4. Ergebnisse
4.2. Die Rolle der Glutamatdehydrogenasen RocG und GudB bei der Regulation des
4.3.1. Der Einfluß der N-Quelle auf die RocG-abhängige Hemmung von GltC
Der Regulationsmechanismus des gltAB-Operons ist bisher noch nicht vollständig verstanden. In Abschnitt 4.1.4. wurde gezeigt, daß die Expression des gltAB-Operons durch das Aktivatorprotein GltC vermittelt wird. In Gegenwart der bevorzugten C-Quelle Glukose wird die Glutamatsynthase stark exprimiert (Tab. 4.1.). Ein Signal aus dem C-Stoffwechsel könnte zum einen das Regulatorprotein GltC direkt stimulieren. Zum anderen könnte ein negativer Faktor, welcher beim Wachstum mit Glukose nicht exprimiert wird, an der Regulation beteiligt sein. Das gltAB-Operon würde in diesem Fall indirekt durch die C-Quelle reguliert werden. Die bisherigen Ergebnisse sprechen dafür, daß es sich bei dem negativen Faktor um die katabole Glutamatdehydrogenase RocG handelt (Abschnitt 4.2.2.). Das rocG-Gen wird zum einen durch CcpA reprimiert, zum anderen wird das gltAB-Operon in Abwesenheit einer aktiven Glutamatdehydrogenase konstitutiv exprimiert (Belitsky &
Sonenshein, 2004; Commichau et al., 2006b). Denkbar wäre, daß RocG das Aktivatorprotein GltC inaktivieren kann (Abb. 5.3.). Eine Protein-Protein-Interaktion zwischen dem
Ergebnisse 74 Aktivatorprotein GltC und RocG wurde bereits vorgeschlagen (Tripal, 2003). Die Interaktion konnte jedoch nicht bewiesen werden (Reif, 2004). Die in den Abschnitten 4.2.2. und 4.2.6.
beschriebenen Experimente zeigen jedoch, daß RocG zusammen mit einer Glutamatquelle an der Regulation des gltAB-Operons beteiligt ist.
Mit dem folgenden Experiment sollte gezeigt werden, daß die RocG-abhängige Repression des gltAB-Operons durch GltC vermittelt wird. Dazu wurde RocG im Wildtyp, in einer gltC-Mutante und in Stämmen, welche konstitutiv aktive GltC-Varianten exprimieren, plasmidständig überexprimiert. Im Wildtyp sollte das gltAB-Operon in Abhängigkeit von der RocG- und der Glutamatmenge reguliert sein. Bei einer hohen RocG-Menge und einer hohen Glutamatkonzentration wäre zu erwarten, daß das gltAB-Operon vollständig reprimiert wird.
Ohne Glutamat oder bei einer verringerten Glutamatmenge sollte der reprimierende Einfluß von RocG verschwinden (Abschnitt 4.1.3.). In der gltC-Mutante sollte das gltAB-Operon nicht mehr exprimiert werden können. In Stämmen mit konstitutiv aktiven GltC-Varianten wäre die Erwartung, daß die Glutamatsynthase vollständig unabhängig von RocG und Glutamat exprimiert wird. Die Ergebnisse dieses Experimentes sind in Tabelle 4.12.
dargestellt.
Erwartungsgemäß wird das gltAB-Operon im Wildtyp durch Glukose induziert (Tab.
4.12.). Durch die Zugabe von Ornithin kann die Glutamatsynthase auch in glukosehaltigem Medium nicht mehr exprimiert werden. In der gltC-Mutante kann das gltAB-Operon nicht mehr induziert werden. Die glukoseabhängige Regulation des gltAB-Operons ist daher GltC-abhängig (siehe auch Abschnitt 4.1.4.). Der Stamm GP651 ist eine gltC-Mutante, bei der das gltC-Allel des Wildtyps unter der Kontrolle des eigenen Promotors im amyE-Gen integriert ist (Abchnitt 3.1.). Die Position des gltC-Gens im Genom hat jedoch keinen Einfluß auf die Regulation des gltAB-Operons durch die C- und die N-Quelle, da das gltAB-Operon wie im Wildtyp reguliert ist (Tab. 4.12.). Die Stämme GP652, GP653 und GP654 sind ebenfalls gltC-Mutanten, bei denen im amyE-Gen mutierte gltC-Allele integriert sind. Die Varianten des Aktivatorproteins GltC sorgen für eine konstitutive Expression des gltAB-Operons (Abschnitt 3.1.). Das gltAB-Operon wird auch ohne Glukose exprimiert und der reprimierende Einfluß von Ornithin ist aufgehoben.
