3.6.1. Durchflusszytometrische Analyse der Zellzyklusverteilung in aNSZ-Kul-turen nach TGF-beta1-Behandlung
Die bisherigen Ergebnisse zeigten einen weitreichenden Einfluss von TGF-beta1 auf aNSZ-Kulturen, darunter auch eine verminderte Proliferationsrate nach TGF-beta1-Behand-lung (vgl. 3.3.1). Da dieser Befund einen Einfluss von TGF-beta1 auf den Zellzyklus ver-muten lässt, und in Vorarbeiten bereits belegt werden konnte, dass TGF-beta1 in aNSZ-Kul-turen zu einer Verschiebung des Zellzyklus hin zur G0/G1-Phase führt (Wachs et al., 2006), war ein Ziel der vorliegenden Dissertation diese Verschiebung eingehender zu charakteri-sieren und zu beschreiben. Zur Charakterisierung der TGF-beta1-induzierten Veränderungen im Zellzyklus aNSZ wurde eine Immunfärbung gegen das Ki67-Antigen in Kombination mit einer DNA-Färbung (PI) durchgeführt und mittels einer anschließenden durchflusszytome-trischen Analyse die Zellzyklusverteilung ermittelt. Dazu wurden aNSZ über einen Zeitraum
FL3-A
von sieben Tagen in Anwesenheit von TGF-beta1 oder 4 mM HCl mit 1 mg/ml BSA (Kon-trolle) kultiviert. Im Anschluss wurden die Zellen dissoziiert, fixiert und mit einem IgG-Kon-troll- bzw. Ki67-Antikörper und PI gefärbt. Das Ki67-Antigen ist in allen aktiven Phasen des Zellzyklus (G1, S, G2/M) detektierbar, während es in ruhenden Zellen (G0-Phase) nicht nach-weisbar ist. Abbildung 29 zeigt die Verteilung der Zellen auf die Zellzyklusphasen G0/G1, S und G2/M der Kontrolle (A) und nach TGF-beta1-Stimulierung (B) anhand zweier beispiel-hafter, einparametrischer DNA-Histogramme (PI-Färbung). Verglichen mit der Kontrolle be-wirkte die Inkubation mit TGF-beta1 eine deutliche Erhöhung der G0/G1-Phase-Fraktion. So-mit konnten die Daten aus den Vorarbeiten bestätigt werden.
Abbildung 29: Repräsentative einparametrische DNA-Histogramme von PI-gefärbten Zellen einer A) kontroll-behandelten Kultur und B) einer TGF-beta1-behandelten Kultur. aNSZ wurden im Vorfeld für 7 Tage mit TGF-beta1 oder HCl/BSA kultiviert. Danach wurden die Zellen fixiert und mittels PI gefärbt.
Schließlich wurden die einparametrischen DNA-Histogramme am Durchflusszytometer aufgezeichnet.
Der DNA-Gehalt wird anhand der Auftragung der Anzahl der Ereignisse gegen die Signalfläche der PI-Fluoreszenz (FL3-A) dargestellt. Die G0/G1-Phase-Fraktion der TGF-beta1-behandelten Zellen ist gegen-über der Kontrolle deutlich erhöht.
Um die genaue Position TGF-beta1-behandelter aNSZ im Zellzyklus zu bestimmen, wurden die am Durchflusszytometer gemessenen Daten mit der Software Win MDI 2.8. im Hinblick auf die Zellzyklusverteilung ausgewertet, indem die prozentualen Anteile der Zellen in den einzelnen Zellzyklusphasen bestimmt wurden. In den Abbildungen 30 und 31 sind die wich-tigsten, zur Auswertung relevanten Messungen exemplarisch dargestellt. Abbildung 30 zeigt eine repräsentative Immunfärbung gegen Ki67 mit zusätzlicher DNA-Färbung von kon- troll-behandelten Zellen. In Teilabbildung A ist in einem zweiparametrischen Dot-Plot die Granularität der Zelle (SSC-H) gegen ihre Größe (FSC-H) aufgetragen. Zelltrümmer und Farbstoffaggregate, die sich durch schwache FSC- und SSC-Signale auszeichnen, wurden be-reits von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Es ist nur die Zellpopulation vitaler Zellen dargestellt, die für die weitere Analyse ausgewählt wurde. Um auch Zelldubletten von der Auswertung auszuschließen, wurde in einem weiteren Dot-Plot die Signalfläche der PI-Fluo-reszenz (FL3-A, Signalintegral) auf der Ordinate gegen die Signalweite der PI-FluoPI-Fluo-reszenz (FL3-W, Signaldauer) auf der Abszisse aufgetragen und die gewünschte Zellpopulation durch die Region R1 markiert (Teilabbildung 30 B). Die darin enthaltenen Zellen wurden dann in
FL3-A
einer zusätzlichen Auftragung der Signalhöhe der Ki67-Fluoreszenz (FL1-H) gegen die Signalfläche der PI-Fluoreszenz (FL3-A) veranschaulicht (Teilabbildung 30 C). Die Region R2, welche die Ki67-negativen Zellen markiert und Region R3 (G0-Phase-Zellen) beinhaltet, wurde anhand der IgG/PI-Färbung von kontroll-behandelten Zellen festgelegt. Davon aus-gehend wurden die Regionen R3 (G0-Phase-Zellen), R4 (G1-Phase-Zellen), R5 (S-Phase-Zel-len) und R6 (G2/M-Phase-Zel(S-Phase-Zel-len) zur Quantifizierung der Ki67-immunreaktiven Zellen de-finiert und schließlich mittels Win MDI 2.8. die prozentualen Anteile der Zellen in den einzelnen Zellzyklusphasen berechnet.
