Datenauswertung und statistische Verfahren

3.2.4.1 Auswertung der Chromatogramme und Massenspektren Chromatogramme und Massenspektren

Die Aufzeichnung und Auswertung der GC/MS-Daten erfolgte mit Hilfe der Software Finnigan MAT GCQ, Version 2.2, die neben Modulen zur Steuerung der Geräte ein entsprechendes Modul zur Bearbeitung der Daten enthält (GC Data Processing).

Die Software stellt die aufgezeichneten Daten als Chromatogramm, also Auftragung der Signalintensitäten gegen die Retentionszeiten (RT) im Totalionenstrom (TOT) dar (sofern die Daten im SCAN-Modus aufgenommen wurden, vgl. Kap. 3.2.3.1). Der TOT umfasst dabei den gesamten Massenbereich, der für die Datenaufnahme aktiviert wurde.

An jeder beliebigen Stelle kann das (sozusagen in der dritten Dimension) dahinter liegende Massenspektrum abgerufen werden, das dann mit Hilfe einer Spektrenbibliothek identifiziert werden kann. Außerdem ist es möglich, die Darstellung des Chromatogramms auf bestimmte ausgewählte Massen zu beschränken, um in einer Art virtuellem Selected-Ion-Modus (SIM) einen schnellen Überblick zu bekommen, ob eine gesuchte Substanz im Chromatogramm durch einen Peak repräsentiert wird. Diese Darstellungstechnik ist auch geeignet, um ein Grundrauschen bzw. einen Hintergrund, der durch Signale anderer Substanzen (z.B.

Säulenbluten) hervorgerufen wird, in der Darstellung zu eliminieren.

Identifikation von Substanzen

Die Identifikation der Substanzen erfolgt über den Vergleich des zu einer bestimmten Retentionszeit erfassten Massenspektrums mit standardisierten Massenspektren der reinen Stoffe in einer Spektrenbibliothek. In der vorliegenden Untersuchung wurde die Bibliothek NIST MS-Library für Finnigan, Vers. 1.15 mit Stand September 1992, eingesetzt. Die in der Bibliothek gespeicherten Spektren der in Kap. 4.2.1 und 4.2.2. dargestellten Substanzen sind in Abb. 3.2.4.1.A grafisch dargestellt, die relevanten Ionenmassen (M⁺)¹⁾ der Substanzen sind in Tab. 3.2.4.1.A zusammengefasst.

Tab. 3.2.4.1.A Ionenmassen der in dieser Untersuchung mit Hilfe von GC/MS detektierten Substanzen (nach Bundesgesundheitsamt 1989, NIST 1992)

Substanz M⁺

β-Estradiol 272, 213, 172

bis-TMS-Estradiol 416, 285, 326, 232 Cholesterol 386, 275, 301, 368, 353 Cholesterol-TMS-Ether 458, 368, 329, 353

Abb. 3.2.4.1.A Massenspektren der in dieser Untersuchung mit Hilfe von GC/MS detektierten Substanzen (aus NIST 1992)

Quantifizierung von Substanzen

Die Quantifizierung von Substanzen ist ebenfalls direkt mit der verwendeten Analysen-Software möglich. Dazu werden definierte Mengen (eine Verdünnungsreihe) der zu quantifizierenden Substanz in die GC/MS injiziert und gemessen. Die einzelnen Signalintensitäten gegen die Substanzmengen aufgetragen ergeben eine Kalibriergerade, mit deren Hilfe die Software die gesuchte Substanzmenge zu beliebigen im Messbereich des Gerätes liegenden Signalintensitäten berechnet. Quantifizierungen wurden in der vorliegenden Arbeit nur für Cholesterol bzw. sein TMS-Derivat vorgenommen.

Anm. 1) Ionenmassen (M⁺), weil durch die elektrische Ionisation im MS die Massen der Moleküle bzw. Molekülfragmente mit einem zusätzlich angelagerten Proton auftreten (im Gegensatz zu der Masse M des unzerstörten, nicht-ionisierten Moleküls)

3.2.4.2 Auswertung der Radioimmunoassays

Eine Übersicht der insgesamt durchgeführten RIAs (ohne Experimente mit gesonderten Randbedingungen) geben Tab. 8.4.A – 8.4.G im Anhang wieder. Dort sind zunächst alle Einzeldaten tabelliert, unabhängig davon, ob sie nach statistischer Prüfung in die weitere Auswertung übernommen wurden, oder nicht.

