C.2. Thi9 besitzt keine Ähnlichkeit zu bekannten Thiamintransportern

Das Gen thi9⁺ besitzt keine Introns und kodiert für ein Protein mit 591 Aminosäuren. Die Translation könnte alternativ an einem zweiten Start-ATG (+199 bp) beginnen, was den N-Terminus um 66 aa verkürzen würde. Da aber seine homologen Proteine ebenso über einen längeren N-terminalen Bereich verfügen und das interne Methionin nicht konserviert ist, wohl aber der Bereich darum, wurde dies für eher unwahrscheinlich gehalten.

Abb. 2.6. Thi9 Homologe.

(A) Sequenzvergleich mit Thi9 aus S. pombe (Sp, Thi9) und seinen Homologen aus Aspergillus fumigatus (Af, AfA14E5.20c), Botrytis cinerea (Bc, BC1G_01240.1), Cryptococcus neoformans (Cn, CNAG_05952), Phycomyces blakesleeanus (Pb, Phybl1|61967), Schizosaccharomyces japonicus (Sj, SJAG_04673.1), Schizosaccharo-myces octosporus (So), Sclerotium sclerotiorum (Sc, SS1G_02549). Die putativen Transmembran-helices in Thi9 wurden mithilfe des Vorhersage-programms TMHMM ermittelt und sind als horizontale Linien dargestellt. Das alternative Start-ATG (*) sowie der von C. Klein identifizierte Aminosäureaustausch E81K in der ptr1-5 Mutante sind gekennzeichnet (121). (B) Stammbaum mit Thi9 Homologen und Mitgliedern der TC 2.A.3.4 Superfamilie. Die Analyse und Darstellung erfolgte mit Treetop.

Stark homologe Proteine lassen sich in verschiedenen anderen Vertretern der Ascomyceten, wie Schizosaccharomyces japonicus, Yarrowia lipolytica, Aspergillus fumigatus, Botrytis cinerea und Cryptococcus neoformans finden (Abb. 2.6 A). Keines dieser Homologen jedoch ist funktionell charakterisiert. Die Vorhersagen über ihre enzymatische Aktivität basieren lediglich auf der Ähnlichkeit zu den bekannten Transportern Uga4, Hnm1, Tpo5 und Hip1 aus S. cerevisiae, die als Permeasen für γ-Aminobuttersäure (GABA), Cholin, Polyamine bzw. basische Aminosäuren beschrieben sind. Sie gehören zur Familie der ACT (amino acid/choline) Transporter innerhalb der APC (amino acid/polyamine/organocation) Superfamilie (TC 2.A.3.4, (100)). Obwohl Thi9 und Homologe nur eine Identität von rund 20-25% zu den Transportern aus S. cerevisiae besitzen, zählen sie – wenn auch nur entfernt – ebenfalls zur APC Superfamilie (100). Dies lässt sich auch in einer Stammbaum-Analyse erkennen, in der die Thi9-Proteine eine distinkte Gruppe bilden (2.6. B). Außer einem positiv geladenen Stickstoffatom lassen sich auch auf Ebene des Substrats keine weiteren Ähnlichkeiten zwischen den meist kettenförmigen, linearen Verbindungen und dem heterozyklischen Thiamin erkennen. Lediglich die Homologen aus A. fumigatus und P. blakesleeanus weisen eine höhere Verwandtschaft zu den Vertretern der ACT Familie auf, was sich auch in ihrer stärkeren Abweichung ihrer Primärstruktur äußert (Abb. 2.6. A).

Thi9 zeigt keine signifikante Ähnlichkeit zu bereits bekannten Thiamintransportern. Die Identität zu dem analogen Protein Thi7 aus S. cerevisiae beträgt lediglich 14,3%, die zu den menschlichen Transportern ThTr-1 und ThTr-2 13,7% bzw. 18,3%. Ebenso besteht keine Homologie zum menschlichen Folattransporter (reduced folate carrier, RFC), der hauptsächlich dafür verantwortlich ist, Zellen mit einer anderen Gruppe der B-Vitamine, den Folaten (Vitamin B9), zu versorgen. Obwohl Thiamin und Folat unterschiedliche chemische Strukturen besitzen, ist der Folattransporter zu rund 40% mit ThTr-1 und ThTr-2 identisch und in der Lage, durch Anionenaustausch TDP aus und TMP in die Zellen zu transportieren (291, 292).