Abbildung 30: Repräsentative Dot-Plots kontroll-be-handelter Zellen. aNSZ wurden für 7 Tage mit HCl/
BSA kultiviert. Dann wurden sie fixiert und mit einem Antikörper gegen Ki67 und PI gefärbt, bevor sie am FACS vermessen wurden. A: Gating in einem FSC (Größe der Zellen)/SSC (Granularität der Zellen)-Dot-Plot: Es sind nur die Zellen gezeigt, die für die weitere Analyse ausgewählt wurden. B: Die in A ausgewählten Zellen sind in einer Auftragung der Signalfläche der PI-Fluoreszenz (FL3-A) gegen die Signalweite der PI-Fluo-reszenz (FL3-W) abgebildet. Durch die Region R1 wer-den Zelldubletten von der weiteren Auswertung ausge-schlossen. C: Auftragung der Signalhöhe der Ki67-Fluo-reszenz (FL1-H) gegen die Signalfläche der PI-Fluo- reszenz (FL3-A) der in R1 markierten Zellpopulation.
Ki67-immunreaktive Zellen werden den Regionen R4 (G1-Phase), R5 (S-Phase) und R6 (G2/M-Phase) zuge-ordnet. G0-Phase-Zellen finden sich innerhalb R3.
Abbildung 31 gibt die Verhältnisse in TGF-beta1-behandelten Zellkulturen wieder. Auch hier ist beispielhaft eine Immunfärbung gegen Ki67 mit zusätzlicher DNA-Färbung abgebildet.
Die Auswertung erfolgte in analoger Weise zu der Auswertung der kontroll-behandelten Zel-len, außer dass die Region R2, welche die Ki67-negativen Zellen markiert und Region R3 (G0-Phase-Zellen) beinhaltet, anhand der IgG/PI-Färbung von TGF-beta1-behandelten Zellen festgelegt wurde. Zur Quantifizierung der Ki67-immunreaktiven Zellen in TGF-beta1-be- handelten Kulturen wurden die Regionen R3 (G0-Phase-Zellen), R4 (G1-Phase-Zellen), R5
FSC-H
(S-Phase-Zellen) und R6 (G2/M-Phase-Zellen) definiert und mit Hilfe von Win MDI 2.8. die prozentualen Anteile der Zellen in den einzelnen Zellzyklusphasen errechnet.
Abbildung 31: Repräsentative Dot-Plots von TGF-be-ta1-behandelten Zellen. aNSZ wurden für 7 Tage mit TGF-beta1 kultiviert. Dann wurden sie fixiert und mit einem Antikörper gegen Ki67 und PI gefärbt, bevor sie am FACS vermessen wurden. A: Gating in einem FSC (Größe der Zellen)/SSC (Granularität der Zellen)-Dot-Plot: Es sind nur die Zellen gezeigt, die für die weitere Analyse ausgewählt wurden. B: Die in A ausgewählten Zellen sind in einer Auftragung der Signalfläche der PI-Fluoreszenz (FL3-A) gegen die Signalweite der PI-Fluo-reszenz (FL3-W) abgebildet. Durch die Region R1 wer-den Zelldubletten von der weiteren Auswertung ausge-schlossen. C: Auftragung der Signalhöhe der Ki67-Fluo-reszenz (FL1-H) gegen die Signalfläche der PI-Fluo-reszenz (FL3-A) der in R1 markierten Zellpopulation.
Ki-67-immunreaktive Zellen werden den Regionen R4 (G1-Phase), R5 (S-Phase) und R6 (G2/M-Phase) zuge-ordnet. G0-Phase-Zellen finden sich innerhalb R3.
Die Mittelwerte aus jeweils drei durchgeführten, unabhängigen Messungen für kontroll- und TGF-beta1-behandelte Zellen sind in Abbildung 32 mit der zugehörigen Standardabweichung in Form von Balkendiagrammen dargestellt. Die Quantifizierung der Zellzahlen in den einzelnen Zellzyklusphasen ergab eine signifikante Erniedrigung der S-Phase-Fraktion in TGF-beta1-behandelten Zellen im Vergleich zur Kontrolle von 16,4 % auf 13,2 %. Demge-genüber steht ein nahezu konstanter G2/M-Phase-Anteil (Kontrolle: 7,2 %; TGF-beta1:
5,7 %) und ein ebenfalls nicht signifikant veränderter G1-Phase-Anteil von 48,7 % in kon-troll-behandelten Kulturen und 39,2 % nach TGF-beta1-Behandlung. Am stärksten beein-flusst zeigte sich die G0-Phase-Fraktion, die in TGF-beta1-behandelten Zellen signifikant er-höht war. So resultierte die Inkubation mit TGF-beta1 in einem Anstieg der Ki67-defizienten Zellen auf 38,5 %, während nur 24,8 % der Kontrollzellen der quieszenten G0-Phase zuge-ordnet werden konnten.
