Überexpression von RocG

Es konnte gezeigt werden, daß die Expression der Glutamatsynthase mit der RocG- Menge in der Zelle korreliert (Abschnitt 4.2.2.). Außerdem wurde mit Hilfe von Regulatormutanten, in denen die RocG-Menge verringert ist, gezeigt, daß die Glutamatsynthase stärker exprimiert wird (Abb. 4.7. und Tab. 4.8.). Bei Abwesenheit einer enzymatisch aktiven Glutamatdehydrogenase wird das gltAB-Operon konstitutiv exprimiert (Tab. 4.10.; Belitsky & Sonenshein, 2004; Commichau et al., 2006b). Der Mechanismus der RocG-abhängigen Regulation des gltAB-Operons ist noch unverstanden. Vorgeschlagen wurde ein Modell, in dem die Glutamatdehydrogenase mit dem Regulator GltC interagieren kann und so dessen Aktivität inhibiert (Abb. 5.3.; Tripal, 2003). Die

Protein-Protein-Ergebnisse 70 Interaktion zwischen dem Aktivatorprotein GltC und der katabolen Glutamatdehydrogenase RocG konnte bisher jedoch nicht nachgewiesen werden (Reif, 2004).

Um den Einfluß der RocG-Menge auf die Regulation des gltAB-Operon genauer zu untersuchen, wurde ein Plasmid konstruiert, mit dem das rocG-Gen xyloseabhängig induziert werden kann. Dazu wurde ein 443 bp langes DNA-Fragment, welches die Ribosomenbindestelle und 422 bp vom 5’-Ende des rocG-Gens enthielt, in das Plasmid pX2 (Mogk et al., 1997) hinter dem xyloseinduzierbaren Promotor eingebracht. Das klonierte DNA-Fragment enthielt keine cre-Sequenz, da der Einfluß der Katabolitenrepression auf die rocG-Expression ausgeschlossen werden sollte. Die cre-Sequenz befindet sich 35 Basenpaare hinter dem Transkriptionsstartpunkt im Promotorbereich des rocG-Gens (Belitsky et al., 2004). In Gegenwart von Xylose wird das durch das Plasmid pX2 kodierte Repressorprotein XylR inaktiviert und der Promotor vor dem zu exprimierenden Gen kann abgelesen werden.

Die Klonierungsstrategie ist in Abschnitt 3.1. beschrieben. Mit dem entstandenen Plasmid pGP952 wurde der Wildtypstamm GP342 transformiert. Im erhaltenen Stamm GP752 sollte die Expression von RocG durch Xylose induziert werden können.

Test des xyloseinduzierbaren Systems zur Überexpression von RocG

Zunächst wurde mit Hilfe einer Westernblot-Analyse getestet, ob das xyloseinduzierbare System zur kontrollierten Expression von RocG, funktioniert. Dazu wurde der nach der Transformation erhaltene Stamm GP752 in Medien jeweils mit und ohne Xylose angezogen. Außerdem sollte getestet werden, ob die C-Quelle Glukose und die N-Quelle Arginin einen Effekt auf das Wachstum des Stamms und die Expression von RocG haben.

Das Ergebnis der Westernblot-Analyse ist in Abbildung 4.9. dargestellt.

Ergebnisse 71

Abb. 4.9. Test des xyloseinduzierbaren Systems.

Die Proteinlösungen des Stamms GP752 wurden in einem SDS-PAA-Gel elektrophoretisch aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran geblottet. Der Nachweis von RocG erfolgte mit polyklonalen RocG-Antikörpern. Der Stamm wurde in CS-Medium angezogen. Die Endkonzentration der Xylose betrug 1,5 %. Hier sind Ergebnisse einer repräsentativen Einzelmessung gezeigt. Der Pfeil markiert das von RocG gelieferte Signal.

Abbildung 4.9. zeigt, daß die katabole Glutamatdehydrogenase RocG im Stamm GP752 nach der Zugabe von Xylose stark exprimiert wird. Die CcpA-abhängige Regulation durch Glukose ist nahezu aufgehoben. Einen geringen Einfluß der Katabolitenrepression ist jedoch erkennbar. In Gegenwart von Glukose ist das RocG-Signal etwas schwächer. Die glukoseanhängige Regulation des xyloseinduzierbaren Systems könnte auf die Stimulation des Repressorproteins XylR durch Glukose bzw. Glukose-6-Phosphat zurückzuführen sein.

Die Glykolyseintermediate Glukose und Glukose-6-Phosphat können die Inaktivierung des Repressors durch Xylose verringern und der Repressor kann schwach an seinen Zielpromotor binden (Dahl et al., 1995). Die schwächere Expression von RocG in Gegenwart von Glukose könnte durch diesen Effekt erklärt werden.

