Dieser wurde mit Hilfe eines warmen Zellstoffs für einige Minuten erwärmt, so dass die Schwanzvenen gut sichtbar wurden. Unter Sichtkontrolle wurde nun eine Kanüle mit flach cranialer Stichrichtung in eine der lateralen Schwanzvenen eingeführt. Leichtes Abfließen der Injektionslösung signalisierte die korrekte Lage der Kanüle.
3.2.1.3.1.1 Aufbereitung von TNF-α für die i.v.-Injektion
Das freundlicherweise von Dr. Tieggs aus Erlangen zur Verfügung gestellte, murine TNF-α lag als Stammlösung in einer Konzentration von 1,2 µg/µl vor. Zur Applikation wurde jede Maus gewogen und 6ng TNF-α/g Körpergewicht (KG) in einem Gesamtvolumen von 200 µl, verdünnt mit steriler, physiologischer Kochsalzlösung, i.v. verabreicht.
3.2.1.3.2 Intraperitoneale (i.p.) Injektion
Zum Zweck der intraperitonealen Injektion wurde die Maus mit einer Hand im Nacken und am Schwanz fixiert. Der Einstich erfolgte in Höhe der Leistengegend mit dorsaler Stichrichtung.
3.2.1.3.2.1 Aufbereitung von Poly(I)-Poly(C) für die i.p.-Injektion
Anhand der Herstellerangaben wurde das intraperitoneal (i.p.) zu applizierende Poly(I)-Poly(C), das in lyophilisierter Form angeliefert wurde, gelöst. Hierzu wurde mit steriler, physiologischer Kochsalzlösung eine Stammlösung von 2 mg Poly(I)-
Poly(C)/ml hergestellt. Zur vollständigen Lösung des Poly(I)-Poly(C) erfolgte eine Erhitzung auf 50°C für 10 Minuten. Die Lösung wurde aliquotiert und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.
3.2.1.3.3 Orale (p.o.) Applikation
Zum Zweck der oralen Applikation eines Pharmakons wurde die Maus mit einer Hand im Nacken und am Schwanz fixiert und der Kopf überstreckt. Eine leicht gebogene Knopfkanüle wurde vorsichtig über den Zungenwulst in den Rachen und, nach Abschlucken durch das Tier, bis in die Speiseröhre vorgeschoben.
3.2.1.3.3.1 Aufbereitung des Pharmakons AS 602 868 für die p.o.-Applikation Zur oralen (p.o.) Verabreichung wurde das als Pulver vorliegende Pharmakon AS 602 868, ein spezifischer IKKβ-Inhibitor der Firma Serono, in einem speziellen Puffer gelöst. Es wurde eine Gebrauchslösung von 10 mg IKKβ-Inhibitor/ml Puffer hergestellt. 20 Stunden sowie 2 Stunden vor Versuchsbeginn wurde den Mäusen 100ng IKKβ-Inhibitor/gKG oral verabreicht. Kontrolltiere erhielten zu den gleichen Zeitpunkten nur das gleiche Volumen an Inhibitorpuffer
Inhibitorpuffer:
10 mg CMC [0,1 %]
25 µl Tween 80 [0,25 %]
Ad 10 ml 1xPBS
3.2.1.4 Probennahme
3.2.1.4.1 Blutentnahme
Zur Blutentnahme wurden die Tiere mit Diethylether betäubt und mit Hilfe einer Mikrohämatokritkapillare Blut aus dem retrobulbär gelegenen Venenplexus entnommen.
3.2.1.4.2 Organentnahme
Zur Entnahme der Leber wurde das Tier mit Diethylether betäubt, fachgerecht getötet (Genickbruch) und die Bauchhöhle durch einen großzügigen Schnitt in der Linea alba
eröffnet. Zwei Entlastungsschnitte der lateralen Bauchwand in Höhe des Rippenbogens gewährleisteten eine gute Übersicht über die Bauchorgane. Im Folgenden wurde die Leber durch Präparation ihrer Bänder entnommen.
3.2.1.5 Experimentelle Ischämie/Reperfusion (I/R)
3.2.1.5.1 Versuchsaufbau
Abbildung 3: Darstellung des Aufbaus der Geräte und Materialien zur Durchführung der I/R
3.2.1.5.2 Narkose
In diesem Modell wurde als Narkose der Wahl eine Inhalationsnarkose mit Isofluran benutzt. Die Narkoseeinleitung erfolgte mit 5 % Isofluran und einer Sauerstoff- Flussrate von 2 L/Min. Die Narkose wurde mit 2,5 bis 3 % Isofluran und einem Sauerstoff-Fluß von 0,2-0,3 L/Min. aufrechterhalten (siehe 3.2.1.5.1).
