Biomarkeruntersuchungen

2.2.1 Probenentnahme, Aufbereitung und Lagerung

Die Blutprobenabnahme war für jeden Patienten vorgesehen. In der Einwilligungserklärung wurden die Patienten darüber aufgeklärt, dass Ihre Blutproben für Biomarkeruntersuchungen verwendet werden. An den Zentren, die an der Biomarker-Untersuchung teilnahmen, wurden eine 7,5 ml Serum-Monovette® und eine 7,5 ml EDTA-Monovette mit Blut abgenommen. Diese sollten sofort ausreichend und vorsichtig gemischt fünf Minuten lang bei 3500 bis 4500 U/min zentrifugiert werden.

Pro Monovette wurden aus dem Überstand sechs Aliquoten mit jeweils ungefähr 0,5 ml Serum bzw.

Plasma in Cryocups gegeben.

Abbildung 29: Gefriersicheres Etikett;

S: Screening; V6: Visite 6; V14: Visite 14)

Die 12 Aliquoten wurden mit gefriersicheren Etiketten gekennzeichnet (Abbildung 29). Auf den vorgedruckten Etiketten befand sich die Zentrennummer. Die Patientennummer wurde handschriftlich vom Zentrumspersonal eingetragen, die Visite (S, V6 oder V14) angekreuzt und das nun fertig beschriftete Etikett auf die Cryocups geklebt. Die Cryocups, mit weißen Deckeln für Serumproben und blauen Deckeln für Plasmaproben, lagerten am Studienzentrum bis zu zwei Monate bei -18°C. Danach wurden Sie auf Trockeneis an den Lehrstuhl für Pharmakologie in Regensburg versandt, wo sie bis zur Vermessung bei -80°C lagerten.

Die Zytokinbestimmung erfolgte aus den frisch aufgetauten Proben. Für die übrigen Marker wurden Aliquoten aus den aufgetauten Cryocups entnommen, wieder eingefroren und kurzfristig (2-4 Wochen) bei -20°C zwischengelagert. Sämtliche Untersuchungen wurden mittels Luminex oder ELISA (IL-6) im Labor für NeuroEndocrino Immunology des Uniklinikums Regensburg durchgeführt.

2.2.2 Bestimmung der Biomarkerkonzentration mit dem Luminex Gerät 2.2.2.1 Prinzip der Luminex® Messung:

Bei der verwendeten Luminex xMAP Technology kommen farbcodierte Beads (Mikrosphären) zum Einsatz, die zwei verschiedene Färbungen verwenden. Indem diese zwei Färbemittel unterschiedlich konzentriert werden, erhält man 100 spezifisch gefärbte Beads, die als lable fungieren. Ein spezifisch gefärbtes Bead ist mit genau einem Antikörper gekoppelt. Das in der Probe zu untersuchende Antigen bindet an den Antikörper-Anteil eines Beads. Ein weiterer Panel-spezifischer Antikörper dient der Detektion. Streptavidin-PE Konjugat wird abschließend als quantifizierbares Reportermolekül hinzugegeben und bindet an den Detektionsantikörper. Bei der Messung liegen die Bead-Komplexe in einer Lösung vor und werden mit einer Pumpe angesaugt. Dabei passieren die Bead-Gemische zwei Laserstrahlen. Der eine Laser regt die farblich markierten Beads an, der andere Laser das fluoreszierende Streptavidin-PE Konjugat. Signalprozessoren identifizierten jedes einzelne Bead anhand seiner individuellen Farbe und quantifizieren die Ergebnisse auf Grund des fluoreszierenden Reportermoleküls. Die unterschiedlich gefärbten Beads für verschiedene Biomarker können zu einem gewissen Grad gemischt werden, so dass mit einer Probe mehrere Biomarker parallel identifiziert und quantifiziert werden können.

Zusammengefasst werden in einem Messdurchgang Beads zur Identifikation der jeweiligen Antigene eingesetzt und Antikörper nach Farbstoffkopplung zur Quantifizierung genutzt.

2.2.2.2 Vorbereitung des Geräts und allgemeine Angaben zur Messung und Auswertung

Für die Messung ist eine Pumpe nötig, die Zu- und Ablauf eines neutralen Sheath Fluids (Lösungsmittel) reguliert, da die Proben beim Vermessen gelöst und durch den Laserweg gepumpt werden. Die Laser im Gerät müssen Betriebstemperatur haben, bevor mit Messungen begonnen werden kann. Als Ausgabegerät ist ein PC mit Bildschirm angeschlossen.