In Abwesenheit von Xylose zeigt der Stamm GP752 den Phänotyp einer rocG-Mutante, da der Stamm ohne Glukose mit Arginin nicht wachsen kann (Abschnitt 4.2.5.). Erst durch die Induktion des rocG-Gens durch Xylose kann das toxische Intermediat aus dem Argininabbauweg über RocG in den Citratzyklus überführt werden. Die Ergebnisse zeigen, daß das xyloseinduzierbare System zur kontrollierten Expression von RocG funktioniert.

Expression der Glutamatsynthase in Gegenwart einer hohen RocG-Menge

Um den Einfluß der RocG-Menge auf die Expression des gltAB-Operons zu testen, wurde der Stamm GP752 in Minimalmedium mit und ohne Glukose angezogen. In Abschnitt 4.2.3. wurde gezeigt, daß die Aktivität bzw. der regulatorische Einfluß der katabolen

Ergebnisse 72 Glutamatdehydrogenase RocG auf die Expression der Glutamatsynthase durch die C-Quelle reguliert werden kann. Man kann daher vermuten, daß es neben der Kontrolle auf transkriptioneller Ebene durch den globalen Regulator des C-Stoffwechsels CcpA einen zusätzlichen Regulationsmechanismus auf der Ebene der Enzymaktivität gibt (Abb. 5.3.).

Durch die Zugabe von Glutamat und Arginin unter nichtinduzierenden und induzierenden Bedingungen sollte daher der Einfluß der beiden Aminosäuren auf die Aktivität der Glutamatdehydrogenase RocG untersucht werden. Als Kontrolle für dieses Experiment wurde der Wildtypstamm GP342 unter den entsprechenden Bedingungen mit angezogen.

Die Ergebnisse des Experiments sind in Tabelle 4.11. dargestellt. Im Wildtyp GP342 wird das gltAB-Operon durch Glukose induziert. Die Aminosäure Glutamat reprimiert das gltAB-Operon etwa zweifach. In Gegenwart von Arginin ist das gltAB-Operon vollständig reprimiert. Die Zugabe des Zuckers Xylose zum Medium hat auf die Regulation des gltAB-Operons im Wildtyp keinen Einfluß (Abschnitt 4.1.2.). In xylosefreiem ist das gltAB-Operon im Stamm GP752 wie im Wildtyp reguliert. Ohne Xylose wird die Glutamatdehydrogenase RocG nur sehr schwach exprimiert (Abb. 4.9.). Offensichtlich reicht die geringe RocG-Expression jedoch dazu aus, das gltAB-Operon zusammen mit der Aminosäure Glutamat zu reprimieren. Durch die Induktion des rocG-Gens mit dem Zucker Xylose ist das gltAB-Operon nicht mehr durch Glutamat reprimierbar. Erst in Gegenwart von Arginin wird das gltAB-Operon wieder vollständig reprimiert.

β-Galaktosidaseaktivität (MU)

Stamm Xylose CS + Glc CSE CSE + Glc CSE + R CSE + R + Glc GP342

(wt) - 417 12 210 8 23

GP752

(pxyl::rocG) - 297 29 119 k.W.¹ 16

GP752

(pxyl::rocG) + 387 740 325 8 20

Tab. 4.11. Der Einfluß der RocG-Menge auf die Expression der Glutamatsynthase.

Die Endkonzentrationen der zugesetzeten Xylose betrug 1,5 %. Hier sind Ergebnisse einer repräsentativen Einzelmessung gezeigt.

Ergebnisse 73 Die Zugabe von Arginin stellt die RocG-vermittelte Repression des gltAB-Operons wieder her. Möglicherweise ist ein Metabolit aus dem Argininabbauweg in der Lage, die katabole Glutamatdehydrogenase RocG zu aktivieren, so daß das Enzym in die Regulation des gltAB-Operons wieder eingreifen kann. Durch Arginin werden auch die Arginin-Transporter RocC und RocF induziert (Calogero et al., 1994; Gardan et al., 1995, 1997).

Demnach sollten sowohl die Konzentrationen der Intermediate des Argininabbauwegs als auch die Glutamatkonzentration höher sein als beim Wachstum mit Glutamat. Die starke Expression der Glutamatsynthase in glutamathaltigem Minimalmedium ohne Glukose und Arginin sowie einer hohen zellulären RocG-Konzentration könnte dadurch zu Stande kommen, daß der aktivierende Metabolit des Argininabbauwegs in geringerer Konzentration vorliegt. Scheinbar müssen die Glutamatedehydrogenase RocG und der aktivierende Metabolit in einem bestimmten Verhältnis in der Zelle vorliegen, damit das gltAB-Operon reprimiert werden kann. Die Ergebnisse zeigen eindeutig, daß es neben der CcpA-abhängigen Regulation des rocG-Gens einen weiteren Regulationsmechanismus auf Proteinebene gibt.

4.3. Hemmung der GltC-Aktivität durch RocG