Die Umrechnung der vom Gamma-Counter ermittelten cpm-Werte (nicht tabelliert) in zugehörige Konzentrationen von E2 werden automatisiert von der RIA-CALC-Software vorgenommen. Ergebnis ist eine Liste von Konzentrationswerten, die die Menge des in der einzelnen RIA-Probe gefundenen E2 wiedergeben (Spalte „Messwert [pg]“). Diese Messwerte müssen zunächst geprüft werden, und anschließend in Konzentrationswerte umgerechnet werden, die sich direkt auf die untersuchten Extrakte beziehen.

• Erstes Prüfkriterium ist die Lage der Messwerte selbst in Relation zur zugehörigen Standardkurve (Standardwerte nicht tabelliert). Fallen Messwerte aus dem linearen Bereich der Standardkurve, so sind sie in der Spalte „Messwert [pg]“ in Fettschrift notiert und finden später keine Berücksichtigung mehr.

• Zweites Prüfkriterium ist die Intraassay-Präzision des RIAs. Bei der Auswertung von Daten aus RIAs wird neben der Sensitivität und Spezifität (Kreuzreaktivität) als wichtigster Parameter die Präzision des Assays bestimmt. Dabei wird die Intraassay-Präzision durch Mehrfachbestimmung derselben Probe in einem Ansatz ermittelt.

Diese Ermittlung ist durch die Doppelbestimmung jeder in den einzelnen Assay eingesetzten Konzentration möglich (vgl. Tab. 3.2.3.2.A). Die Intraassay-Präzision

wird durch den Variationskoeffizienten der gemessenen Konzentrationen (in Prozent) ausgedrückt:

x

CV = s ×100 [%]

CV wurde für jedes einzelne Paar der in den Assay eingesetzten Konzentrationen der Extrakte bestimmt (Spalte „CV Messwert [%]“ der Tabellen). Ziel bei jedem RIA sollte ein möglichst niedriger CV sein, der allerdings für jede Testumgebung und Matrix separat bestimmt werden muss. In der klinischen Praxis werden in der Regel CV-Werte, die 25 % übersteigen, als mangelnde Präzision angesehen und führen zum Ausschluss der Werte aus der weiteren Analyse.

• Drittes Prüfkriterium in der vorliegenden Arbeit ist die Prüfung der Verdünnbarkeit der Extrakte im RIA, d. h. der Vergleich der Messergebnisse verschiedener Verdünnungen desselben Extraktes (vgl. Tab. 3.2.3.2.A). Dazu wird jeweils der Mittelwert (Spalte „Mittel Messwert [pg]“) der beiden Bestimmungen einer Verdünnungsstufe herangezogen, und auf die geringste Verdünnungsstufe normiert (Spalte „Mittel Messwert normiert [pg]“), damit alle drei Mittelwerte vergleichbar werden. Die drei Mittelwerte können als Mehrfachbestimmungen derselben Probe über mehrere Ansätze hinweg interpretiert und somit für die Ermittlung der Interassay-Präzision verwendet werden. Die Interassay-Interassay-Präzision wird ebenfalls über den Variationskoeffizienten (in Prozent) ausgedrückt (vgl. o.). Die errechneten Werte wurden in der Spalte „CV Messw. normiert [%]“ tabelliert, und sollten auch hier möglichst niedrig liegen. Höhere Werte sind ein Indiz dafür, dass sich die drei getesteten Verdünnungen im RIA unterschiedlich verhalten, also die Matrix der Extrakte einen Einfluss auf die immunochemische Reaktion zwischen Antikörper und Antigen hat.

Reale Prüfungen der Interassay-Präzision wurden darüber hinaus durchgeführt (d.h.

mehrfache unabhängige Assays verschiedener Extrakte der gleichen Individuen, vgl.

4.3.1 u. 4.3.2).

• Die Spezifität (Kreuzreaktivität) des Antikörpers #22.2 wurde durch qualitative Tests von Boden- und Pflanzenproben untersucht (vgl. 4.4.3 und 4.4.4).

