6.1 Reinheitsbestimmung mit der 1 H-NMR
6.1.2.2 Erarbeitung eines Analysenverfahrens
Es sollte daher untersucht werden, ob diese Reinheitsanalysen auch mit nur einem internen Standard ausgeführt werden könnten. Zu diesem Zweck wurden drei potentielle Referenz-materialien (Spiraeosid, Thymol und Loganin) vom ZA-Sinzig bereitgestellt. Für die ersten beiden Substanzen wurde 3-Trimethylsilyl-2,2,3,3-tetradeuteropropionsäure-Natriumsalz (TSP) als interner Standard verwendet, beim Loganin das ZRM Benzoesäure.
6.1.2.2.1 Probenpräparation und Spektrenaufnahme
Die Probenpräparation erfolgte analog zu dem im Kapitel 6.1.1.1 vorgestellten allgemeinen Verfahren. Als Lösungsmittel wurde für alle drei Proben deuteriertes Methanol-d4 (vom ZA-Sinzig vorgegeben) verwendet. Die Aufnahmen der Spektren erfolgten mit den Standardpa-rametern aus Kapitel 5.1.2 (Tabelle 5.1, D1 = 60 s (Loganin: D1 = 20 s), ns = 64, TD = 64 k).
6.1.2.2.2 Auswertung: Spiraeosid
O O H
O H O
O H
O H
O O
O
H O H
O H O H
S p ira e o s id 6
8 1
3 6 '
2 '
1 '' 6 ''
Abbildung 6.3: Struktur des Spiraeosids. Nummerierung erfolgte nach Vorgaben vom ZA-Sinzig.
Ziel der Reinheitsanalyse vom Spiraeosid (Abbildung 6.3) war das Austesten des Verfah-rens. Die Übersichtsspektren zur qualitativen Auswertung – Zuordnung der Signale war zuvor vom ZA-Sinzig geleistet worden – bestätigten eine generelle Stabilität der Substanz.
Somit wurden zur quantitativen Auswertung 27,20 mg Spiraeosid (MSpiraeosid = 500,4 g mol-1) und 10,40 mg TSP (MTSP=172,27 g mol-1) eingewogen. Das quantitative 1H-NMR-Spektrum in Abbildung 6.4 gibt die Signallagen des Spiraeosid wieder. Zur Auswertung des Spiraeo-sids wurden die beiden Signale bei 7,68 ppm (H-6’) und 7,74 ppm (H-2’) herangezogen. Die Signale bei 6,34 ppm (H-8) und 6,15 ppm (H-6) zeigten Deuterierungserscheinungen, die bei 7,26 ppm (H-5’), 3,94 ppm (H-6’’a) und 3,51 ppm (H-2’’, H-3’’, H-4’’, H-5’’) wiesen Fremdsignale im Integrationsbereich auf und das Signal bei 3,75 ppm (H-6’’b) lag zu nahe bei den benachbarten Signalen.
Abbildung 6.4: 1H-NMR-Spektrum vom Spiraeosid mit TSP (0 ppm) als internem Standard.
Nach Gleichung (3.13) ergibt sich aus den Intensitätswerten des Spiraeosids und des TSP ein Reinheitsgrad von
%
Abbildung 6.5: Struktur des Thymols. Nummerierung erfolgte nach Vorgaben vom ZA-Sinzig.
Ebenso wie beim Spiraeosid war beim Thymol (Abbildung 6.5) vordergründig die Durchführ-barkeit der Analyse Gegenstand der Untersuchung und nicht die Ermittlung der Messun-sicherheit des Verfahrens. Nachdem die qualitative Zuordnung anhand der Daten vom ZA-Sinzig erfolgt und die Stabilität der Substanz gezeigt war, wurden zur quantitativen Analyse 45,98 mg Thymol (MThymol=150,22 g mol-1) und 18,35 mg TSP (interner Standard) eingewogen. Zur Auswertung wurden beim Thymol nur die Signale bei 6,96 ppm (H-3) und 6,57 ppm (H-4 und H-6) herangezogen, da die Signale bei 2,20 ppm (H3-7) und 3,20 ppm (H-8) Fremdsignale aufwiesen. Das Signal bei 1,17 ppm (H3-9 und H3-10) wurde als
Kontrolle der Intensitätswiedergabe im Spektrum verwendet, jedoch nicht bei der Auswertung berücksichtigt. Das quantitative Spektrum ist in der Abbildung 6.6 dargestellt.
Abbildung 6.6: 1H-NMR-Spektrum vom Thymol mit TSP (0ppm) als internem Standard.
Nach Gleichung (3.13) wurde aus diesen Intensitätswerten ein Reinheitsgrad von
%
ermittelt. Zur Überprüfung dieses Ergebnisses wurde eine zweite Analyse mit einer Einwaa-ge von 45,05 mg Thymol und 18,74 mg TSP durchEinwaa-geführt. Der dabei bestimmte Reinheits-grad von 101,5 % entsprach dem der ersten Messung. Wegen der hygroskopischen Eigenschaft des TSP kann dessen angenommener Reinheitsgrad aber signifikant kleiner sein, so dass die ermittelte Reinheit des Thymols von über 100 % darauf zurückzuführen ist.
Für eine genaue Analyse muss daher eine geeignete zertifizierte Lösung von TSP in D2O als Standard eingesetzt werden.
