Diskussion der histologischen Untersuchungsmethode

6.4.2.1 Lagerung der Prüfzähne

Um ein Austrocknen der Prüfzähne zu vermeiden, wurden die Dreier-Zahnblöcke während des Transportes zwischen den Städten Antwerpen, Brüssel, Danzig, Heidelberg und Marburg durch wassergetränkte Tücher und luftdichte Kunststoffboxen feucht gehalten. Nach der Entfernung der Prüfzähne aus den Dreier-Zahnblöcken hat sich die Lagerung in gesättigter Thymol^-Lösung [Mat. 12] bewährt.

6.4.2.2 Entwässerung und Entfettung der Prüfzähne

Da das zum Einbetten benutzte Polyester-Gießharz^ [Mat. 10] hydrophobe Eigenschaften besitzt, ist es notwendig die hydrophile Zahnhartsubstanz zu entwässern. Wir führten eine aufsteigende Alkoholreihe durch, bei der die Prüfzähne jeweils 24 Stunden in 40, 60, 80 und 100% Alkohol [Mat. 7] gelagert wurden. Nach weiteren Versuchen zeigte sich, dass auch eine zwölfstündige Lagerung ausreichend ist.

Zum Entfetten folgte eine zweitägige Lagerung in Xylol^ [Mat. 14], wobei die Zähne nach 24 Stunden in eine zweite frische Xylol^-Lösung überführt wurden. Jedoch ist auch hier eine zwölfstündige Lagerung ausreichend.

Ein an die Entwässerung und Entfettung sofort anschließendes Einbetten der Prüfzähne ist unumgänglich, denn die vorbereiteten Zähne dürfen nicht austrocknen.

Dies würde zu unnötigen Rissbildungen in der Zahnhartsubstanz und daraus resultierenden Instabilitäten führen.

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6.4.2.3 Aufsockeln der Prüfzähne

Um den eher spröden Zahnschmelz während des Sägevorgangs zu stabilisieren und anforderungsorientiert schneiden zu können, ist es notwendig, ihn in geeignete Kunststoffe oder Harze einzubetten. Das Aufsockeln der Prüfzähne soll den Einbettvorgang erleichtern und durch standardisierte Vorgänge beschleunigen.

Acrylglasrohre dienen als Küvette, um dem Probenkörper eine definierte Form zu geben und die zu bearbeitenden Querschnittsflächen in einem sinnvollen Bereich zu halten. Es hat sich jedoch gezeigt, dass ein Mindestabstand zwischen Zahn und Röhrcheninnenwand von ca. 2 – 3 mm vorhanden sein muss. Ist dieser Abstand zu klein, kommt es zu Spannungen, welche zur Rissbildung im Kunststoff führen. So sollten für Molaren nur Acrylglasrohre mit einem Innendurchmesser von nicht kleiner als 16 Millimeter genutzt werden. Anschließende Längenkorrekturen der Prüfkörper können mit minimalem Zeitaufwand an einer Drehmaschine durchgeführt werden, da sich der Prüfkörper ohne Probleme im Drei-Backenfutter einspannen lässt.

6.4.2.4 Einbettvorgang

In einer Vielzahl von Vorversuchen bemühten wir uns das für diese Arbeit optimale Einbettmedium zu finden. Die besten Ergebnisse erzielten wir mit dem Polyester-Gießharz^ der Firma Voss [Mat. 10]. Dieser Werkstoff ist fast farblos, hoch transparent, optisch homogen, leicht zu be- und zu verarbeiten und sehr preiswert. Der Nachteil besteht in der nicht immer spaltfreien Anlagerung des Harzes an die Zahnoberfläche.

Der entstandene Spalt ist jedoch so gering, dass er nur mikroskopisch erkennbar ist.

Beim Einbettvorgang wurde der vorhandene Raum zwischen Prüfzahn und Acrylglasrohr [Mat. 15] mit dem oben beschriebenen Polyester-Gießharz^ [Mat. 10]

aufgefüllt. Dabei kam es zu einer polymerisationsbedingten Schrumpfung des Harzes mit daraus folgenden Schrumpfungsdefekten. Dies zeigte sich besonders deutlich an der konkaven Ausformung der Harzoberfläche oberhalb der Zahnkrone. Ist das dort vorhandene Materialreservoir zu klein, tritt der Zahnschmelz wieder an die Oberfläche.