3.2.1.5.3 OP-Technik
Alle Schritte der Operation erfolgten unter Sichtkontrolle mit Hilfe eines doppel- läufigen Operationsmikroskops (siehe 3.2.1.5.1). Es wurde autoklaviertes Operationsbesteck (siehe 3.2.1.5.1) verwendet.
Die Maus wurde auf einer festen Unterlage mit Klebestreifen aufgespannt und das Fell im OP-Bereich mit 70 %-igem Alkohol befeuchtet. Mit craniocaudaler Schnittführung wurde die Bauchhöhle vom Cartilago xiphoidea des Brustbeins bis in Höhe der Leiste eröffnet. Durch den Cartilago xiphoidea wurde ein Faden über einen auf der OP-Unterlage befestigten Bogen gespannt (siehe 3.2.1.5.1) und der OP- Schnitt und die Bauchhöhle mit zwei Klammern aufgespreitzt. Die Leber wurde mit in steriler, physiologischer Kochsalzlösung getränkten Tupfern dargestellt und kleinere (Haut-) Gefäße mit einem Bipolar koaguliert.
Zunächst wurden nun die Leberlappen I und II (Abb. 4 (A)) freipräpariert und nach Ligation der sie versorgenden Gefäße entnommen. Im Anschluss daran wurde vorsichtig der die Leberlappen III, IV, V und VIII versorgende Anteil der Vena portae von der Vena cava und umliegendem Bindegewebe freipräpariert, sodass eine Aneurysmaklemme um die Vena portae und Aa. hepaticae gelegt werden konnte.
Um eine portale Hypertension zu vermeiden wurden die Leberlappen VI und VII als Shunt belassen (Abb. 4(B)). Es erfolgte eine 60 minütige Ischämie während der die gesetzte Klemme im Tier belassen und die Bauchhöhle verschlossen wurde. Zur Entnahme der Klemme wurde die Maus erneut narkotisiert und die Klemme nach wiederholter Eröffnung der Bauchhöhle entfernt, so dass die vorher ischämischen Leberlappen reperfundiert wurden (Abb. 4 (C)). Zur Untersuchung I/R-bedingter Leberveränderungen wurden bei der Organentnahme ausschließlich die Lappen III-V und VIII entnommen. Als 0-Kontrollen (Zeitwert: 0 Minuten nach I/R) wurden Tiere verwendet, die bis auf das Setzen der Klemme dem gleichen Operationsprozedere unterzogen worden waren.
Abbildung 4: Schematische Darstellung einer Mausleber in caudo-cranialer Ansicht zur Verdeutlichung des Operationsgangs der experimentellen I/R. Die Leberlappen sind aus Illustrationszwecken mit fortlaufenden Zahlen (I-VIII) durchnummeriert. Präparation und Entnahme der Leberlappen I und II (A). Die Richtung des Einführens und die Position der Aneurysmaklemme sind durch Pfeil und x gekennzeichnet (B). Ischämische Leberlappen sind in hell-, Shuntlappen in dunkelrot dargestellt (B). Darstellung der Gegebenheiten nach Entnahme der Gefäßklemme (Reperfusionsphase) (C).
3.2.1.6 Primäre Hepatozytenkultur
Alle verwendeten Lösungen, Instrumente und Behälter wurden vorab autoklaviert bzw. sterilfiltriert. Die Aufbereitung der primären Zellen, nach Entnahme des vollständigen Organs aus dem Tier, erfolgte an einem sterilen Arbeitsplatz.
Zunächst wurde die Maus je nach Körpergewicht (ca. 25 g) mit ca. 300 µl Ketamin/Xylazin i.p. sediert und analgesiert. Zeitgleich wurden 50 µl eines Heparinpräparates (Liquemin®) zur Herabsetzung der Blutgerinnung injiziert. Nach Eintritt der sedativ-analgetischen Wirkung wurde das Tier in Rückenlage auf einer geeigneten Unterlage fixiert und die Bauchhöhle großzügig durch einen caudocranialen Schnitt in der Linea alba und zwei Entlastungsschnitten caudal des Rippenbogens eröffnet. Leber und Pfortader wurden dargestellt.
In die Vena portae wurde ein Venenverweilkatheter eingeführt und die Leber nach Durchschneiden der Vena cava caudalis mit einer Flussrate von ca. 2 ml/Min.
perfundiert. Als Perfusionspuffer wurde eine Krebs-Ringer-Lösung mit EDTA verwendet. Nachdem die Leber bis zur möglichst vollständigen Blutleere perfundiert worden war, wurde die Perfusion unterbrochen. Der vorbereiteten Krebs-Ringer- Lösung mit CaCl2 wurde Kollagenase (40 mg/100 ml Krebs-Ringer-Lösung)
zugesetzt und die Perfusion fortgesetzt. Sobald das kollagene Stützgerüst der Leber enzymatisch soweit aufgelockert war, dass sich die Hepatozyten auf leichten Druck mit einer Pinzette hin, vollständig aus ihrem Zellverband lösten, wurde die Perfusion gestoppt. Das Organ wurde vorsichtig entnommen und in eine Petrischale gelegt.
