C. Die chromosomalen Marker D2S139, D8S1988, D11S1377 als Indikatoren
2.1 Polymerasekettenreaktion
Die PCR wurde wie unter Kapitel 2.2.4 des allgemeinen Teils beschrieben durchgeführt und unter den folgenden Konditionen angesetzt:
II Spezieller Teil – Kapitel B 72 Tabelle 23: HLA-PCR Mastermix, für 5 Proben bei 5µl Einsatz der
DNA, pro Probe 95µl Ansatz
Komponenten Volumen
H2O 302.5µl
Puffer 50µl
dNTPs 80µl
Primer C 40µl
Taq Polymerase 2.5µl
DNA 5µl
PCR-Programm:
Initiale Denaturierung 95 °C, 5 min.
95 °C, 15 sek
30 Zyclen 55 °C, 15 sek
75 °C, 15 sek Finale Extension 72 °C, 6 min.
Kühlung 4 °C, ∞
Der Erfolg der PCR wurde auf einem 2%-Agarosegel überprüft.
2.1.2.2 Enzyme Linked Probe Hybridisation Assay (ELPHA) Vorbereitung:
Herstellung 2x SSC / 0.1% SDS: 100ml Lösung 3 + 800ml Aqua dest.
+ 100ml Lösung 4 Herstellung Puffer A: 100ml Lösung 5
900ml Aqua dest.
Herstellung Puffer B (Konjugatverdünnungspuffer): Puffer A wurde bis kurz unterhalb des Siedepunktes erhitzt und 10ml in ein Fläschen Lösung 6 (lyophilisiert) überführt. Die Lösung wurde gut geschüttelt, damit sich das Blockierungsreagenz vollständig auflöste. 6ml der Lösung 6 reichten für eine Platte aus. Der Puffer B wurde bei –20°C aufbewahrt.
Herstellung der Konjugatverdünnung: Vor dem Gebrauch wurde Lösung 7 hochtourig abzentrifugiert. Die Lösung 7 (Konjugat) wurde auf 1:1000 in Puffer B verdünnt, d.h. es wurden für 1 Platte 10µl der Lösung 7 in 10ml Lösung 6
II Spezieller Teil – Kapitel B 73
(Puffer B) pipettiert und gut gemischt. Die Konjugatverdünnung sollte immer frisch angesetzt werden.
Weitere Hinweise bzgl. des Materials und der Testdurchführung sind im Begleitheft des Mikrotestplattensets der Firma Biostest nachzuschlagen.
Versuchsdurchführung:
Wenn mehrere Proben gleichzeitig bearbeitet wurden, so wurden vor Versuchsbeginn die entsprechenden Mikrotestplatten gesteckt. Für eine komplette Typisierung einer Probe wurden drei Streifen à acht Kavitäten benötigt. Alle Reagenzien wurden vorher auf Raumtemperatur gebracht.
1. Es wurden 90µl des PCR-Produktes in ein 2ml Reaktionsgefäß gegeben und 400µl Lösung 1 hinzugefügt. Der Ansatz wurde bei Raumtemperatur fünf Minuten inkubiert.
2. Es erfolgte die Zugabe von 400µl Lösung 2 sowie anschließend 800µl Aqua dest., der Ansatz wurde gut gemischt.
3. In jede Kavität der Mikrotestplatte wurden nun 50µl der verdünnten PCR-Produkte pipettiert. Die Platte wurde mit der selbstklebenden Folie verschlossen und bei 46°C 45min im Wasserbad inkubiert. Die Temperatur des Wasserbades musste exakt eingehalten werden. Dies ist wichtig für die Hybridisierungsreaktion und den späteren Stringenz-Waschschritt.
4. Anschließend wurde die Hybridisierungslösung verworfen und die Platte zweimal mit 2x SSC / 0.1% SDS (Lösung 3+4 zusammen 1:10 verdünnt) bei Raumtemperatur mit dem Elisa-Washer gewaschen. Pro Kavität wurden 200µl eingesetzt. Nach dem zweiten Waschschritt wurden in jede Kavität 200µl 2x SSC / 0.1% SDS durch den Washer hinzugegeben.
Dieser Waschschritt entfernte alle nicht gebundenen Sonden.
5. Die Platten wurden erneut mit selbstklebender Folie abgeklebt und bei 46°C 15min im Wasserbad inkubiert. Durch diesen Stringenzwaschschritt wurden nicht homologe Sonden von der DNA gelöst. Deshalb war auch hier wichtig, dass das Wasserbad genau temperiert war.