Aus diesem Grund muss das zum Einbetten verwendete Acrylglasrohr mindestens fünf Millimeter länger sein als der einzubettende Prüfzahn. Steht kein Acrylglasrohr mit der entsprechenden Länge zur Verfügung, ist es möglich, das Rohr mit Hilfe einer Manschette zu verlängern.

Zur Kompensation der Nebenwirkungen des Volumendefizits kann weiterhin Druckeinwirkung von außen erfolgen. Aus diesem Grund stellten wir die Proben in den ersten zwölf Stunden der Polymerisation in einen mit Wasser gefüllten Drucktopf [Mat.

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nur noch die feste Schwindung übrig, mit dem Resultat von kleineren Schrumpfungsdefekten.

Beim manuellen Anmischen von Polyester-Gießharz [Mat. 10] und Härter [Mat. 9]

entstehen sehr schnell Lufteinschlüsse. Dies kann jedoch durch anschließendes Zentrifugieren [Mat. 25] kompensiert werden.

Um eine erneute Blasenbildung zu vermeiden, sollte der Kunststoff in einem dünnen Strahl in die Einbettform gegossen werden. So kann die darin enthaltene Luft schnell und problemlos entweichen.

6.4.2.5 Hartschnitttechnik

In vielen Arbeiten, in denen der histologische Zahnhartschnitt als Goldstandard dient, wurden die zu untersuchenden Zähne lediglich halbiert, wie z.B. bei MEYER [2002], SCHULZE [2004], ERTEN [2005] und GÜNGÖR [2005]. Im Rahmen der Multi-Center-Studie der universitären zahnmedizinischen Einrichtungen Antwerpen, Brüssel, Danzig, Heidelberg und Marburg sollten jedoch Zahnscheiben in einer Dicke angefertigt werden, welche sich den Schnittebenen des µCT zuordnen lassen. Hierzu muss erklärt werden, dass vor der histologischen Aufbereitung der 29 Prüfzähne in Marburg, von jeder Zahnkrone µCT-Aufnahmen mit einer Schichtstärke von 18 – 35 µm in Brüssel angefertigt wurden. Ziel der vorliegenden Studie war demzufolge die Anfertigung von Zahnscheiben mit einer Dicke von ca. 100 µm. Hierfür war es notwendig den Prüfkörper zwischen einer Basisplatte und einem Objektträger zu befestigen (siehe Abb. 4.7, Kap. 4.3.2.4). Mittel der Wahl war die Klebung mit Technovit^ VLC 7230 [Mat. 11]. In Vorversuchen löste sich die Klebung vom Objektträger. Aus diesem Grund mattierten wir die Oberfläche des Objektträgers mit Aluminiumoxid [Mat. 8] mit 25 µm Korn, was zu belastbaren Kleberesultaten führte. Der Verbund zwischen Zahnscheibe und Objektträger war jedoch immer noch nicht befriedigend. Daher testeten wir die Vorbehandlung des Objektträgers mit Tri-Chlor-Ethan [Mat. 13]. Auf den Bereich der Klebung wurde lokal ein Tropfen des Lösungsmittels aufgebracht. Die Einwirkzeit bis zum Beginn des Klebevorgangs betrug 30 Sekunden. Das Lösungsmittel darf im Anschluss nicht abgespült werden und die angelöste Oberfläche darf nicht mehr berührt werden.

Nach Beendigung des Klebevorgangs folgt der eigentliche Zahnhartschnitt. Die in unserer Studie verwendete Diamantband-Säge [Mat. 23] arbeitet nach dem Bandtrennschnitt-Verfahren mit linienförmigem Kontakt des Bandes zur Probe. Dies hat ein gelegentliches Zusetzen der Spanräume zwischen den Diamantkörnern zur Folge. Um diesen Effekt zu minimieren und eine Reinigung des ausgebauten Bandes hinauszuzögern, gaben wir dem Kühlwasser einige Tropfen Tensid hinzu.