Die Ansaugvorrichtung wird zuerst kalibriert. Danach werden Ansaugnadel und Schläuche mit Alkohol gespült. Es folgen zwei Spüldurchgänge der Nadel und Schläuche mit Sheath Fluid.

Bevor die eigentliche Messung beginnt, programmiert man die Plattenbelegung der Wells ein. Man kann dabei festlegen, auf welche Positionen Background (reines Lösungsmittel), Standards für die Standardkurve und Kontrollen (mit bekannter Konzentration) gegeben werden und ob ggf. Leerwells übersprungen werden sollen. Darüber hinaus wird das Messvolumen, die Messzeit, die pro Well maximal aufgewendet werden soll, die Anzahl an Events pro Bead und die Bead Region (=Farbcodes die vermessen werden sollen) eingegeben. Mit der Einstellung des Gate Settings wird der Messbereich auf die für die Biomarker relevanten Bereiche eingeschränkt. Somit kann die Messzeit deutlich verkürzt werden.

Für jedes zu untersuchende Agens werden die Konzentrationen der Standardkurve eingegeben und eine Funktion hinterlegt, anhand derer die Probenwerte berechnet werden. Normalerweise eignet sich die 5 Parameter Transformation [F(x) = A + (D/1 + (X/C)^B)^E] eine asymmetrische Funktion, bei biologischen Assays am besten.

Es folgt die Vermessung der ganzen Platte.

Ist die Messung abgeschlossen, betrachtet man als erstes die Standardkurve und prüft ob alle Werte der Kurve verwendet werden können. Gegebenenfalls entfernt man Ausreißer oder ändert die Funktion der Standardkurve. Um die Genauigkeit der Messung zu beurteilen, überprüft man die gemessenen Werte für die Kontrollsubstanzen mit den Herstellerangaben.

Danach wird das Gerät gereinigt. Dafür verwendet man zuerst bidestilliertes Wasser und danach Ethanol um Nadel und Schläuche zu spülen.

2.2.2.3 Messung von IL-8, IL-10, IL-17, MCP-1 und VEGF

Für die Untersuchung von IL-8, IL-10, IL-17, MCP-1 und VEGF wurde das MILLIPLEX® MAP Human Cytokine / Chemokine Kit der Firma Millipore verwendet. Im Folgenden sind die Vorgänge für die Vorbereitung und Messung einer Platte beschrieben.

Die Beadmischung für die gewünschten Biomarker wird aus den vom Hersteller gelieferten Einzellösungen für spezifische Biomarker hergestellt. Jedem der 5 Zytokinbeadlösungen werden 60 µl entnommen und in eine Mischflasche gegeben. Mit Bead Diluent wird auf ein Gesamtvolumen von 3mL aufgefüllt (5x60 µl Zytokinbeadlösung + 2700 µl Bead Diluent = 3 mL Beadmischung).

Idealerweise wird das Bead Diluent vorgelegt. Die Beads sind lichtempfindlich und werden daher in einem lichtundurchlässigen Gefäß gelagert und gemischt. Es muss während der ganzen Entwicklung eines Kits darauf geachtet werden, dass möglichst wenig Licht an das Kit gelangt, nachdem die Beads zugegeben wurden. Vor dem Mischen werden die Fläschchen mit den Beads zuerst 30 Sekunden ins Ultraschallbad geben und eine Minute auf dem Vortexer gemischt, damit eine homogene Lösung entsteht. Nach dem Mischen sollte das Mischgefäß regelmäßig mit Hilfe des Vortexmischers durchgemischt werden, vor allem direkt bevor die Mischung auf die Platte pipettiert wird. Das gilt für alle Luminex Assays.

Die lyophilisierten Kontrollen werden mit 250 µl entionisiertem Wasser rekonstituiert und mindestens fünf Minuten lang bzw. bis zum vollständigen Lösen gewartet. 30 ml Waschpuffer werden mit 270 ml entionisiertem Wasser gemischt. Zur ebenfalls lyophilisierten Serummatrix wird 1,0 ml entionisiertes Wasser gegeben und wenigstens 10 Minuten gewartet, bis sich das Lyophilisat vollständig gelöst hat.