II Spezieller Teil – Kapitel B 74
6. Nach Ende der Inkubationszeit wurde die Waschlösung verworfen. Die Platte wurde dreimal mit 200µl Puffer A (Lösung 5, 1:10 verdünnt) pro Kavität im Elisa-Washer gewaschen.
7. Pro Kavität wurden nun 50µl der Konjugatverdünnung mit einer Mehrkanalpipette zugegeben, anschließend wurde die Platte 30min bei Raumtemperatur inkubiert.
8. Die Konjugatverdünnung wurde verworfen. Die Platte wurde erneut dreimal mit 200µl Puffer A pro Kavität im Elisa-Washer gewaschen.
9. Pro Kavität wurden 50µl Lösung 8 (gebrauchsfertige Substratlösung) hinzugegeben. Die Platte wurde dann 15min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Bei diesem Schritt erfolgt in den Kavitäten, in denen homologe Sonden gebunden hatten, ein Farbumschlag von farblos nach blau, da das an die Antikörper gekoppelte Enzym (POD) das Substrat (TMB) umsetzte.
10. Die Reaktion wurde gestoppt, indem 50µl 1 N (2.5%) Schwefelsäure pro Kavität hinzugefügt wurden. Die Farbe schlug von blau nach gelb um.
11. Die Ergebnisse wurden photometrisch durch Messung der Absorption bei 450nm (Referenzfilter bei 620nm) im ELISA-Reader bestimmt (Biotest ELPHA DRB LowRes Bulk, Handbuch Januar 2000).
3. Ergebnisse
83 Trios konnten genotypisiert werden. Die Auswertung erfolgte photometrisch durch Messung der Absorptiom im Elisa-Reader. Alle OD-Werte über 0.200 wurden als positive Resultate gewertet. Die Ergebnissinterpretation wurde unter Verwendung der Biotest ELPH Typing Software (Art.Nr. 847 070) durchgeführt.
13 verschiedene Allele wurden gefunden. Die Allelfrequenzen der Indexfälle sind in Abbildung 8 dargestellt. Die Transmissionsraten der einzelnen Allele sind Tabelle 25 zu entnehmen. Bei keinem der Allele konnte der ETDT ein Kopplungsungleichgewicht am DRB1 Locus feststellen; (gesamte Allel-weise Analyse χ2 (12) = 12.533, p = 0.500; highest single allele χ2 = 2.381, p = 0.123) siehe dazu Tabelle 24.
II Spezieller Teil – Kapitel B 75 Tabelle 24: χ2, Freiheitsgrade und p-Werte für Allelweise, Geno-
typweise und Güte der Anpassung des Allelweise- Model
TDT χ2 df p-Wert*
Allelweise 12.533 12 0.500
Genotypweise 53.743 46 0.681
Güte der An-passung des Allelweise-Model
41.210 34 0.673
*p-Wert (empirical, 1000 replications)
Abbildung 8: Verteilung der HLA-DRB Allele bei den Patienten und Eltern. Auf der x-Achse sind die detektierten HLA-DRB Allele abgetragen. Auf der y-x-Achse sind die Allelfrequenzen in % dargestellt. Die schwarzen Balken entsprechen den erkrankten Kindern, die weißen Balken den Eltern.
DBH1
0,00%
2,00%
4,00%
6,00%
8,00%
10,00%
12,00%
14,00%
16,00%
01 03 04 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 Allel Number
Relative Frequency
Patient Parents
II Spezieller Teil – Kapitel B 76
Tabelle 25: Transmissionsraten der einzelnen DRB-Allele DRB-Allele Transmittiert Nicht
transmittiert
Transmissions -rate
95% CI*
1 26 16 0.619 0.456-0.764
3 20 16 0.556 0.381-0.721
4 16 14 0.533 0.343-0.717
7 19 20 0.487 0.324-0.652
8 6 9 0.400 0.163-0.677
9 0 2 0.000 0.000-0.842
10 0 1 0.000 0.000-0.975
11 20 17 0.541 0.369-0.705
12 3 6 0.333 0.075-0.701
13 12 24 0.333 0.186-0.510
14 5 3 0.625 0.245-0.915
15 15 18 0.455 0.281-0.637
16 2 0 1.000 0.158-1.000
*CI = Confidence Interval, ohne Monte Carlo Simulation
4. Diskussion – HLA-DRB Genotypisierung bei GTS-Patienten
II Spezieller Teil – Kapitel B 77
Die Tatsache, dass keine der bisher durchgeführten genom-weiten Kopplungsuntersuchungen eine Kopplung zu dem HLA-DRB Locus auf Chromosomen 6 zeigte, schließt jedoch eine mögliche Rolle dieses Locus in der Pathogenese von GTS nicht aus, insbesondere wenn eine polygenetische Vererbung angenommen wird. Eine polygenetische Vererbung bedeutet, dass gleichzeitig Veränderungen in mehreren Genen vorliegen. Dabei werden diskrete Vererbungsmuster von quantitativen Vererbungsmustern unter-schieden. Erstere werden an dem Vorliegen einer bestimmen Variablen gemessen, z.B. Entwicklung eines Typ 1 Diabetes. Letztere stellen eine kontinuierliche Variable (z.B. arteriellen Hypertonus) dar, deren Resultat das Zusammenwirken mehrerer individueller quantitativer Loci ist (Lander und Schork 1994). Bei GTS ist schwierig zu sagen welches Vererbungsmuster vorliegt. Im Falle eines quantitativen Vererbungsmusters könnte der HLA-DRB Locus wenn auch nur eine kleine Rolle spielen.