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Ein weiteres Problem besteht in der Empfindlichkeit des unter Spannung stehenden Diamantbandes [Mat. 23]. Bei zu starker Belastung oder Verformung durch grobes Anstoßen kann das Band reißen. Bei minimalen feinen Einrissen besteht die Möglichkeit, den initialen Riss Punkt für Punkt zuzulasern (Abb. 6.1).

Abbildung 6.1: Reparatur eines Diamant-Sägebandes durch Laser-Schweißung mit überlappenden Punkten.

Ein komplett gerissenes Band muss jedoch ausgetauscht und das gesamte Trennschleifsystem neu justiert werden. Unterbleibt die Justierung können Keilfehler auftreten, bei denen das Sägeband im Extremfall bis in den Objektträger läuft (Abb.

6.2).

Abbildung 6.2: Darstellung eines starken Keildefekts durch mangelnde Justierung des Sägebandes in Schliffpräparat 9 des Prüfzahnes 7 I. Oral hat die Zahnscheibe eine Stärke von 106 µm. Vestibulär lief das Sägeband in den Objektträger.

vestibulär

oral

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Eine manuelle Nachbearbeitung der frisch gesägten Flächen, sowohl der Zahnscheibe als auch des Prüfkörpers, ist unumgänglich. Sie dient dem Ausgleich von Rauhtiefen, welche durch das Sägen entstanden sind. Diese Unebenheiten sind unter dem Mikroskop deutlich erkennbar und würden in der fotografischen Dokumentation und Befundung stören. In unserer Arbeit hat sich das manuelle Nachschleifen auf nassfestem Aluminiumoxyd-Schleifpapier der Körnung 1.000 [Mat. 16] bewährt. Es muss darauf geachtet werden, dass das Schleifpapier auf einer planen Unterlage liegt und immer feucht und sauber ist. Die durch das Schleifpapier entstandenen Riefen können durch den Kleber beim Eindecken bzw. beim Gegenkleben des nächsten Objektträgers optisch ausgeglichen werden.

6.4.2.6 Digitalfotografische Reproduktion der Schliffpräparate

Zur Herstellung digitaler Bilder von histologischen Zahnhartschnitten gibt es verschiedene Beleuchtungsvarianten. Es besteht die Möglichkeit die Repros im Auflicht, im Durchlicht, im gemischten Auf- und Durchlicht und im polarisierten Durchlicht anzufertigen. Im Vorfeld unserer Arbeit erprobten wir, mit welcher Art der Beleuchtung der zu befundende Schmelz und das angrenzende Dentin am natürlichsten dargestellt werden kann. Ein weiterer Parameter für die Detailgenauigkeit der Repros ist die Dicke der Zahnscheibe. Proben mit einer Stärke von über 400 µm sind für feinere Strukturen zu dick. Es sind zu wenig Details im Dentin erkennbar.

Demgegenüber sind Proben mit einer Stärke von unter 150 µm zu dünn, denn sie werden im Auflicht zu glasig und strukturlos. In Vorversuchen lag das Optimum für Aufnahmen im Auflicht und Mischlicht bei einer Schichtstärke von ca. 340 µm und das Optimum für polarisiertes Licht bei ca. 220 µm.

6.4.2.7 Bewertungsindex

Der Bewertungsindex nach DOWNER [1975] dient der visuellen Kariesbefundung von Zahnoberflächen an der Zahnkrone und wird im Rahmen der Multi-Center-Studie der universitären Einrichtungen Antwerpen, Brüssel, Danzig, Heidelberg und Marburg angewendet. In Marburg, als Teil dieser Multi-Center-Studie, führten wir jedoch eine visuelle Befundung histologischer Schnittpräparate durch. Aus diesem Grund erstellten wir einen, auf die histologischen Querschnittspräparate bezogenen, modifizierten Index nach DOWNER.

C1 = Intakter Schmelz

C2 = Initiale Zahnhartsubstanzveränderungen nur auf den Schmelz begrenzt C3 = Strukturveränderungen des Schmelzes mit initialen Veränderungen im Dentin C4 = Strukturveränderungen in der äußeren Dentinhälfte mit Spaltbildung zwischen

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Schmelz und Dentin oder Kavitätenbildung

C5 = Kavitätenbildung mit Strukturveränderungen im Dentin bis zur Pulpa oder bis in Pulpanähe