Die lyophilisierte Standardlösung wird mit 250 µl entionisiertem Wasser rekonstituiert. Dadurch entsteht eine Standardlösung mit der Konzentration 10000 pg/ml für jede der zu untersuchenden Komponenten. Eine 1:5 verdünnte Standardreihe wird hergestellt, in der jeweils 200 µl Assay Buffer vorgelegt und 50 µl aus der nächsthöheren Konzentration entnommen werden. Daraus ergeben sich die in Tabelle 12 dargestellten Konzentrationen:

Tabelle 12: Verdünnungsreihe des Zytokin Assays

Als Background wird Assay Buffer verwendet. Die Serumproben der Patienten werden nicht sofort auf die 96-Well-Filterplatte gegeben. Das liegt daran, dass die relativ zähflüssigen Proben oft nicht abgesaugt werden können. Daher behilft man sich mit folgendem Vorgehen: 25 µl Assay Buffer werden in einer anderen Platte vorgelegt. Danach werden 25 µl pro Serumprobe dazugegeben. Jeweils 25 µl Background, Standardverdünnungen und Kontrollen werden auf die entsprechenden Wells gegeben.

Dazu werden jeweils 25 µl Serum Matrix gegeben.

Somit befinden sich in jedem Well 50 µl (25 µl Probe + 25 µl) Assay Buffer bzw. 25 µl Background oder Standards oder Kontrollen + 25 µl Serum Matrix). Es folgen 25 µl Beadlösung je Well. Die Platte wird mit einem lichtundurchlässigen Deckel oder Alufolie vor Licht geschützt.

Die Platte wird über Nacht bei 4°C auf einem Schüttler entwickelt. Am nächsten Morgen wird das Gemisch auf eine 96-Well Filterplatte übertragen. Um noch verbleibende Reste aus der 96-Well Platte zu gewinnen, wird circa 100 µl Waschpuffer dazugegeben, geschüttelt und in die entsprechenden Wells der Filterplatte gegeben. Nun werden die Probengemische durch die Filterplatte von unten her abgesaugt und zweimal mit 200 µl Waschpuffer gewaschen. Die Bead-Zytokin-Mischung befindet

sich nun in den Filtern der Platte. Im Anschluss werden in jedes Well 25 µl Detection Antibody gegeben und eine Stunde auf dem Schüttler inkubiert. Es folgt die Zugabe von 25 µl des fluoreszierenden Streptavidin-Phycoerythrins und eine weitere Inkubation für 30 Minuten auf dem Schüttler. Das Gemisch wird mittels Vakuumpumpe abgesaugt und zweimal mit Waschpuffer gewaschen und abgesaugt. Die zu vermessenden Komplexe bleiben im Filter. Zu den Proben werden nun 150 µl Sheath Fluid in jedes Well pipettiert. Die Platte ist nun zum Vermessen bereit.

Wie oben beschrieben wird das Gerät vorbereitet, inklusive Spülen, Aufwärmen des Lasers und Programmierung der Plattenbelegung. Die Platte wird eingelegt und die Messung wird gestartet.

Schon während der Messung kann man Standardkurve und Kontrollen beurteilen und falls Ausreißer vorhanden sind, die Standardkurve anpassen. Die Probenwerte werden anhand der Standardkurve berechnet und können nach Ende der Messung in ein Excel-File exportiert werden.

2.2.2.4 Messung von sVCAM-1 und sICAM-1

SVCAM-1 und sICAM-1 wurden mit dem MILLIPLEX® MAP Kit Human Neurodegenerative Disease Panel 3 #HNDG3-36K von Millipore durchgeführt. Die Proben werden zunächst aufgetaut und mit PBS im Verhältnis 1:100 verdünnt (20 µl in 1980 µl bzw. 10 µl in 990 µl). Danach gibt man jeweils 150 µl der Antibody-Immobilized Beads von sICAM-1 und sVCAM-1 zu 2700 µl Bead Diluent. Die lyophilisierten Kontrollen 1 und 2 und der lyophilisierte Standard werden mit 250 µl entionisiertem Wasser gelöst.

