Die Charakterisierung des Thiamintransporters Thi9 aus Schizosaccharomyces pombe
V. Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
I. Kapitel Seite
Abb. 1.1 Die Struktur der Flavine Riboflavin, Flavinmononukleotid (FMN) und Flavinadenindinukleotid (FAD)
13
Abb. 1.2 Flavinderivate 13
Abb. 1.3 Die Organisation des rib Operons in B. subtilis 15
Abb. 1.4 Schematische Darstellung der Biosynthese von Riboflavin sowie der Coenzyme FMN und FAD in Bakterien
16
Abb. 1.5 Der Verlust von ribC führt zur Überproduktion von Riboflavin in B. subtilis 17 Abb. 1.6 Der postulierte Regulationsmechanismus durch ein RFN-Element 18
Abb. 1.7 Redoxreaktion der Flavine 21
Abb. 1.8 YpaA-Homologe 42
Abb. 1.9 YpaA ist an der Riboflavinaufnahme in B. subtilis beteiligt 43 Abb. 1.10 ypaA wird in E. coli exprimiert, ist aber nicht funktionell 43 Abb. 1.11 Die Phosphorylierung von Riboflavin geschieht nahezu gleichzeitig mit seiner
Aufnahme
45
Abb. 1.12 Die Riboflavinaufnahme erfolgt nicht über ein Phosphotransferasesystem (PTS) 46 Abb. 1.13 Die Expression von ypaA wird nicht durch Eisen reguliert 47 Abb. 1.14 Die Riboflavinkonzentration im Medium reguliert sowohl die Transportaktivität
von B. subtilis ΔribB als auch die Expression von ypaA
48
Abb. 1.15 Charakterisierung der Substratspezifität von YpaA 49
Abb. 1.16 Aufnahme von Riboflavinanaloga in B. subtilis 50
Abb. 1.17 Charakterisierung der Energieabhängigkeit des Riboflavintransports 50 Abb. 1.18 Schematische Darstellung der YpaA-Verkürzungen YpaA3, YpaA4 und YpaA5 51
Abb. 1.19 Die Membrantoplogie von YpaA 52
Abb. 1.20 Sequenzanalyse von RibM 54
Abb. 1.21 Die heterologe Expression von ribM in riboflavinauxotrophen B. subtilis und E. coli Stämmen erlaubt Wachstum auf niedrigen Riboflavinkonzentrationen
54
Abb. 1.22 Charakterisierung der Aktivität, Energieabhängigkeit und Spezifität von RibM als Riboflavintransporter
57
Abb. 1.23 Die Ausscheidung von Riboflavin in verschiedenen B. subtilis Stämmen 58
Abb. 1.24 Co-Expression von ribM und Dodecin in E. coli 60
Abb. 1.25 Die Expression von Dodecin steigert die Riboflavinaufnahme in E. coli 61
Abb. 1.26 RibM vermittelt den Einbau von Roseoflavin in Dodecin 61
Abb. 1.27 RibM vermittelt den Einbau von [14C]Riboflavin in Dodecin 62 Abb. 1.28 Extraktion der Chromophoren Riboflavin und Roseoflavin aus Dodecin 63
Tab. 1.1 Analyse der in Dodecin eingebauten Flavine 64
II. Kapitel Seite
Abb. 2.1 Die Strukturformeln von Thiamin, seiner Vorstufen HMP und HET sowie der Analoga Pyrithiamin, Oxythiamin und Amprolium
81
Abb. 2.2 Schematische Darstellung der Thiaminbiosynthese und der Rolle der Thiaminase II in Hefe
89
Abb. 2.3 Die Regulation der Genexpression durch TDP 94
Abb. 2.4 Das TR-Element 95
Abb. 2.5 thi9+ komplementiert den Phänotyp von CVY4 103
Abb. 2.6 Thi9 Homologe 104
Abb. 2.7 thi9+ kodiert für ein Plasmamembranprotein 106
Abb. 2.8 ptr1+ ist allelisch mit thi9+ 107
Abb. 2.9 Thi9 vermittelt Transport von Thiamin in S. pombe 107
Abb. 2.10 Bestimmung des Km-Wertes von Thi9 108
Abb. 2.11 Die Thiaminaufnahme über Thi9 hängt von der Energetisierung und dem Protonengradienten ab
108
Abb. 2.12 Thi9 ist ein spezifischer Transporter für Thiamin und HET 109 Abb. 2.13 Bsu1 vermittelt den Transport von Thiamin aber nicht von Pyrithiamin 111
Abb. 2.14 Bsu1 trägt zur Thiaminaufnahme bei 111
Abb. 2.15 Putative „thiamine regulatory elements“ (TR-Elemente) im Promotorberich von thi9+
112
Abb. 2.16 Thiamin reguliert die Aktivität seines Transporters 113
Abb. 2.17 Thiamin reprimiert die Transkription von thi9+ 114
Abb. 2.18 Pyridoxin besitzt keinen reprimierenden Effekt auf die Expression von thi9+ 114
Abb. 2.19 Der Effekt von Thiamin auf das Protein Thi9 115
Tab. 2.1 Thiaminmangel induziert die Expression bestimmter Gene in S. cerevisiae und S. pombe
93
VI. Abkürzungsverzeichnis
VII. Danksagung
Mein ganz besonderer Dank gilt PD Dr. Jürgen Stolz. Du hast mich während meiner Promotion, stets sehr gut betreut und immer Interesse an meiner Forschung gezeigt. Mit Deinem immensen praktischen und theoretischen Wissen hattest Du immer einen Rat parat, wenn es mal irgendwo gehakt hat. Ganz herzlich möchte ich Dir vor allem auch für die Arbeit danken, die Du investiert hast, um die Ergebnisse erfolgreich zu publizieren!
