2.5 Therapie von Sehnenerkrankungen
2.5.5 Intraläsionale Therapie mit potentiell regenerativen Substraten
2.5.5.7 Thrombozytenreiches Plasma (PRP)
Thrombozytenreiches Plasma wird im angloamerikanischen Raum als platelet rich plasma bezeichnet, woraus sich die auch im deutschsprachigen Raum gebräuchliche Abkürzung PRP ableitet. Es handelt sich bei PRP um ein Ultrakonzentrat von Thrombozyten. Die Herstellung des PRP ist verhältnismäßig einfach (FORTIER u.
SMITH 2008) und mit handelsüblichen Kits mittels Zentrifugation von Vollblut (u.a.
Osteokin®, Fa. Orthogen, Düsseldorf, SmartPReP2®, Harvest Technologies,
Plymouth, Massachusetts, USA) oder durch Filtration (z.B. E-PET®, Pall Corporation, Port Washington, New York, USA ) durchführbar. Die Menge der enthaltenen Thrombozyten im Endprodukt soll per definitionem drei bis fünf Mal so hoch sein wie in natürlichem Plasma. An anderer Stelle wird eine Thrombozytenkonzentration von mindestens 1x 106 /μL gefordert (MARX et al. 1998).
Bedingt durch die Herstellung des PRP mittels Zentrifugation ist auch mit einem Anstieg des Leukozytengehaltes zu rechnen. Dieser lag in einer humanmedizinischen Studie ca. 5x über dem von venösem Vollblut (PELLETIER et al. 2012).
In der Humanmedizin beschrieben erstmals WITHMAN et al. (1997) die Herstellung von PRP und die Anwendung zur Beschleunigung der knöchernen Regeneration (WHITMAN et al. 1997). In einer weiteren Studie wurde der Einsatz von PRP bei Unterkieferrekonstruktionen beschrieben (MARX et al. 1998). Neben den Untersuchungen zur Anwendung im Bereich der Mund-Kiefer- und Gesichtschirurgie wurde PRP in der Humanmedizin seitdem auch zur Wundbehandlung und zur Therapie von Muskel- und Sehnenstrukturen eingesetzt. Neben deutlichen Hinweisen auf einen positiven Effekt im Rahmen von in vitro- Untersuchungen (ANITUA et al. 2005; ASPENBERG 2007; DE MOS et al. 2008; GRIFFIN et al. 2009) gibt es auch einige klinische Studien, in denen Anzeichen für eine positive Wirkung hinsichtlich der Heilung von Muskel- und Sehnengewebe gefunden wurden (MISHRA u. PAVELKO 2006a; GAWEDA et al. 2010; PEERBOOMS et al. 2010).
Allerdings fanden DE VOS et al. (2010) in ihrer randomisierten, plazebokontrollierten und doppelverblindeten Studie zur Behandlung von chronischen Tendopathien der humanen Achillessehne keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen (DE VOS et al. 2010; DE VOS et al. 2011).
In den beschriebenen Anwendungsbereichen fand ein Transfer in die Veterinärmedizin statt, sodass heute mehrere Studien und Fallsammlungen zur Anwendung von PRP am Pferd vorliegen (CARTER et al. 2003; RAMIREZ 2006;
SANCHEZ et al. 2007; SCHNABEL et al. 2007; ARGÜELLES et al. 2008; WASELAU et al. 2008; BOSCH et al. 2009a; BOSCH et al. 2009b; BOSCH et al. 2010b;
CASTELIJNS et al. 2011; LUTZ 2011).
Auch bei diesem Produkt sind die enthaltenen Wachstumsfaktoren für den Wirkmechanismus besonders wichtig (FORTIER u. SMITH 2008). Transforming growth factor ß (TGF- ß), Platelet-derived growth factor (PDGF), Insulin-like growth (IGF) factor, Vascular endothelial growth factor (VEGF), Fibroblast growth factor (FGF), Platelet-derived Angiogenesis factor (PDAF) und Epidermal growth factor (EGF) sind die für die Heilung von Sehnen interessierenden Faktoren (FORTIER u.