Abbildung 32: Quantifizierung der prozentualen Anteile aNSZ in den verschiedenen Zellzyklusphasen nach 7-tägiger Kultivierung mit und ohne TGF-beta1. Nach TGF-beta1-Behandlung war der Anteil an Ki67-negativen G0-Phase-Zellen signifikant erhöht, während die S-Phase-Fraktion signifikant erniedrigt war. Die berechneten Anteile der Ki67-immunreaktiven Zellen in der G1- und G2/M-Phase ließen keine Unterschiede zwischen kontroll- und TGF-beta1-behandelten Kulturen erkennen. Es sind die Mittelwerte aus drei unabhängig durchgeführten Messungen mit der Standardabweichung gezeigt. *p<0.05; **p<0.01
Insgesamt waren 72,3 % der Kontrollzellen immunreaktiv für den Proliferationsmarker Ki67;
in TGF-beta1-behandelten Kulturen konnte nur in 58,1 % der Zellen die Expression von Ki67 nachgewiesen werden. Somit konnte die in Kap. 3.3.1 beschriebene Inhibierung der Zellpro-liferation durch TGF-beta1, welche anhand eines MTT-Assays nachgewiesen wurde, noch-mals bestätigt werden. Diese lässt sich, wie gezeigt wurde, durch eine signifikant verminderte S-Phase-Fraktion erklären, die dadurch zustande kommt, dass aufgrund des Einflusses von TGF-beta1 38,5 % der Zellen den Zellzyklus verlassen und in die quieszente G0-Phase über-gehen.
3.6.2. Charakterisierung der molekularen Veränderungen in der Expression von Zellzyklusgenen nach TGF-beta1-Behandlung
Zur allgemeinen Charakterisierung der molekularen Veränderungen in aNSZ-Kulturen in Abhängigkeit von TGF-beta1 wurde eine DNA-Array-Genexpressionsanalyse durchge-führt. Dazu wurden aNSZ sieben Tage in Anwesenheit von TGF-beta1 oder 4 mM HCl mit 1 mg/ml BSA (Kontrolle) kultiviert und anschließend die Expressionsänderung einer Vielzahl an Genen untersucht. Auffallend war dabei, dass zahlreiche regulierte Gene dem Bereich des Zellzyklus zugeordnet werden konnten. Diese sind in der folgenden Tabelle 21 als Übersicht zusammengefasst. Besonders hervorzuheben ist die veränderte Expression mehrerer Cycline nach TGF-beta1-Behandlung wie Cyclin D2, Cyclin E, Cyclin G1 und Cyclin B1, welche eine entscheidende Rolle bei der Progression der Zellen im Zellzyklus spielen. Darüber hinaus wird deutlich, dass die Mehrzahl der regulierten Zellzyklus-assoziierten Gene eine
vermin-derte Expression nach TGF-beta1-Behandlung aufweist, was die proliferationshemmende
response gene to complement 32 ↑
Synaptonemal complex protein 3 ↑
calmodulin 1 ↑
signal transducer and activator of transcription 1 ↑
prothymosin alpha ↓
nuclear distribution gene C homolog (Aspergillus) ↓
nuclear autoantigenic sperm protein ↓
mediator of DNA damage checkpoint 1 ↓
tumor protein p53 ↓
polo-like kinase 1 (Drosophila) ↓
acidic nuclear phosphoprotein 32 family, member B ↓
Hexokinase 2 ↓
cyclin E ↓
mini chromosome maintenance deficient 6 (S. cerevisiae) ↓
karyopherin (importin) alpha 2 ↓
chaperonin containing TCP1, subunit 2 (beta) ↓
cyclin G1 ↓
DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily C, member 2 ↓
apoptosis antagonizing transcription factor ↓
mitogen activated protein kinase 3 ↓
guanine nucleotide binding protein-like 3 (nucleolar) ↓
cyclin B1 ↓
cell division cycle 20 homolog (S. cerevisiae) ↓
cyclin-dependent kinase inhibitor 1C (P57) ↓
nucleophosmin 1 /// similar to Nucleophosmin (NPM) (Nucleolar
phosphoprotein B23) (Numatrin) (Nucleolar protein NO38) ↓ myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian) ↓ Inhibitor of DNA binding 3, dominant negative helix-loop-helix
protein ↓
Tabelle 21: Übersicht über die veränderte Expression Zellzyklus-assoziierter Gene nach TGF-beta1-Be-handlung. aNSZ wurden für 7 Tage mit TGF-beta1 oder 4 mM HCl mit 1 mg/ml BSA (Kontrolle) kulti-viert. Anschließend wurden die Expressionsänderungen mittels einer DNA-Array-Analyse untersucht.