II.C.3. Thi9 ist ein Membranprotein, das den Import von Pyrithiamin vermittelt

Um fest in der Membran verankert zu sein und mit ihren Loops die notwendige katalytische Oberfläche auszubilden, besitzen viele Membranproteine typischerweise zehn oder zwölf Transmembrandomänen (TMDs) (218). Die Hydropathieanalyse durch das Vorhersageprogramm TMHMM ließ zwölf solcher hydrophoben Bereiche in Thi9 erkennen und sagt eine cytoplasmatische Orientierung des N- und C-Terminus voraus (Abb. 2.7 A). Im Sequenzvergleich mit homologen Proteinen aus anderen Organismen fallen der lange N-terminale Bereich sowie der längere Loop zwischen TMD5/6 in den Thi9 Proteinen der Vertreter der Gattung Schizosaccharomyces auf (Abb. 2.6).

Abb. 2.7. thi9⁺ kodiert für ein Expression und Lokalisation von Thi9 durch Fraktionierung. S. pombe Wildtyp-zellen mit genomisch integrierter, C-terminaler Fusion des 3HA-Epitops an Thi9 wurden drei Tage jeweils in frisches EMM ohne Thiamin überimpft, um sie an Thiamin zu verarmen. Aus einer Übernachtkultur in EMM ohne Thiamin wurden Gesamtzellextrakt (CE), cytosolische Fraktion (C) sowie Membranfraktion (M) isoliert und im Western Blot mit einem anti-HA-Antikörper (sc-805) analysiert.

Cornelia Klein untersuchte in ihrer Diplomarbeit die subzelluläre Lokalisation des Proteins durch eine genomisch integrierte C-terminale Fusion an GFP, wodurch die Funktionalität, d.h. die Sensitivität gegenüber Pyrithiamin, nicht beeinträchtigt wurde. Die Fluoreszenz konnte eindeutig der Plasmamembran zugeordnet werden und trat hauptsächlich an den Zellpolen und den Septen von sich teilenden Zellen auf, wie es bereits auch für andere Plasmamembranproteine in S. pombe gezeigt wurde (Abb. 2.7. B (74, 245)). Die Fraktionierung eines Zellextrakts von thi9⁺ exprimierenden Zellen bestätigte die membranständige Lokalisation von Thi9, was seine Funktion als Transportprotein bekräftigte (Abb. 2.7 C).

Die von Schweingruber et al. (225) isolierten ptr1 Mutanten zeichnen sich durch Resistenz gegen das toxisch wirkende Thiaminanalogon Pyrithiamin und eine stark reduzierte Aufnahmeaktivität für Thiamin aus. Da sich ein thi9Δ Knockout bezüglich seiner Pyrithiaminresistenz identisch zur ptr1 Mutante verhielt, bestätigte dies zum einen die Vermutung, dass Thi9 am Thiamintransport beteiligt ist bzw. selbst den gesuchten Thiamintransporter darstellt (Abb. 2.8 A). Andererseits sprach es dafür, dass der ptr1 Lokus mit thi9⁺ allelisch ist und der Grund für die Pyrithiaminresistenz sowie das verminderte Transportvermögen der ptr1 Mutanten eine Mutation ihres thi9⁺ Allels ist. Beides konnte Cornelia Klein in ihrer Diplomarbeit bestätigen: Das Thi9 Protein des ptr1 Stamms trägt eine Punktmutation im N-terminalen Bereich, dicht vor der ersten Transmembrandomäne. Der Aminosäureaustausch des konservierten Glutamtats 81 zu Lysin und der damit verbundene Ladungsaustausch hat erhebliche Auswirkungen auf die Lokalisation des Proteins (Abb. 2.8 B, (121)).

Abb. 2.8. ptr1⁺ ist allelisch mit thi9⁺. (A) Je 10⁶ Zellen von S. pombe FY254, ptr1 und thi9Δ::kanMX wurden auf SD Platten ohne Thiamin ausgebracht, in deren Mitte ein Filterplättchen mit 20 µl Pyrithiamin (120 µM) aufgelegt wurde. Das Wachstum wurde nach drei Tagen bei 30°C dokumentiert. (B) Die C-terminale Thi9-GFP Fusion wurde mithilfe eines integrativen Plasmids in den thi9⁺ Lokus der ptr1 Mutante integriert. Dies führt zur Verdoppelung des thi9⁺ ORFs, wobei nur die erste Kopie, das ptr1 Allel, mit GFP fusioniert wird und unter der Kontrolle des eigenen Promotors steht. Die zweite Kopie, das thi9⁺ Wildtypallel, wird aufgrund einer fehlenden Promotorsequenz im 5’-Bereich nicht exprimiert. Der Kontrast wurde in der linken Hälfte der Abbildung verstärkt, um die exakte Lokalisation erkennbar zu machen (C. Klein, (121)).