SMITH 2008). Sie sind in hoher Konzentration in den α-Granula der Thrombozyten enthalten und haben einen anabolen Effekt auf den Sehnenmetabolismus und die Bildung von Matrixproteinen (SCHNABEL et al. 2007). Sie führen zu einer deutlich erhöhten Angioneogenese (BOSCH et al. 2010b).
Wird PRP in einen Sehnenschaden injiziert, erfolgt über eine Degranulierung eine Freisetzung der Wachstumsfaktoren aus den α- Granula der Thrombozyten und die Bildung eines Fibringerinsels nach Kontakt mit dem geschädigten Gewebe bzw. der Sehnenmatrix (SCHNABEL et al. 2007; FORTIER u. SMITH 2008). Bei humanen Blutplättchen geschieht die Ausschüttung vorsynthetisierter Wachstumsfaktoren zu 95% in den ersten 10 Minuten nach der Aktivierung des PRP. Im Anschluss erfolgt die Synthese und Sezernierung weiterer Proteine durch die Thrombozyten über einen Zeitraum von 5 bis 10 Tagen (MARX 2004; PIETRZAK u. EPPLEY 2005). Die Degranulierung der α- Granula kann auch durch Thrombin (MARX et al. 1998;
EVERTS et al. 2006; WASELAU et al. 2008), durch Kalziumchlorid (ANITUA 1999;
ANITUA et al. 2005; WEIBRICH et al. 2005) oder durch Einfrieren und anschließendes Wiederauftauen stimuliert werden, allerdings halten SCHNABEL et al. (2007) die Addition eines der genannten Agentien aufgrund der Ergebnisse ihrer in vitro- Studie für nicht notwendig (SCHNABEL et al. 2007). Es wird angenommen, dass ein hoher intrazellulärer Calciumgehalt die Aktivierungskaskade der Blutplättchen ausreichend stimuliert (HU et al. 2005).
Durch die Bildung des Fibringerinnsels werden die Wachstumsfaktoren am Ort der Läsion fixiert. Gleichzeitig dient es als Gerüstsubstanz (scaffold), die die Wundheilung fördert (TEXTOR 2011). Dies geschieht zum einen, in dem die Gerüstsubstanz neben der, durch Wachstumsfaktoren induzierten, Neoangiogenese (BOSCH et al. 2010b) eine Gefäßeinsprossung stimuliert und migrierenden Zellen
Halt bietet. Weiterhin dient sie dazu, den Verbleib der freigesetzten Wachstumsfaktoren am Applikationsort zu sichern (FORTIER u. SMITH 2008).
Insgesamt imitiert das PRP an der Stelle des Insultes so die natürlicherweise im Fall einer Gewebeverletzung ablaufenden Vorgänge. Ein Nachteil von PRP ist möglicherweise in dem Fehlen multipotenter Zellen zu sehen (FORTIER u. SMITH 2008). Vermutlich sorgen jedoch die dem PRP-entstammenden Wachstumsfaktoren für eine Rekrutierung ebendieser Zellen aus dem benachbarten Meso- und Peritendineum (MOLLOY et al. 2003). In einer Studie an transgenen Ratten konnten KAJIKAWA et al. (2007) durch einmalige PRP-Injektion in künstlich erzeugte Sehnenläsionen eine signifikante Zunahme der Einwanderung von zirkulierenden Zellen (hauptsächlich Makrophagen) aus der Blutbahn und eine gleichzeitig erhöhte Kollagenproduktion nachweisen. Die Autoren vermuten, dass die eingewanderten Zellen mittels Chemotaxis eine erhöhte Fibroblastenaggregation aus dem umliegenden Gewebe bewirken und dass deren Kollagensynthese möglicherweise von Wachstumsfaktoren beeinflusst wird, die sowohl aus dem PRP als auch aus den proliferierten Makrophagen stammen. Das hieße, dass die Fibroblasten einer bimodalen synergistischen Aktivierung durch Wachstumsfaktoren aus dem PRP unterliegen (KAJIKAWA et al. 2008).
