Einflussfaktoren auf das Messergebnis

Die computergestützte Spermienanalyse (CASA) soll eine objektive Bewertung verschiedener Spermienarakteristika wie Motilität, Geschwindigkeit und Konzentration ermöglichen. Probleme bestehen in der Standardisierung und Optimierung der Ausstattung und der Untersuchungsabläufe. COOPER et al. (2002) sahen, dass nur unter standardisierten und optimierten Bedingungen brauchbare Ergebnisse erhalten werden können. Auch andere Autoren stellten fest, dass viele Faktoren die Erhebung von aussagekräftigen und wiederholbaren Messergebnissen beeinflussen (BRAZIL et al. 2004a).

Weitere Einflussfaktoren sind die Art des verwendeten CASA-Systems (Optik, temperierter/automatisierter und/oder nicht temperierter/automatisierter Kreuztisch), die Systemeinstellungen (Lichtstärke, Tiefenschärfe, Verdünnungsgrad), die verwendeten Messutensilien (Art der Probengefäße, der Pipetten, und -spitzen und die Temperatur), die Untersuchungstechnik (Anzahl und Auswahl der Messfelder, Art/Ort der Probenentnahme und Art der Kammerbeschickung, Probenhandling und Pipettiertechnik) sowie die Probe selbst (Temperatur, Konzentration, Verdünner, Detritus) (DAVIS u. KATZ 1993). Weil Spermien sich nicht immer gleich schnell und in die gleiche Richtung bewegen, kann die sehr kurze Untersuchungsspanne von CASA-Systemen dazu führen, dass die ermittelten Ergebnisse irreführend sind (VANTMAN et al. 1988).

2.1.5.1 Das CASA-System

Die computergestützte Spermienanalyse unterliegt einer ständigen technischen Verbesserung des gesamten Systems und somit der Messung.

FARRELL et al. (1995) zeigten, dass bei Parallelmessungen der Konzentration und der Motilität fast zu 100 % identische Messergebnisse mit zwei gleich eingestellten Geräten möglich sind. LENZI (1997) hingegen schilderte Messunterschiede bei Systemen des gleichen Herstellers und wies so auf ein Problem der Standardisierung hin, welches bereits beim CASA-System selbst beginnt. HOLT et al. (1994) zeigten, dass zwischen unterschiedlichen Versionen des gleichen Gerätes größere Unterschiede bei allen Parametern messbar waren, als zwischen verschiedenen CASA-Systemen. Die Autoren folgerten, dass der Probenumgang und die Erfahrung der Nutzer wichtiger einzustufen sind als die Optimierung der CASA-Systeme.

SIEMERS (1994) und DAVIS und SIEMERS (1995) zeigten hingegen, dass ähnliche Messergebnisse auch beim Gebrauch unterschiedlicher Computersysteme erzielt werden können. Sie verglichen die Bewegungsarten von Spermien und deren Geschwindigkeiten anhand eines Videos und werteten dieses mit den beiden CASA-Systemen von CellTrak-S und Hamilton-Thorn aus. Die Variationen lagen unter 8 % mit Korrelationen von r = 0,994 bei der VCL und r = 0,996 bei der VSL.

VARNER et al. (1991) verglichen zwei CASA-Systeme (Hamilton-Thorn und frame-by-frame playback video micrography) und kamen zu dem Ergebnis, dass beide Computersysteme die Möglichkeit bieten, die Spermienmotilität und -geschwindigkeit bei Hengsten zuverlässig zu bestimmen. Auch sie kamen auf eine hohe Korrelation zwischen beiden Systemen (r = 0,97). JASKO et al. (1988; 1991) analysierten mit einem CASA-System von CellSoft Motilitäten von Hengstsperma und erreichten wiederholbare und für den klinischen Gebrauch ausreichend genaue Werte. GILL et al. (1988) hingegen verglichen den CellSoft Semen Analyzer und den Hamilton Thorn Motility Analyzer (HTM) 2000 im Vergleich zur subjektiven Auswertung mit der Makler-Kammer. Bei der Konzentrationsmessung schnitt das HTM 2000 mit einer Überbewertung von 8 % etwas besser als das CellSoft-System mit durchschnittlich 35 % mehr Spermien gegenüber den Kontrollen ab. AGARWAL et al. (1992)