Aus den Standardlösungen wird eine Verdünnungsreihe in 1:4-Schritten hergestellt (Tabelle 13):

Verdünnungsgrad

Es folgen die weiteren Messvorbereitungen analog dem Zytokin Assay, abgesehen davon, dass der Übertragungsschritt wegfällt, da die Proben nicht zähflüssig sind. Es werden jeweils 25 µl Standard, Kontrolle, Background oder die verdünnten Serumproben in die Wells gegeben und nach Zugabe von 25 µl des Beadgemisch bei 4°C über Nacht (16-20 Stunden) lichtgeschützt auf dem Schüttler inkubiert. Nach Absaugen mit Vakuum und dreimaligem Waschen mit 200 µl Waschpuffer, wird 25 µl Detection Antibody zugegeben, bei Raumtemperatur und einer weiteren Stunde auf dem Schüttler inkubiert. Es folgt die Zugabe von 25 µl Streptavidin-Phycoerythrin pro Well. Die Platte wird weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur entwickelt. Ein letztes Mal wird mit einer Vakuumpumpe abgesaugt und Rückstände von Detektion Antibody und Streptavidin-PE durch dreimaliges Waschen mit 200 µl Waschpuffer entfernt. Nun werden 100 µl Sheath Fluid in die Wells pipettiert. Nachdem die Platte fünf Minuten auf dem Schüttler gemischt wurde, kann sie vermessen werden.

Bei der Auswertung wurde der Verdünnungsfaktor berücksichtigt.

2.2.2.5 Messung der Apolipoproteine

Die Apolipoproteine wurden mit dem Milliplex MAP Kit® Human Apolipoprotein 96 Well Plate Assay von Millipore gemessen (Cat. # APO-62K).

Bei diesem Kit werden die Serumproben mit dem Faktor 10000 verdünnt. Dabei werden in Deep-Well Platten 495 µL PBS vorgelegt und 5µl Serumproben dazugegeben. Von dieser Mischung werden dann noch einmal 5 µl mit 495 µl PBS verdünnt. Zur Herstellung der Beadmischung werden 150 µl Antikörper-immobilisierte Apolipoprotein Beads in die Mischflasche zu 2,1 ml Beadlösung gegeben.

Sowohl Kontrollen als auch das Standardlyophilisat werden mit 250 µl entionisiertem Wasser gelöst.

In 1:5 Verdünnungsschritten wird die Standardreihe angefertigt bei der jeweils 160 µl Assay Buffer vorgelegt werden (Tabelle 14):

Die weiteren Aufbereitungsschritte erfolgen analog dem Verfahren der Adhäsionsmolekülen (siehe Kapitel 2.2.2.4).

2.2.2.6 Messung von IL-6

IL-6 wurde mit dem Quantikine® HS High Sensitivity ELISA von R&D Systems für Humanes IL-6 vermessen. Der Nachteil des ELISA Verfahrens ist, dass man nur ein Zytokin auf einmal vermessen kann und eine größere Menge Serum benötigt.

Aus der 10 pg/ml Stammlösung wird folgende Verdünnungsreihe hergestellt (Tabelle 15):

IL-6 [pg/ml]

Waschpuffer, Substratlösung, Verstärkerlösung und Kalibratorlösung werden vorbereitet. 100 µl Assaylösung werden in den Wells vorgelegt. Je 100 µl Standard oder Probe werden zugegeben und zwei Stunden auf dem Schüttler inkubiert. Nachdem 6mal mit Waschpuffer gewaschen wurde werden zu jedem Well 200 µl Konjugat gegeben und weitere zwei Stunden auf dem Schüttler inkubiert. Nach weiteren sechs Waschvorgängen folgen 50 µl Substratlösung pro Well, wonach 60 Minuten gewartet werden muss. Nach Zugabe von weiteren 50 µl Verstärkerlösung und weiteren 30 Minuten Entwicklungszeit gibt man 50 µl Stopp Lösung in die Wells, damit die

Farbreaktion nicht weiterläuft. Nun sollte innerhalb von 30 Minuten bei 490 nm gemessen werden.

Alle Inkubationsschritte finden bei Raumtemperatur statt. Mit Hilfe der Standardkurve werden die IL-6 Werte berechnet.

Das Prinzip hinter der Messung folgt dem Sandwich Enzym Immunassay Prinzip. Die Wells sind mit einem monoklonalem IL-6 Antikörper gecoated. In der Probe befindliches IL-6 bindet daran. Nach den Waschvorgängen wird ein weiterer, IL-6-Antikörper (polyklonal) zugegeben, Überschüsse wieder entfernt und das Substrat (NADPH) zugegeben. Dieses bindet an den Antikörper und nach Zugabe eines Verstärkermoleküls mit einem Farbstoffanteil, entwickelt sich eine messbare Farbe. Vor dem Messen gibt man eine Stop Substanz (2 N Schwefelsäure) zu, die eine weitere Reaktion verhindert, so dass eine standardisierte IL-6 Messung erfolgen kann.