In einer tierexperimentellen Studie konnten BOSCH et al (2009) an chirurgisch erzeugten Läsionen in der equinen OBS durch eine einmalige intraläsionale Therapie mit PRP positive Effekte hinsichtlich der biochemischen, biomechanischen und histologischen Eigenschaften des Reparaturgewebes der behandelten Sehnen im Vergleich zur Kontrollgruppe verzeichnen. Es konnte in den mit PRP behandelten Sehnen ein signifikant höherer Gehalt an Kollagen, Glykosaminoglykanen und ein höherer Zellgehalt festgestellt werden. Histologisch zeigten sich Unterschiede in der metabolischen Aktivität und der strukturellen Integrität zu Gunsten der PRP-Gruppe.
Signifikante Unterschiede lagen auch bei der biomechanischen Untersuchung vor.
So zeigten die mit PRP behandelten Sehnen eine deutlich höhere Zugfestigkeit und Elastizität (BOSCH et al. 2009a).
Verblindete in vivo-Untersuchungen zur Wirksamkeit des PRP bei natürlich entstandenen Sehnenläsionen an der OBS des Pferdes liegen nach Wissen des Autors derzeit nicht vor.
3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN 3.1 Material und Methode
3.1.1 Patientengut
Das Patientengut der Studie umfasste 20 Pferde (1Hengst, 9 Stuten und 10 Wallache, Tab. 7 u. 8), wobei der Prüfgruppe und der Kontrollgruppe jeweils 10 Pferde per Los zugeteilt wurden. Es handelte es sich um Warmblutpferde und Ponys im Alter zwischen 3 und 21 Jahren (Mittelwert (MW): 11,4 Jahre), mit einem Körpergewicht zwischen 410 und 644 kg (MW: 547,9 ).
3.1.1.1 Einschlusskriterien
Einbezogen wurden natürlich entstandene Tendopathien der oberflächlichen Beugesehne an einer Vordergliedmaße. Die klinischen Erscheinungen der Läsionen sollten am Tag der Erstuntersuchung und der Behandlung vorberichtlich nicht älter als 8 Wochen sein und es sollte keine intraläsionale Vorbehandlung bestanden haben. Außerdem sollte vorberichtlich kein vorangegangener Schaden an dieser Gliedmaße vorgelegen haben. Alle Patienten wurden für die Erstuntersuchung und Behandlung sowie für alle Verlaufsuntersuchungen in der Klinik für Pferde der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover vorgestellt.
3.1.1.2 Vorbehandlung
Bis zum Zeitpunkt der Erstuntersuchung wurden die meisten Pferde mit einer initialen entzündungshemmenden Behandlung mit nichtsteroidalen Antiphlogistika (Meloxicam 0,6 mg/kg KGW/d, Metacam® 15 mg/ml ad us. vet., orale Suspension, Fa. Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Ingelheim) für die Dauer von 3 Tagen und einer lokalen Anwendung von Kälte, Verbänden und anschließend mit Wärme (z.
B. Enelbin-® Paste, Fa. Cheplafarm Arzneimittel GmbH, Mesekenhagen) versorgt.
3.1.1.3 Gruppeneinteilung
Die Einteilung der Pferde in die Prüfgruppe oder in die Kontrollgruppe erfolgte randomisiert durch das Werfen einer Münze. Alle Pferde wurden im Rahmen der Erstuntersuchung mit der unten beschrieben UTC-Technik untersucht. Damit war es möglich, das Alter der Läsion zu schätzen und daraufhin eine Einteilung der Pferde in zwei Gruppen vorzunehmen. Die erste Gruppe beinhaltete Patienten mit einer Läsion, deren Alter aufgrund ihrer strukturellen Integrität mit etwa 0- 4 Wochen eingeschätzt wurde, in die zweite Gruppe wurden Pferde mit Läsionen, die etwa 5 – 8 Wochen vor der Erstuntersuchung entstanden waren, eingeordnet. Pferde, bei denen aufgrund der UTC- Untersuchung der Verdacht bestand, dass die Läsionen bereits älter als 8 Wochen waren, wurden von dieser Studie ausgeschlossen.