verglichen die Messergebnisse zweier gleicher CASA-Systeme der Firma Hamilton Thorne mit gleichen Systemeinstellungen. Trotz gleichem Umgang mit der Probe wurden signifikante Unterschiede in der gemessenen Spermienkonzentration, den gezählten motilen Spermien und den kinetischen Parametern ALH, LIN und BCF nachgewiesen. Keine signifikanten Unterschiede gab es in den Bewegungs-parametern Gesamtmotilität, VAP, VSL, VCL und progressive Motilität. Die Autoren diskutierten, dass der Gebrauch der Makler-Zählkammer in ihren Untersuchungen möglicherweise für die fehlende Reproduzierbarkeit der Ergebnisse verantwortlich war. Auch andere Autoren fanden heraus, dass die Makler-Zählkammer ungenaue Ergebnisse im Vergleich zum Haemozytometer und Microcell liefert (GINSBURG u.

ARMANT 1990).

Es wurde deutlich, dass sowohl personenbezogene Einflüsse durch Standardisierung des Umgangs und der Beurteilung zu minimieren waren als auch versucht werden muss, durch die Beurteilung einer sehr hohen Spermienzahl eine repräsentativere Aussage über die Samenqualität zu erreichen. In der Regel lassen sich diese Verbesserungen nur durch maschinelles Bearbeiten erreichen, z.B. durch den Einsatz eines automatisierten Scannertisches, wie es bei neueren Modellen der Fall ist, mit Hilfe dessen eine Messung an standardisierten Messpositionen der Messkammer ermöglicht wird (VERSTEGEN et al. 2002; NICOLAE 2006)

2.1.5.2 Systemeinstellungen

WIEDERMANN (1992) führte den Erhalt unterschiedlicher Messergebnisse auf die Verwendung verschiedener Computereinstellungen und -programme zurück. So entstanden die Unterschiede dadurch, dass verschiedene Algorithmen, Bildaufnahmesysteme, verarbeitende Hardware und Software zur Bestimmung nominell identischer Parameter verwendet wurden. Allein die Wahl unterschiedlicher Objektive konnte eine Ursache für den Erhalt divergierender Messergebnisse darstellen (WIEDERMANN 1992). Auch LENZI (1997) beschrieb Messunterschiede bei Systemen des gleichen Herstellers und sah deren Entstehung unter anderem in unterschiedlichen Geräteeinstellungen. Bereits OVERSTREET und COOPER (1978)

und KATZ et al. (1989) zeigten die Notwendigkeit auf, die vom Systemhersteller vorgegebenen Einstellungen zu benutzen. Dies sei aber nur dann gut, wenn deren Leistung periodisch überprüft und das Gerät ständig neu kalibriert werden würde.

Auch erwähnten Sie, dass CASA nicht der Goldstandard der Messung motiler Spermien sei.

VERSTEGEN et al. (2002) wiesen auf die Möglichkeit hin, dass nicht nur die vom Hersteller empfohlenen Einstellungen verwendet werden können, sondern auch die nutzerorientierte Anpassung des Parametersatzes möglich sei. Dies betraf auch die Definition der durchschnittlichen Größe der Spermienköpfe, durch die die Spermienerkennung in vielen CASA-Systemen gewährleistet sei.

Die optimale Einstellung der Lichtintensität beschrieben VERSTEGEN et al. (2006) als wichtigsten Faktor bei der Spermienerkennung, weshalb diese idealerweise vor jeder Messung überprüft und eingestellt werden sollte.

Da Kammern mit unterschiedlichen Schichtdicken im Handel erhältlich sind, war die Eingabe der verwendeten Kammer für eine exakte Konzentrationsbestimmung essentiell. Je nach CASA-System können diese Daten in der Software gespeichert werden (VERSTEGEN et al. 2002).

Es existieren einige Studien über den Vergleich der manuellen mikroskopischen Spermienzählung und der Motilitätsschätzung mit der computergestützten Spermienanalyse (KRAUSE 1995; CENTOLA 1996; JOHNSON et al. 1996a;

DOMES 2003). Allen gemein ist die generell höhere Reproduzierbarkeit der computergestützten Spermienanalyse gegenüber der Spermienzählung und der Motilitätsschätzung bei der manuellen Untersuchung.

Verbesserungsmöglichkeiten sah NICOLAE (2006) im CASA-System selbst. Diese boten sich in der Nutzung mathematischer Programme zur Identifizierung der Wege von sich kreuzenden Bahnen. Auch eine verbesserte Erkennung der Spermien durch Einbeziehung des Mittelstücks sah der Autor trotz verbesserter Technik nur bei wenigen Systemen verwirklicht.