Ergebnisse 75 β-Galaktosidaseaktivität (MU) Stamm rocGhy Relevanter Genotyp - + Glc + Orn + Orn + Glc
GP669 - Wildtyp 9 201 4 15
GP650 - gltC 21 14 19 13
GP651 - gltC amyE::(gltC) 8 141 4 10
GP652 - gltC amyE::(gltC(P88 → L)) 983 690 555 777 GP653 - gltC amyE::(gltC(I160 → K)) 410 690 414 609 GP654 - gltC amyE::(gltC(T99 → A)) 1582 1339 1881 1189
GP669 + pGP529 + Wildtyp 434 470 42 152
GP650 + pGP529 + gltC 11 11 18 14
GP651 + pGP529 + gltC amyE::(gltC) 442 444 32 85 GP652 + pGP529 + gltC amyE::(gltC(P88 → L)) 2427 792 1365 823 GP653 + pGP529 + gltC amyE::(gltC(I160 → K)) 4165 1217 3353 1207 GP654 + pGP529 + gltC amyE::(gltC(T99 → A)) 2466 1388 2127 1414
Tab. 4.12. Die Überexpression von RocG in GltC-Mutanten mit konstitutiver Expression des gltAB-Operons.
Die in der Tabelle dargestellten Stämme wurden in CSE-Medium angezogen. Hier sind Ergebnisse einer repräsentativen Einzelmessung gezeigt.
Die Überexpression von RocG im Wildtyp und in der Mutante, bei der das gltAllel im amyE-locus integriert ist führt dazu, daß das gltAB-Operon unabhängig von der C-Quelle exprimiert wird. In Abschnitt 4.2.6. wurde bereits gezeigt, daß die Überexpression von RocG in glutamathaltigem Minimalmedium zur Expression des gltAB-Operons führt.
Vermutlich wird durch die starke Überexpression des glutamatabbauenden Enzyms die Glutamatmenge in der Zelle verringert. Da RocG offensichtlich nur mit Glutamat oder einer Glutamatquelle in die Regulation des gltAB-Operons eingreifen kann (siehe Abschnitt 4.2.6.;
Abb. 5.3.), ist dies eine mögliche Erklärung für starke Expression der Glutamatsynthase.
Durch die Zugabe von Ornithin wird das gltAB-Operon in Abwesenheit von Glukose jedoch wieder vollständig reprimiert. Auch in glukosehaltigem Medium ist die Expression des
gltAB-Ergebnisse 76 Operons in Gegenwart von Ornithin reduziert. Ornithin oder ein Intermediat des Argininabbauwegs müssen daher den inaktivierenden Einfluß von RocG auf GltC wiederherstellen. Weder in der gltC-Mutante noch in der gltC-Mutante, welche das Überexpressionsplasmid für RocG enthält, kann das gltAB-Operon induziert werden. Die glukoseabhängige Regulation des gltAB-Operons erfolgt damit ausschließlich durch das Aktivatorprotein GltC. Auch die RocG-abhängige Repression des gltAB-Operons wird durch GltC vermittelt. Die GltC-Mutanten ermöglichen die Expression des gltAB-Operons auch in Gegenwart einer hohen RocG- und Glutamatkonzentration. Erstaunlicherweise ist in den gltC-Mutanten die Expression der Glutamatsynthase durch die Überexpression von RocG erhöht.
Möglicherweise stimuliert α-Ketoglutarat, das Abbauprodukt von Glutamat, die Aktivität von GltC (Picossi-Goñi et al., 2005).
Die obigen Ergebnisse zeigen eindeutig, daß in der Zelle die Versorgung mit Glutamat oder einer Glutamatquelle durch die katabole Glutamatdehydrogenase RocG gemessen wird.
Die Aktivität von RocG entscheidet über den Zustand von GltC. Ohne Glutamat wird auch in Gegenwart einer hohen RocG-Menge die Glutamatsynthase exprimiert. Erst durch eine gute Glutamatquelle (z.B. Ornithin) wird GltC durch RocG inaktiviert und das gltAB-Operon kann nicht mehr transkribiert werden. Glutamat alleine kann das gltAB-Operon nicht reprimieren, da in der rocG-Mutante die Glutamatsynthase konstitutiv exprimiert wird (Tab. 4.10.;
Commichau et al., 2006b).