3.1.2 Untersuchungen
3.1.2.1 Anamnese: Dauer, Art, Entwicklung, Begleiterscheinungen, vermutliche Ursache, Vorbehandlung
Zu Beginn jeder Erstvorstellung wurde eine eingehende Befragung der Patientenbesitzer durchgeführt. Neben Angaben über etwaige orthopädische Vorerkrankungen wurden insbesondere das vorberichtliche Alter, die mögliche Ursache und die bisherige Vorbehandlung erfragt. Bei Pferden, die überwiesen wurden, wurde im Rahmen des Überweisungstelefonates mit dem Tierarzt eine Vorbehandlung erfragt. Weiterhin wurden Nutzungsform und –intensität bzw. das Niveau, auf dem das Pferd turniersportlich genutzt wurde, erfasst.
3.1.2.2 Klinische Allgemeinuntersuchung
Nach Aufnahme des Vorberichtes wurde eine vollständige Allgemeinuntersuchung jedes Pferdes durchgeführt. Sie beinhaltete die Untersuchung von Haltung, Verhalten, Habitus, Ernährungszustand, Pflegezustand, Atemfrequenz, Pulsfrequenz und Körpertemperatur. Weiterhin wurde eine Auskultation der Lunge und des
Herzens vorgenommen und die Beschaffenheit der Lnn. mandibulares, die Auslösbarkeit des Hustens und das Vorhandensein von Nasenausfluss untersucht.
3.1.2.3 Adspektion und Palpation
Eine Adspektion der Vordergliedmaßen wurde bei gleichmäßiger Belastung beider Gliedmaßen mit besonderem Augenmerk auf Umfangsvermehrung an der palmaren Seite des Mittelfußes vorgenommen. Die Lokalisation dieser Umfangsvermehrungen wurde analog zu der in der Literatur beschrieben Einteilung der ultrasonographischen Untersuchung festgelegt (GENOVESE et al. 1986;
RANTANEN et al. 2011) .
Es folgte eine digitale Palpation an der aufgehoben Gliedmaße. Dabei wurde die Hauttemperatur im Mittelfußbereich manuell untersucht, mit der kontralateralen Seite verglichen und mit einem vierstufigen Score bewertet: 0= keine Erwärmung, 1=
geringgradige Erwärmung, 2= mittelgradige Erwärmung, 3= hochgradige Erwärmung (GEBUREK et al. 2015).
Weiterhin wurde die Druckdolenz im Bereich der OBS an der aufgehobenen Gliedmaße untersucht, mit der Reaktion der anderen Vordergliedmaße verglichen und ebenfalls mit einem etablierten vierstufigen Score beurteilt (0= keine Schmerzreaktion, 1= geringgradige Schmerzreaktion, 2= mittelgradige Schmerzreaktion, 3= hochgradige Schmerzreaktion) (SCHMIDT 1989).
3.1.2.4 Untersuchung in Bewegung, Provokationsproben
Die spezielle orthopädische Untersuchung erfolgte an der Hand auf fester, gerader Strecke im Schritt und im Trab. Die Beurteilung der Lahmheit erfolgte nach dem fünfstufigen Beurteilungsschlüssel der Klinik für Pferde der Tierärztlichen Hochschule Hannover (Tabelle 2).
Tabelle 2: Beurteilungsschlüssel des Lahmheitsgrades der Pferde mit Tendopathien der oberflächlichen Beugesehne (EDINGER 2010)
Grad Definition
1
geringgradig undeutlich lahm
Die Lahmheit ist nur im Trab sichtbar, aber nicht bei jedem Tritt im Trab
2
geringgradig deutlich lahm
Die Lahmheit ist im Schritt nicht bis kaum, aber bei jedem Tritt im Trab deutlich sichtbar
3 mittelgradig lahm
Die Lahmheit ist im Schritt und im Trab deutlich sichtbar.