2.1.5.3 Laborpersonal und Untersuchungstechnik

SCHRÖPPEL (1988) wies Untersuchereinflüsse auf das Messergebnis nach. Er stellte wiederholt fest, dass die Subjektivität des Untersuchers die Beurteilung einer Spermaprobe stark beeinflussen konnte. Die Folgen waren erhebliche Ab-weichungen zwischen den Befunden verschiedener Untersucher. VETTER et al.

(1998) zufolge spielten unter anderem die Variablen der Konzentration der Probe und die Erfahrung des Untersuchers eine Rolle.

RIEMKE (1983) zeigte, dass der Untersucher durch die Auswahl der Messfelder und auch der Zeit, die die Spermien brauchten, um sich an die Kammertemperatur anzupassen (Äquilibrierungszeit) einen starken Einfluss auf das vom Computerprogramm erhobene Messergebnis haben konnte. Auch VERSTEGEN et al. (2002) sahen in der Anzahl der untersuchten Messfelder und Zellen eine Möglichkeit, starken Einfluss zu nehmen. Mit steigender Zahl der Untersuchungen stieg ihrer Studie nach auch die Messgenauigkeit. Andere Autoren beschrieben, dass es durch die unterschiedliche Aufarbeitung der Proben und die Auswahl nicht repräsentativer Blickfelder zum Auftreten von Fehlern und somit zu einer großen Einflussnahme auf das Messergebnis kommen konnte (NEUWINGER et al. 1990b;

DAVIS u. KATZ 1993; CENTOLA 1996). LENZI (1997) hingegen beschrieb Messunterschiede bei Systemen des gleichen Herstellers und begründete deren Entstehung unter anderem in den individuellen Arten der Probenentnahme. Laut LEIDL et al. (1989) waren die Qualität und Auswahl des mikroskopischen Bildes vom Untersucher abhängig und stellten für die Autoren somit einen nicht standardisierbaren Einfluss dar. Einige Systeme bieten anderen Autoren zufolge heutzutage die technische Möglichkeit zur Verwendung eines automatisierten Scannertischs, der eben diesen Einfluss eliminieren kann (VERSTEGEN et al. 2002;

NICOLAE 2006).

2.1.5.4 Messkammer

Die Wahl der verwendeten Messkammer (LENZI 1997) und deren Tiefe (DAVIS u.

KATZ 1993) hatte einen bedeutenden Einfluss auf die Reproduzierbarkeit und die Aussagekraft des Messergebnisses.

Beim dem Vergleich verschiedener Kammern wurden unterschiedliche Ergebnisse erzielt. Den Kammereinfluss auf die Konzentration beschrieben TOMLINSON et al.

(2001). Sie beobachteten, dass die Neubauer-Kammer signifikant höhere Werte für die Spermien-Konzentration erbrachte als die Microcell-Kammer und dass die ermittelten Werte wiederum signifikant höher waren als die der Leja-Kammer. Die Variationskoeffizienten der Konzentrationsbestimmung mit Hilfe dieser Kammern betrugen 7,4, 10,2 und 10,6 %. Die Autoren machten jedoch keine Angaben, welches CASA-System verwendet wurde. Dagegen ergaben die Messungen von GINSBURG und ARMANT (1990) gleiche Spermienkonzentrationswerte mit der Neubauer- und der Microcell-Kammer. Die gemessenen Konzentrationswerte in der Makler-Kammer waren dagegen signifikant höher. Messungen der Konzentration von Hundespermien ergaben mit dem SpermVision^TM-System vergleichbare Ergebnisse mit der Microcell-Kammer und der Leja-Microcell-Kammer (VERSTEGEN et al. 2006).