Die Kriterien, die einer Assoziation mit HLA Markern bei klassischen Autoimmunerkrankungen zugrunde liegen, konnten bisher bei keiner Autoimmunerkrankung vollständig geklärt werden. Die bisher gefundenen Assoziationen variieren in ihrer Stärke, bei allen untersuchten Erkrankungen spielen wahrscheinlich neben der HLA Region auch noch andere Gene eine Rolle, die dann gemeinsam zum Ausbruch oder zur Prädisposition der jeweiligen Erkrankung führen (Mackay 2000).
Die Tatsache, dass keines der HLA-DRB Subtypen eine auffällige Transmissionsrate bei den 83 GTS Trios zeigt, macht eine Beteiligung des HLA-DRB Locus in der Pathogenese des GTS unwahrscheinlich.
II Spezieller Teil – Kapitel C 79
unter Einschluss der Eltern der Indexpatienten insgesamt drei von fünf chromosomalen Bereichen (2p11, 8q22 und 11q23-24), die zuvor eine deutliche Assoziation zu GTS gezeigt hatten (p<0.05), bestätigt werden (Simonic et al.
2001).
Bisher existiert noch keine Studie, die die Relevanz dieser Marker in einer „out-bred“ Population untersucht hat. Zudem sind die Ergebnisse einer isolierten Population nicht einfach auf eine gemischte „out-bred“ Population, zu übertragen, da Genotypen- und Allelfrequenzen variieren und genetische Ursachen einer Erkrankung populationsspezifisch sein könnten. Isolierte Populationen unterscheiden sich aus oben genannten Gründen untereinander sowie auch gegenüber gemischten Populationen in ihrem genetischen Hintergrund, ihrer Geschichte und der gemeinsamen Umgebung. Deshalb ist es notwendig jedes signifikante Ergebnis in einer zweiten Population zu überprüfen. Gene oder genetische Suszeptibilitätsfaktoren, die durch eine Studie insbesondere in einer gemischten Population bestätigt werden konnten, wären für einen weitaus größeren Teil der Bevölkerungen relevant (Peltonen et al. 2000). Aus diesem Grund soll in der vorliegende Arbeit untersucht werden, ob in einer deutschen Studienpopulation von GTS-Patienten ebenfalls eine Assoziation zwischen GTS und diesen Markern, besteht.
2. Methodik
2.1 Polymerasekettenreaktion
Die Polymerasekettenreaktion wurde, wie unter Kapitel 2.2.4 des allgemeinen Teils beschrieben, durchgeführt. Im folgenden sind die entsprechenden Primersequenzen der untersuchten Marker dargestellt.
II Spezieller Teil – Kapitel C 80 Tabelle 26: Primersequenzen der Polymorphismen, die in der Afrikaner Population eine Assoziation zu GTS zeigten
Marker Primersequenz Annealing
temp.
Zyclen
D2S139 F: AGC TCA AAG CAA ATG CAT GC FAM markiert
R: AAA TTG CGA AAC TGT GGC TT
55° 27
D8S1988 F: CCT TTG GAC TCA GAC CAG AA FAM markiert
R: TAG TCA GAG TCC TCA GAG AAA CA
55° 27
D11S1377 F: TTT ATT CCT CTC CTA AAT CAC CA HEX markiert
R: CTT TGC TTC CTG TCC TGC T
55° 27