4 hochgradig lahm
Die Lahmheit ist im Schritt und im Trab sichtbar.
Die betroffene Gliedmaße wird nur kurz belastet 5 höchstgradig lahm Das Pferd nimmt auf der betroffenen Gliedmaße
keine Last mehr auf
Zusätzlich wurden an beiden Vordergliedmaßen Übersichtsbeugeproben durchgeführt, deren Ausfall mittels eines dreistufigen Scores bewertet wurde (EDINGER 2010):
x Geringgradig positiv: Ein bis zwei deutlich lahme Tritte (zuvor nicht lahmes Pferd) bzw. ggr. Verstärkung der Lahmheit über die halbe Länge der Vorführbahn (10m)
x Mittelgradig positiv: Deutliche Verstärkung der Lahmheit über mehr als die halbe Länge der Vorführbahn (10m deutlich lahme Tritte)
x Hochgradig positiv: Verzögertes Absetzen der gebeugten Gliedmaße und lang anhaltendes, starkes Lahmen
3.1.2.5 Ultrasonographische Untersuchung
Zunächst wurde das Haarkleid im palmaren Bereich des Mittelfußes zwischen Os carpi accessorium und Sporn beider Vordergliedmaßen geschoren und für die UTC-Untersuchungen wurde zusätzlich rasiert. Die Haut wurde mit medizinischer Seife
und warmem Wasser gewaschen und mit Alkohol entfettet. Vor der Untersuchung wurde ein Ultraschallkontaktgel (Kontaktgel für Ultraschalldiagnostik, Fa. Sonogel Vertriebs GmbH, Bad Camberg) auf die Haut aufgetragen.
Die Pferde wurden für die Untersuchung mit 0,04-0,08 mg/kg Romifidin (Sedivet® 10mg/ml, Fa. Boehringer Ingelheim Vetmedica, Ingelheim) und 0,01 mg/kg Butorphanol (Alvegesic® Vet 10 mg/ml, Fa. CP Pharma, Burgdorf) intravenös sediert.
Die ultrasonographische Untersuchung wurde mit einem Gerät (Logiq E9, Fa. GE Healthcare, Wauwatosa, USA) und einem 6-15 MHz Linearschallkopf unter Verwendung einer Vorlaufstrecke (GE 12L 2302652 Standoff, Fa. Veterinary Sales&Service Inc., Stuart, USA) durchgeführt.
Als Standardeinstellung wurden eine Frequenz von 13 MHz, eine Verstärkung (Gain) von 52, eine Eindringtiefe von 25 mm und ein Fokuspunkt von 15 mm gewählt. Die Eindringtiefe und der Fokuspunkt wurden bei starker Vergrößerung des Sehnendurchmessers an die darzustellenden Strukturen angepasst. Es wurden 7 Querschnittsbilder und 3 Längsschnittbilder von beiden Vordergliedmaßen entsprechend der Einteilung von GENOVESE et al. (1986) angefertigt (GENOVESE et al. 1986; RANTANEN et al. 2011). Hierbei wurde darauf geachtet, dass das Querschnittsbild im erkrankten Bereich die maximale horizontale Ausdehnung des Schadens erfasste. Bei exzentrisch lokalisierten Schäden wurden neben den medianen Längsschnittbildern zusätzlich auch axiale bzw. abaxiale Bilder angefertigt, um den erkrankten Bereich der Sehne abzubilden
3.1.2.6 Ultrasonographische Gewebecharakterisierung (UTC)
Die UTC-Untersuchungseinheit (Abb. 1) bestand aus einem Laptop-Computer (MacBook Pro® 17“, Fa. Apple, Cupertino, USA) und einem, über ein EDC-Modul (EDC Module, Fa. Terason Ultrasound, Teratech Corporation, Burlington, USA) verbundenen, 5-10 MHz-Schallkopf (LA T Transducer, Fa. Terason Ultrasound, Teratech Corporation, Burlington, USA).