6.1.2.2.4 Auswertung: Loganin
Nachdem die Analysen des Spiraeosids und des Thymols die Durchführbarkeit des Verfah-rens der Reinheitsanalyse zeigten, sollte die Reinheitsbestimmung des Loganins (Abbildung 6.7) unter metrologischen Gesichtspunkten mit dem ZRM Benzoesäure als internem Stan-dard erfolgen. Das ZA-Sinzig stellte hierfür zwei Loganin-Proben unterschiedlicher Chargen zur Verfügung. Die qualitative Zuordnung der Signale im Spektrum wurde durch Spektren-simulation mit der Software „ACD HNMR“ getätigt. Von jeder Charge wurde eine Lösung eingewogen (Charge 1056: 9,52 mg Loganin und 10,71 mg ZRM; Charge 48942772:
4,44 mg Loganin und 7,32 mg ZRM) und diese jeweils viermal gemessen.
O O O O
O H
C H3
H
H O
OH OH
OH
O H
CH3
Loganin
Abbildung 6.7: Struktur des Loganin.
Die Prozessierung und Auswertung der Spektren erfolgte nach der Arbeitsanweisung im Kapitel 5.1.2 mit einem Integrationsfaktor von 64. Von den Signalen des Loganins im 1 H-NMR-Spektrum (Abbildung 6.8) wurde das Signal bei 1,66 ppm als zur Auswertung optimal bewertet. Die übrigen Signale zeigten entweder Fremdsignale oder waren aufgrund der Nähe zu benachbarten Signalen nicht optimal auswertbar. Als Referenzsignal des Standards wurde das Signal bei 8,07 ppm ausgewertet.
Abbildung 6.8: 1H-NMR-Spektrum des Loganins mit ZRM Benzoesäure als internem Standard.
Die nach Gleichung (3.13) mit MLoganin= 390,4 g mol-1 berechneten Reinheitsgrade der acht Experimente sind in der Tabelle 6.6 zusammengestellt. Ebenso sind in dieser Tabelle die Schätzwerte der Reinheitsanalyse und deren Standardunsicherheit dargestellt, die mit (91,38 ± 0,09) g/g % für Charge 1056 und (91,23 ± 0,15) g/g % für Charge 48942772 ähnlich sind.
Tabelle 6.6: Experimentelle Ergebnisse der Reinheitsanalyse der zwei Loganin-Proben sowie deren Schätzwerte und Standardunsicherheiten.
Reinheitsgrad P in g/g %
Messung 1 Messung 2 Messung 3 Messung 4 Schätzwert u(x) Loganin, Charge:
1056
91,42 91,13 91,49 91,49 91,38 0,17
Loganin, Charge:
48942772
91,12 91,54 90,86 91,39 91,23 0,30
6.1.2.3 Unsicherheitsbudget
Bei den Reinheitsanalysen vom Spiraeosid und dem Thymol soll die Betrachtung der kombinierten Standardunsicherheit wegen des unbekannten Reinheitsgrades des Standards (TSP) nicht weiter verfolgt werden, zudem diese hauptsächlich zur Austestung der Durch-führbarkeit der Analyse dienten. Nichtsdestoweniger könnte die kombinierte Standardun-sicherheit durch Abschätzungen der unbekannten Größen u(IAnl /IStd ) und u(fStd ) berechnet werden.
Für die Analyse der Reinheit des Loganins war das Unsicherheitsbudget analog zu dem im Kapitel 6.1.1.3 beschriebenen aufzustellen und zu berechnen. Die in die kombinierte Stan-dardunsicherheit eingehenden Unsicherheitsbeiträge sind in der Tabelle 6.7 am Beispiel des Loganin Charge 48942772 zusammengefasst.
Tabelle 6.7: Unsicherheitsbeiträge des Unsicherheitsbudgets zur Reinheitsbestimmung von Loganin Charge 48942772.
Unsicherheitsbeitrag xi u
( )
xi( )
i i
x x
u fi
Integration 91,23 0,15 0,16 % 3
Molmasse Benzoesäure 122,121 g mol-1 0,006 g mol-1 0,005 % 50 Molmasse Loganin 390,382 g mol-1 0,014 g mol-1 0,004 % 50
Einwaage Benzoesäure 7,32 mg 0,03 mg 0,4 % 1000
Einwaage Loganin 4,44 mg 0,03 mg 0,7 % 1000
Reinheitsgrad Benzoesäure 99,9958 g/g % 0,0012 g/g % 0,0012 % 11 Komb. Standardunsicherheit uc(y) 0,7 g/g % 0,8 % 846
Für die Charge 48942772 wurde die kombinierte Standardunsicherheit zu uc(y)= ± 0,7g/g% berechnet. Entsprechend ergab sich für die Charge 1056 eine kombinierte Standard-unsicherheit von uc(y) = ± 0,4 g/g %. Bei beiden übte die Einwaagenunsicherheit aufgrund der geringen Probenmengen den stärksten Einfluss auf die Gesamtunsicherheit aus, gefolgt von der Unsicherheit der Integration. Die Unsicherheiten der Molmassen und des Reinheits-grades des Standards fielen dagegen vernachlässigbar gering aus, wie die Berechnung
mittels Spreadsheet bestätigte. Die effektiven Freiheitsgrade für beide Chargen wurden zu 846 bzw. 538 bestimmt. Demzufolge ist für die Angabe der erweiterten Unsicherheit ein Erweiterungsfaktor von k = 2 für ein Konfidenzniveau von p=95% anzusetzen.
Insgesamt konnten die Reinheitsgrade der beiden Loganin-Chargen mit der 1 H-NMR-Spektroskopie unter Berücksichtigung der erweiterten Unsicherheit (k = 2; p = 95 %) zu (91,4 ± 0,8) g/g % (Charge 1056) und (91,2 ± 1,4) g/g % (Charge 48942772) bestimmt werden.