Alle nun folgenden Schritte wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
In 37°C warmem Medium wurde die Leberkapsel mit Hilfe zweier Pinzetten eröffnet und die Hepatozyten herausgeschüttelt. Die Zellsuspension wurde über eine sterile Kompresse filtriert und durch zweiminütige Zentrifugation bei 300 xg und 4°C intakte Zellen von Zell- und Gewebsresten getrennt. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet erneut in 37°C warmem Medium aufgenommen, wovon 80 µl zur Bestimmung der Anzahl gewonnener, vitaler Zellen nach Neubauer entnommen wurden. Die Hepatozyten wurden mit einer Dichte von 8x105 Zellen/6cm-Schale ausgesät und nach 3 bis 5 Stunden kontrolliert, ob sie adhäriert waren. Nicht anhaftende Zellen wurden durch Waschung mit sterilem 1xPBS (3 ml/Schale) entfernt und frisches Medium zugegeben. Über Nacht wurden die Zellen bei 37°C und 5 %CO2 im Brutschrank inkubiert und im Anschluss daran für Versuche eingesetzt.
Krebs-Ringer-Lösung mit EDTA: Krebs-Ringer-Lösung mit CaCl2:
900 mg NaCl [154 mM] 900 mg NaCl [154 mM]
42 mg KCl [6 mM] 42 mg KCl [6 mM]
99 mg Glucose [6 mM] 99 mg Glucose [6 mM]
210 mg NaHCO3 [25 mM] 210 mg NaHCO3 [25 mM]
2 ml 1M Hepes, pH 7,4 [20 mM] 2 ml 1M Hepes, pH 7,4 [20 mM]
37,2 mg EDTA [1 mM] 7,28 mg CaCl2 [0,11 mM]
Ad 100 ml dH2O Ad 100 ml dH2O
Auf pH 7,4 eingestellt und sterilfiltriert Auf pH 7,4 eingestellt und sterilfiltriert Ketamin/Xylazin:
450 µl Ketamin® 50 µl Rompun®
4,5 ml Physiolog.NaCl (steril)
3.2.2 Zellkultur und Adenoviren 3.2.2.1 Allgemeine Zellkultur
3.2.2.1.1 Kultivierung von HUH 7 oder 293 Zellen
Die Arbeiten mit HUH 7 oder 293 Zellen erfolgten unter einer sterilen Abzugshaube.
Die Infektionen mit Adenoviren wurden an einem separaten S2-Arbeitsplatz durchgeführt. Es wurden Handschuhe getragen, die wie auch alle anderen benutzten Geräte mit 70 %igem Ethanol desinfiziert wurden. Alle verwendeten Lösungen wurden sterilfiltriert.
Die Zellen wurden in 250ml-Zellkulturflaschen mit 12 ml Medium bei 37°C und 5 % CO2 kultiviert. Nach 2 bis 3 Tagen, bei Erreichen einer 70 bis 80 %igen Konfluenz des Zellrasens, wurde das Medium mit Hilfe einer Vakuumpumpe abgesaugt und die Zellen zweimal mit sterilem 1xPBS gewaschen. Zum Ablösen von der Kulturflasche wurden die Zellen ca. 3 bis 5 Min. in 2 ml 1xTrypsin geschwenkt und die Zellen zusätzlich durch Klopfen gelöst. Durch Zugabe von Medium wurde der Lysevorgang abgestoppt und die Zellen durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren vereinzelt. Nach Verdünnen der Zellen mit frischem Medium (z.B.: 1:5) wurden diese in neue Zellkulturflaschen ausgesät.
3.2.2.1.2 Transfektion nach Chen und Okayama
Die Transfektion ist eine Methode zur Einschleusung von Fremd DNA in eukaryontische Zellen. Die Methode nach Chen und Okayama 1988 (CHEN und OKAYAMA, 1988) ist die Kalziumphosphattechnik, wobei die Transfektionseffizienz bei ca. 0,1 bis 10 % liegt.
Dem Kulturmedium der HUH 7 Zellen wurden (pro 6 cm Schale) 5 µg der zu transfizierenden DNA, 150 µl CaCl2 und 150 µl 2 x BBS in einem Ansatz zugefügt.
Die Schalen wurden geschwenkt und über Nacht bei 35°C und 3 %CO2 inkubiert.
Nach 16 Stunden wurde das Medium gewechselt, die Zellen zweimal mit 1xPBS gewaschen und frisches Medium zugegeben. Während der erneuten Inkubation bei 37°C und 5 % CO2 wurde in den Zellen das gewünschte Protein exprimiert. Die Zellen wurden wie unter 3.2.7.1.1.2 beschrieben geerntet.