Der Schallkopf wurde in den vorgesehenen Rahmen der Motoreinheit (UTC scan unit V.1.0., Fa. UTC Imaging B.V., GD Stein, Niederlande) eingespannt und konnte
mittels eines Elektroantriebs in vertikaler Richtung entlang der eingebauten Vorlaufstrecke bewegt werden.
Die Motoreinheit war ebenfalls über ein Firewire-Kabel (Flat Cable FireWire 400 to FireWire 800, Fa. LaCie, Massy Cedex, Frankreich) mit dem Computer verbunden.
Abbildung 1: Einheit zur ultrasonographischen Gewebecharakterisierung (ultrasonographic tissue characterization, UTC)
Die Voreinstellungen für den Schallkopf wurden mit der entsprechenden Herstellersoftware vorgenommen (Classic Tera2000 Software V.3.6.6c, Fa. Terason Ultrasound, Teratec Corporation, Burlington, USA). Es wurde bei einer mittleren Auflösung (Mid size), einer Eindringtiefe von 3 cm, einem Fokuspunkt von 1,3 cm und bei einer Gain von 20 untersucht.
Durch die UTC Software V.1.0.0; 2010 (Fa. UTC Imaging B.V., GD Stein, Niederlande) wurden die Bilddaten des Schallkopfes und die Informationen der
Motoreinheit auf dem Laptop zusammengefügt und somit die zu analysierenden UTC- Bilddaten erzeugt.
Die UTC-Untersuchung erfolgte am stehenden, sedierten Pferd bei gleichmäßiger Belastung aller vier Gliedmaßen. Die Untersuchung der Gliedmaßen erfolgte jeweils von der gleichen Seite. Die Untersuchungseinheit, bestehend aus Schallkopf und Motoreinheit wurde von lateral im palmaren Mittelfußbereich angelegt (Abb. 2).
Hierbei wurde bei jedem Patienten, an jeweils beiden Vordergliedmaßen und bei jeder UTC-Untersuchung dieselbe Starthöhe verwendet. Diese wurde im Rahmen der B-Mode-Untersuchung so gewählt, dass die Läsion im Untersuchungsbereich der UTC lag. Die Strecke zwischen dem distalsten Punkt der am weitesten palmar gelegenen Ausdehnung des Os carpi accessorium und dem Startpunkt der UTC-Untersuchung wurde bei senkrecht belasteter Gliedmaße gemessen und notiert.
Dadurch wurde gewährleistet, dass bei jedem UTC-Scan die jeweils identischen Bereiche untersucht wurden. Der Schallkopf wurde dann durch die Motoreinheit automatisch konstant orthograd zur OBS von proximal nach distal bewegt und über eine Strecke von 12 cm wurde alle 0,2 mm ein horizontales Schnittbild erzeugt. Aus den gewonnenen Querschnittsbildern wurden durch die Software eine sagittale und ein koronale Schnittebene berechnet. Anschließend wurden die angefertigten Bilder vor der Abspeicherung auf Bewegungsartefakte kontrolliert.
.
Abbildung 2: Ultrasonographische Untersuchung zur Charakterisierung des Gewebes (UTC)
3.1.3 Thrombozytenreiches Plasma 3.1.3.1 Herstellung
Die Behandlung der Patienten erfolgte direkt im Anschluss an die Erstuntersuchung.
Den Pferden der Prüfgruppe wurde zunächst unter aseptischen Kautelen Blut aus der V. jugularis entnommen und mit einem kommerziell verfügbaren PRP-Kit (Osteokin®, Fa. Orthogen, Düsseldorf) aufbereitet. Hierzu wurde 6 ml ACD-A-Lösung in die Blutentnahmespritze aufgezogen. Die gestaute Vene wurde mit einer Flügelkanüle punktiert, die Abnahmespritze mit dem Schlauch der Kanüle verbunden und diese durch langsame Aspiration bis zur 60-ml-Markierung mit Blut gefüllt. Die Spritze wurde anschließend mehrfach vorsichtig geschwenkt um eine gleichmäßige Vermischung von Antikoagulans und Blut zu erreichen.