4. Ergebnisse

Vorbemerkung: Nomenklatur der Proben

Vor der Darstellung der Ergebnisse soll hier die Nomenklatur der in dieser Arbeit untersuchten Proben zusammengefasst werden, die aufgrund der verschiedenen verwendeten Verfahren und z.T. aufeinander aufbauenden Analysen eindeutig zugeordnet werden müssen, um Verwechslungen oder Missverständnisse bei der Interpretation der Ergebnisse zu vermeiden.

Individuen-Bezeichnungen

In unterster Ebene sind zunächst die Knochen-, Blut- und Pflanzenproben zu benennen (Erläuterungen in 3.1, Tabellen in 8.3), hier als „Individuen“ bezeichnet. Hierfür findet jeweils eine Buchstaben-/Zahlenkombination Verwendung (Beispiele):

G01 Individuum Nr. 1, Rezentknochen Göttingen M01 Individuum Nr. 1, Rezentknochen München DO0901 Individuum Nr. 901, historischer Knochen Dorste GS0035 Individuum Nr. 35, historischer Knochen Goslar R01 Individuum Nr. 1, Rattenknochen

B01 Bodenprobe Nr. 1 C01 Pflanzenprobe Nr. 1

Diese Individuen-Bezeichnungen ersetzen die Original-Probenbezeichnungen aus den Grabungen, Sektionen usw.

Extrakt-Bezeichnungen

Von jedem Individuum können mehrere Extraktionen erfolgt sein (es stand unterschiedlich viel Material zur Verfügung). Die Extraktionen sind durch zweistellige Zahlen angegeben und einfach durchgezählt (sie korrespondieren nicht mit einer bestimmten Extraktionsrunde). Sie werden mit einem Schrägstrich an die Nummer des Individuums angehängt. Die Kombination aus Individuen-Bezeichnung und Zahl der Extraktion kennzeichnen damit eindeutig die Extrakte (Beispiele):

G01/01 Erster Extrakt des Rezentknochens Göttingen G01 GS0035/01 Erster Extrakt des Individuums 35, hist. Knochen Goslar

Leerkontrollen, die bei den Extraktionen mitgeführt wurden, erhielten eine eigene Individuen-Bezeichnung, kombiniert aus dem Buchstaben L und einer zweistelligen Zahl (z.B. L01):

L01/01 Extrakt erste Leerkontrolle

L02/01 Extrakt zweite Leerkontrolle

Sowohl in die GC/MS, als auch die RIAs und die HPLC eingesetzte Proben (Extrakte) tragen daher eine eindeutige Extrakt-Bezeichnung.

Bezeichnungen der GC/MS-Analysen

Die einzelnen Analysen der Extrakte in der GC/MS werden, falls notwendig, durch separate Bezifferung dargestellt, da in der vorliegenden Arbeit nur ausgewählte Ergebnisse präsentiert werden, die Mehrzahl der (erfolglosen) GC/MS-Messungen jedoch nicht dokumentiert wird.

Analysen von Standards und Leerkontrollen erhalten ebenfalls eine separate Bezifferung (GC/MS-Leerkontrollen = Injektion reinen Lösemittels, diese sind nicht gleich den Extrakt-Leerkontrollen!).

Bezeichnungen der RIAs

Die durchgeführten RIAs werden durch die Bezeichnung der Extrakte und das Datum identifiziert, verschiedene eingesetzte Konzentrationen eines Extraktes lediglich in der Messdatentabelle vermerkt und nicht separat ausgewiesen.

Bezeichnungen der HPLC-Analysen

Die in die HPLC eingesetzten Extrakte werden unter ihren Extrakt-Bezeichnungen geführt.

Die gesammelten Fraktionen von 01 beginnend durchgezählt; für den Einsatz der Fraktionen in den RIA ergibt sich damit eine Benennung, die Proben-Bezeichnung und Fraktions-Nummer kombiniert (Beispiele):

GS0035/01-01 Erste Fraktion der HPLC von Extrakt GS0035/10 GS0035/01-02 Zweite Fraktion der HPLC von Extrakt GS0035/10

Analysen von Standards und Leerkontrollen erhalten eine separate Bezifferung (HPLC-Leerkontrollen = Injektion reinen Lösemittels, diese sind nicht gleich den Extrakt-Leerkontrollen!).