Herr Prof. Dr. W. Tanner, Ihnen danke ich, dass Sie in Besprechungen und Seminaren so ein interessierter und kritischer Zuhörer waren und bei Problemen immer gute Ratschläge und nette Worte fanden.
Was wäre das Doktorandenleben ohne Gleichgesinnte, mit denen man mal schnell am Gang oder auch mal länger im Labor über all die kleinen und großen Probleme diskutieren kann?
Allem voran danke ich Euch – Conny, Sanni und Stefan. Unser „Inkubations-Team“ war echt klasse und ich werde immer gerne an die Zeit zurück denken! Ich wünsche Euch alles Gute!
Auch bei Euch, Petra, Heike und Guido, möchte ich mich ganz herzlich bedanken! Ihr habt ebenfalls für eine sehr lockere Arbeitsatmosphäre gesorgt und auch dafür, dass jeder die empfohlene Tagesdosis Lachen bekommen hat. Denn nicht nur Vitamine sind gesund! Ich wünsche Euch alles Gute für Eure Zukunft!
Obwohl Ihr immer Euren eigenen Kaffee gekocht habt, so ward Ihr, liebe Katrin, Peter und Tanja, quasi unser Schwester-Labor! Und auch wenn ich nicht immer hätte anklopfen müssen, stand Eure Tür immer weit offen, wenn ich mal – vor allem gegen Ende meiner Doktorarbeit – den einen oder anderen Rat, seltene Enzyme, Chemikalien, etc. brauchte. Bei Euch bekam man einfach alles. Ganz herzlichen Dank
Ein herzlicher Dank gilt auch den fleißigen Kräften, die immer im Hintergrund dafür gesorgt haben, dass das Leben am Lehrstuhl reibungslos ablief. Allem voran Vroni, Günther, Michael und Monika. Ihr habt ebenso dafür gesorgt, dass wir Doktoranden trotz aller Umbaumaßnahmen und Umzüge ungehindert weiter forschen konnten. Dir, Günther, möchte ich ganz herzlich für den traditionellen Dienstagskuchen und vor allem für die Pflege mancher Pflanze danken! Dir, Ingrid, bin ich dankbar, dass Du immer Zeit hattest, meine Medien vor dem Festwerden sowie meine SDS-Gele und Western Blots vor dem Auslaufen zu bewahren, wenn ich lieber in die Mensa ging.
Mein besonderer Dank gilt auch dem Graduiertenkolleg GRK640, seinem Sprecher Prof. Dr. B. Dick und Herrn Prof. Dr. G. Hauska. Mit Ihrem Engagement haben Sie mich tatkräftig in meinem Amt als Graduiertensprecher bei der Ausarbeitung der Ringvorlesungen und der Vorbereitung der Summer Schools unterstützt. Ich bedanke mich auch sehr für die großzügige finanzielle Unterstützung durch das Kolleg.
Herr Prof. P. Hegemann, Ihnen danke ich für die angeregten Roseoflavin- und Dodecin-Diskussionen, die Sie mit meinem Chef geführt haben und für die gute Zusammenarbeit.
Dr. Simon Grill und Prof. Dr. M. Mack an der Hochschule Mannheim danke ich dafür, dass sie die Analyse und Quantifizierung der Chromophoren-Extrakte durchgeführt haben.
Ich möchte mich auch ganz herzlich bei Oli, Fabian, Matthias und Prof. Dr. J. Stülke an der Georg-August-Universität in Göttingen bedanken, die mich, den Mikrobiologie-Neuling, zu Beginn meiner Doktorarbeit so nett in ihr Team aufgenommen und in die Welt von Bacillus subtilis eingeführt haben.
Mein Dank gilt ebenso Britta Meißner und Prof. L.-O. Essen an der Philipps-Universität Marburg, die mir ein Plasmid zur Überexpression von Dodecin zur Verfügung gestellt haben und Prof. Dr. R. Sterner, dass ich am Fluoreszenzspektrometer Fluoromax-2 messen durfte.
Mein allergrößter Dank gehört jedoch meinen Eltern, die mich auf jede Weise und in allen Phasen der Doktorarbeit liebevoll unterstützt und beigestanden haben. Ich danke Euch von Herzen!