Der Inhalt der Abnahmespritze wurde unter aseptischer Handhabung in den Beutel A (roter Verschlussstopfen) des Beutelsystems überführt (Abb. 3). Nach dem Einsetzen des Beutelsystems in den Metallbecher der Zentrifuge (Universal 320®, Fa. Andreas
Hettich GmbH & Co. KG, Tuttlingen) und der Befüllung des Ausgleichsbechers schloss sich der erste Zentrifugationsschritt an. Es wurde 3 min. mit einer relativen Zentrifugalbeschleunigung (RCF) von 900 zentrifugiert. Dies entspricht bei einem Rotorradius von 143mm einer Drehzahl von 2380 Umdrehungen pro Minute (RPM).
Das überständige Plasma mit den darin enthaltenen Thrombozyten wurde danach durch langsames Aufrollen des Beutels A mittels einer Klemme über den Überleitungsschlauch in den Beutel B überführt. Bei der sich anschließenden zweiten Zentrifugation wurde für die Dauer von 10 min. bei einer RCF von 1430 (3000 RPM) zentrifugiert. Nach Beendigung der zweiten Zentrifugation wurde das überständige thrombozytenarme Plasma möglichst vollständig mit einer Spritze über den Entnahmeanschluss entnommen. Anschließend wurden 3 ml thrombozytenarmes Plasma zurück in den Beutel gegeben, um die zuvor in einem Plasmarest im Beutel verbliebenen Thrombozyten zu resuspendieren. Durch diese Vorgehensweise ergab sich ein Volumen von ca. 4 ml thrombozytenreichem Plasma. Hiervon wurden 3 ml in eine sterile Spritze für die intraläsionale Injektion aufgezogen und 1 ml wurde in einem EDTA-Röhrchen (Vacuette®, Greiner Bio- One International AG, Kremsmünster, Österreich) für die Bestimmung des Leukozyten- und Thrombozytengehalts zurückbehalten.
Abbildung 3: PRP- Aufbereitung, sterile Blutentnahme, Überführung in das Osteokin®- Beutelsystem (PRP: platelet rich plasma)
Abbildung 4: PRP- Aufbereitung, Überführung des Plasmas nach dem ersten Zentrifugationsschritt in den 2. Beutel, Thrombozyten als Bodensatz nach dem zweiten Zentrifugationsschritt
3.1.3.2 Messung des Leukozyten- und Thrombozytengehalts
Im Rahmen der Blutabnahme für die PRP-Herstellung wurde venöses Vollblut in einem EDTA-Röhrchen für die Bestimmung des Leukozyten- und Thrombozytengehalts sowie des Hämatokrits und Gesamteiweißgehaltes gewonnen.
Die Zellgehalte in der Vollblutprobe und in der PRP-Probe wurden mit Hilfe eines Zellcounters (KX-21N®, Fa. Sysmex, Norderstedt) bestimmt.
3.1.3.3 Intraläsionale Injektion
Zunächst wurden alle Pferden durch eine intravenöse Gabe von 0,03 mg/kg Detomidin (Cepesedan®, Fa. CP Pharma, Burgdorf) und 0,01 mg/kg Butorphanol (Alvegesic® Vet 10 mg/ml, Fa. CP Pharma, Burgdorf) sediert.
Nach aseptischer Vorbereitung wurde eine Leitungsanästhesie der Nn. palmares lateralis und medialis ca. 3cm distal des Vorderfußwurzel-Mittelfußgelenkes mit je 2,5 ml einer zweiprozentigen Mepivacain-Lösung (Scandicain® 2%, Fa. AstraZeneca GmbH, Wedel) vorgenommen.