JOHNSON et al. (1996b) stellten bei ihren Untersuchungen mit einem CASA-System von Hamilton-Thorne unter Verwendung von Microcell-Kammern mit einer definierten Tiefe von 20 μm eine unregelmäßige Verteilung der Spermienkonzentration innerhalb der Kammer fest. Im Bereich von bis zu 8 mm von der Einfüllmulde entfernt war die Konzentration signifikant erhöht, verglichen mit der Konzentration gemessen weiter als 8 mm von der Einfüllmulde der Kammer entfernt. Auch bei der Untersuchung der Spermienverteilung in der 20 µm tiefen Leja-Kammer stellte sich heraus, dass die Konzentration sich in Richtung Kammerausgang erhöhte (DOUGLAS-HAMILTON et al. 2005a,b; VERMEIDEN et al. 2005; KUSTER 2005; NICOLAE 2006). Die Autoren führten dies auf die bestimmten Eigenschaften einer Flüssigkeit, in einem starren System zu fließen, zurück und gaben als Lösungsvorschlag einen Korrekturfaktor von 1,17 bis 1,3 vor, welcher mit der in der Kammermitte gemessenen Konzentration multipliziert werden sollte.

Nach dem Gesetz von Hagen-Poiseuille bilden Flüssigkeiten in einem starren System eine laminäre Strömung aus. Dies hat zur Folge, dass der Axialstrom (Kammermitte) am schnellsten fließt und die in der Flüssigkeit befindlichen Partikel (Spermien) sich am vorderen Teil des Meniskus ansammeln. Dieser Effekt wurde von SEGRE und SILBERBERG (1961) beschrieben und von DOUGLAS-HAMILTON et al. (2005a,b) für die Leja-Kammer nachgewiesen. Die Erklärung hierfür war, dass Partikel aus den außen liegenden, langsamer fließenden Schichten, in schneller fließende Schichten gezogen werden. So sammelten sich bei Flüssigkeiten zwischen Ebenen „in der Leja-Kammer sind es entsprechend zwei Ebenen„ Partikel in einer Schicht, die nur einen geringen Abstand zur Mitte des Stromes haben und es entstehen die sogenannten „Segre-Silberberg Ebenen“ (Abb. 1) (DOUGLAS-HAMILTON et al. 2005a,b). Die Stärke der Auswirkung dieses Effektes war von vielen Faktoren abhängig. Dazu gehörten Form und Volumen der Partikel, Viskosität der Flüssigkeit (abhängig von Temperatur und Dichte), Fließgeschwindigkeit und Tiefe der Kammer sowie deren Beschichtung (normal/extra beschichtet) (ARMANT u.

ELLIS 1995).

Einen negativen Kammereinfluss auf die Spermienmotilität beschrieb HANSEN (2009) bei der Leja-Kammer. In seinen Untersuchungen nahm die Spermienmotilität während der Kammerbefüllung in Richtung Kammersausgang ab; als Ursache vermutete der Autor einen spermientoxischen Effekt des Klebers.

Die Tiefenschärfe der meisten Mikroskope liegt bei ca. 16 µm. Daher benutzen alle Systeme, deren Spermienanalyse über eine auf dem Mikroskop angebrachte Kamera arbeitet, Einwegkammern mit einer maximalen Tiefe von 20 µm. Nur wenn alle Partikel in der Schärfeebene liegen, können diese exakt erkannt werden. Bei der Verwendung von Messkammern mit einer Tiefe von 10 μm liegen alle Spermien in der Schärfeebene, sind aber in ihrer Bewegung so eingeschränkt, dass keine natürliche Bewegung beurteilt werden kann (NICOLAE 2006).

2.1.5.5 Beschaffenheit und Verdünnung der Probe

In zwei Untersuchungen beeinflussten die Temperatur, die Konzentration, der Detritus und der verwendete Verdünner einer Probe die Reproduzierbarkeit und Aussagefähigkeit der Messungen mit dem CASA-System (DAVIS u. KATZ 1993;

ARMANT u. ELLIS 1995). Die Autoren sahen in der Spermienkonzentration einer Probe einen wesentlichen Einflussfaktor auf das Messergebnis. Erst aus der Untersuchung einer bestimmten Anzahl gemessener Spermien resultierte ein exaktes Messergebnis. Die Mindestanzahl an Spermien ist für die Messung mit einem CASA-System speziesspezifisch (BUDWORTH et al. 1987; BUDWORTH et al.

1988;). Nach RIEMKE et al. (1986) mussten beim gleichen System mindestens 200 Spermien ausgewertet werden, damit die Messgenauigkeit der Geschwindigkeit reproduzierbar war. Um auf einen Variationskoeffizienten von unter 10 % zu kommen, mussten laut VERSTEGEN et al. (2002) hingegen pro Kammer mindestens 600 Spermien gemessen werden. LENZI (1997) gab in seiner Studie einen Konzentrationsbereich von unter 5-10x10⁶ und über 50-100x10⁶ an, in dem das CASA-System keine präzisen und zuverlässigen Messergebnisse lieferte.