Drei ml thrombozytenreiches Plasma wurden unter ultrasonographischer Kontrolle intraläsional appliziert. Bei transversaler Anschallposition erfolgte der Einstich horizontal und in Abhängigkeit von der Distanz des Schadens zur Hautoberfläche von medial bzw. lateral mit einer 22 G-Kanüle (Durchmesser 0,7 mm, BD MicrolanceTM 3, Fa. Becton Dickinson GmBH, Heidelberg). Die intraläsionale Injektion erfolgte je nach Größe des Schadens an zwei oder drei verschiedenen Lokalisationen. Der erste Einstich wurde im Bereich der maximalen horizontalen Ausdehnung des Schadens (MIZ), die Folgenden etwa 1- 2 cm proximal und/oder distal des ersten Applikationsortes vorgenommen.
Bei den Pferden der Kontrollgruppe wurden bei gleicher Vorgehensweise 3 ml sterile 0,9%ige NaCl- Lösung (Isotone - Kochsalzlösung 0,9%®, Fa. B. Braun Melsungen, Melsungen) intraläsional appliziert. Die behandelten Gliedmaßen wurden mit einem Zehenpolsterverband versehen, der drei Tage verblieb.
Bei allen Pferden wurde ein Beschlag an beiden Vordergliedmaßen in Form von geschlossenen Hufeisen mit verlängerten Schenkeln durch den Hausschmied der Patientenbesitzer aufgebracht.
Abbildung 5: Intraläsionale Injektion unter ultrasonographischer Kontrolle, fotographische Abbildung des Einstichs unter ultrasonographischer Kontrolle, Transversales Ultrasonogramm mit Reflexlinie, verursacht durch quer zum Faserverlauf eingeführte Injektionskanüle
3.1.4 Auswertung der Bilddaten
3.1.4.1 Auswertung der B-Mode Sonogramme
Die Querschnittsfläche (cross sectional area, CSA) der OBS wurde für jede Untersuchungszone ausgemessen. Hierfür wurde die Kontur der OBS mit Hilfe der Polygon-Messfunktion der Bildbearbeitungssoftware (easyIMAGE®, Fa. IFS Informationssysteme, Hannover) der Patientenverwaltungssoftware (easyVET®, Fa.
IFS Informationssysteme, Hannover) eingezeichnet und die Fläche automatisch errechnet. Anschließend wurde für jede Gliedmaße und jeden Untersuchungszeitpunkt durch Addition der einzelnen Sehnenquerschnittsflächen eine Summe der Sehnenquerschnittsflächen ermittelt (total cross sectional area, TCSA).
Auf Höhe der maximalen Ausdehnung der Läsion (maximal injury zone, MIZ) wurde die Querschnittsfläche der Läsion (= cross sectional area, CSA) mit derselben Methode gemessen.
Bei der Auswertung der Querschnittsbilder wurde die Echogenität beurteilt und mit Hilfe des unten (Tabelle 3) aufgeführten Echogenitätsscores bewertet.
Die Längsschnittbilder wurden hinsichtlich der Faserparallelität unter Verwendung des Faserbündel-Ausrichtung-Scores (Tabelle 4) evaluiert.
Tabelle 3: Echogenitätsscore (echo score, ES, (RANTANEN et al. 2011))
Score Definition
0 isoechogen, normale Echogenität
1 ggr. hypoechogen, überwiegend normale Echogenität 2 gemischte Echogenität (50% normale Echogenität, 50%
anechogen)
3 überwiegend/vollständig anechogen
Tabelle 4: Score zur Bestimmung der Faserbündel – Ausrichtung (fibre alignment score,FAS, (RANTANEN et al. 2011)
Score Definition
0 ≥ 75% Faserparallelität in der Läsion 1 50-75% Faserparallelität in der Läsion 2 25-50% Faserparallelität in der Läsion 3 ≤ 25% Faserparallelität in der Läsion
Alle ermittelten Werte wurden mit einem Tabellenkalkulationsprogramm (Microsoft®
Office Excel 2003, Fa. Microsoft®, Redmond, USA) archiviert.
3.1.4.2 Auswertung der ultrasonographischen Gewebecharakterisierung
Die qualitativ beste Aufnahme (Aufnahme mit der geringsten Anzahl an
Die qualitativ beste Aufnahme (Aufnahme mit der geringsten Anzahl an