Abb. 1: Verhalten von Partikeln in laminären Strömungen. Die Flüssigkeit ist hellgrau, die Bewegung der Partikel wird durch Pfeile symbolisiert. Die geraden Pfeile symbolisieren die Segre-Silberberg Ebenen (Quelle: NICOLAE 2006)

VERSTEGEN et al. (2006) beschrieben, dass das SpermVision^TM innerhalb eines großen Konzentrationsbereichs effektive Messergebnisse ohne signifikante Unterschiede lieferte und gaben für eine optimale Messung zwischen 50 und 100 Mio. Spermien/ml in einer Probe an. Bei Proben mit über 100 Mio. Spermien pro ml kam es zu einer Unterbewertung der Motilität. Dies lässt den Schluss zu, dass die Ursache in vermehrt auftretenden Zusammenstößen und Überlagerungen bei hoher Spermiendichte in der Messschicht lag (VANTMAN et al. 1988; WIEDERMANN 1992). VETTER et al. (1998) beschrieben diesen Konzentrationseinfluss auf die Motilitätsmessung ebenfalls. Laut SEHNER (2005) mussten die Ejakulate zur Erzielung von optimalen Messergebnissen in einem bestimmten Konzentrations-bereich liegen, der ihrer Aussage zufolge vom Hersteller vorgegeben wird.

Grundsätzlich sollte weitgehend unabhängig von der Probenkonzentration versucht werden, durch die Beurteilung einer möglichst hohen Spermienzahl eine repräsentativere Aussage über die Spermienqualität zu erreichen (NICOLAE 2006).

Dies ist nicht durch eine Erhöhung der Spermienkonzentration in der Probe, sondern durch eine Erhöhung der Anzahl an Messfeldern zu realisieren. Gerade eine geringe Spermienkonzentration erforderte eine hohe Anzahl an Messfeldern (NICOLAE 2006). Nach der Untersuchung verschiedener Einflussfaktoren auf die Messgenauigkeit der Konzentration und der Motilität von Ebersamen mit dem SpermVision^TM-System in der Leja-Kammer wurden von NICOLAE (2006) Empfehlungen für die Messung erarbeitet. Zum Beispiel sollten die zu messenden Proben Konzentrationen zwischen 18 und 55 x 10⁶ Spermien pro ml haben, für praxisrelevante Versuche ca. 25 x 10⁶ Spermien pro ml (wie der Inhalt der Besamungstuben).

Einen weiteren Einflussfaktor auf das Messergebnis stellt der Verdünner dar. Je nach der Dichte müssen die zu untersuchenden Spermaproben für die Messung zunächst mit physiologischem und transparentem Medium verdünnt werden. Die Spermienvitalität durfte durch diese Lösung nicht beeinflusst werden. Verfälschungen der Ergebnisse können durch eventuell enthaltene Partikel der gleichen Größe wie Spermien, z.B. Eidotter, das Messergebnis entstehen (VERSTEGEN et al. 2002;

SEHNER 2005). ANZAR et al. (1991) konnten trotz optimierter Einstellung und

Filtration eine Überbewertung der Konzentration bei unfiltriertem, mit Eidotter verdünnten Bullensperma gegenüber einem Teilchenzählgerät von durchschnittlich 10 % nachweisen. Besonders bei Hengstspermien kommt es aufgrund ihrer geringen Größe leicht zu einer Verwechslung mit Eidotterpartikeln und somit zu einem methodisch bedingten Einfluss auf das Ergebnis (LEIDL et al. 1987b; LEIDL et al.

1989; ZIEGLER 1991).

Auch die Probentemperatur hatte einen Einfluss auf das Messergebnis. IGUER-OUADA und VERSTEGEN (2001) untersuchten Hundeejakulate bei 30° Celsius, entsprechend der Temperatur des Ejakulates nach der Absamung, und bei 38°

Celsius, entsprechend der Körpertemperatur. Alle Motilitätsparameter waren bei einer Temperatur von 30°C vermindert. Dieses Ergebnis stellt einen wichtigen Faktor für die Befruchtung dar, da die Temperatur im Uterus bei 38°C liegt. Somit sollte die Untersuchung bei 38° Celsius erfolgen.