4. Diskussion
4.5. Beurteilung des Einflusses von HSP auf die Apoptose
Wie in der Einleitung bereits beschrieben, scheinen sowohl HSP70 (Lang et al., 2002) als auch HSP27 (Concannon et al., 2003) einen wichtigen Einfluss auf die Apoptose von Zellen zu besitzen. Das Hauptaugenmerk der bisherigen For-schungen wurde aber auf die intrazellulär vorkommenden HSP gelegt. In dieser Dissertation sollten nun extrazelluläres HSP27 und HSP70 beobachtet werden.
Dass diese Proteine extrazellulär vorkommen, wurde in der Einleitung mithilfe der bekannten Literatur belegt.
Um die apoptotische Zellen von nekrotischen unterscheiden zu können, wurde eine Annexin V-FITC (markiert apoptotische Zellen) und Propidium Iodid (färbt nekrotische Zellen) Doppelfärbung durchgeführt. Diese Methode wurde schon in einigen anderen Arbeitsgruppen verwendet (z.B.: La Sala et al., 2000;
Schmidt et al., 1999 und 2001).
Zunächst wurden Monozyten untersucht, die durch eine zweitägige Kultivierung in serumfreien Medium in den Zelltod getrieben wurden. Für die auf diesem Wege gestressten Zellen ergab sich ein signifikanter Schutz vor dem Zelltod durch Zugabe von HSP27. Diese Schutzfunktion durch HSP27 ist bei nicht ge-stressten Zellen nicht zu beobachten. Der Unterschied könnte durch die Fähig-keit von HSP27 erklärt werden, dass das Protein zusätzlich zur Apoptose-verhinderung (Interaktion mit Caspase, Glutathionbildung), auch Zellfunktionen unter Stress unterstützt (Chaperoneffekt, Schutz des Cytoskeletts) (siehe Einlei-tung).
Dagegen zeigten weder HSP70 noch LPS einen signifikanten Schutz vor dem Zelltod, wobei beim LPS eine eindeutige Tendenz zu beobachten ist.
Diskussion Kapitel 4
Insgesamt muss angemerkt werden, dass bei diesen Versuchen die Auslösung des Zelltodes ein großes Problem darstellte. Zwei Tage Inkubation der Monozy-ten in serumfreim Medium führte nicht zu einer signifikant erhöhMonozy-ten Anzahl an sterbenden Zellen. Dies lag vor allem daran, dass schon bei den im Vollmedium kultivierten Monozyten eine relativ hohe „Sterberate“ zu verzeichnen war. Dies könnte an der Gewinnung der Monozyten aus den Blutspenden durch die Adhä-renzmethode liegen, da dabei die Zellen vom Plastik der Kulturschale mecha-nisch gelöst werden müssen.
Die Folge bestand darin, dass die Zellen mindestens zwei Tage in serumfreien Medium kultiviert werden mussten, um eine erhöhte Anzahl an untergegange-nen Zellen zu erreichen. Das Problem hierbei war, dass nach der oben be-schriebenen Annexin V/PI-Färbung ein Hauptteil der Zellen zweifarbig fluores-zierte. Dies lässt sich damit begründen, dass die Monozyten bereits die Apop-tose durchlaufen hatten und sich zusätzlich mit dem Nekrose-Farbstoff anfärb-ten (PI färbt auch Zellen im Endstadium der Apoptose). Deswegen kann hier nur allgemein vom Schutz vor dem Zelluntergang durch HSP27 gesprochen werden. Eine Differenzierung zwischen Schutz vor Apoptose oder Schutz vor Nekrose ist anhand der vorliegenden Ergebnisse nicht sicher möglich.
In weiteren Versuchen wurde nun versucht, mit anderen Methoden eine Apop-tose in den Monozyten auszulösen. Doch weder mit Glukokortikoiden (siehe Schmidt et al., 1999 und 2001) noch mit UV-B-Bestrahlung (siehe La Sala et al., 2000) der Zellen ließ sich dies erreichen, obwohl die in der Literatur beschrie-benen Methoden exakt nachgestellt wurden. Im Gegensatz dazu wurde sogar eine paradox erscheinende Schutzfunktion durch Glukokortikoide beobachtet, die sich durch HSP27 aber nicht verstärken ließ.
Dagegen war bei der UV-B-Bestrahlung eine gewisse Tendenz hin zu einer Schutzfunktion durch HSP27 zu beobachten. Eine statistische Signifikanz lag hier nicht vor.
Als letztes wurde der Einfluss des Th-1-Zytokins IFNγ und des Th-2-Zytokins IL-4 beobachtet. Beide führten nicht zu einem signifikanten Unterschied im Ster-beverhalten. Eine sichtbare Tendenz wiederum hin zu einer Schutzfunktion war
Diskussion Kapitel 4 jedoch bei der Stimulation von IFNγ und HSP27 im Vergleich zur alleinigen Sti-mulation mit IFNγ zu erkennen.
Zusammenfassend kann trotz allem postuliert werden, dass auch extrazellulä-res HSP27, im Gegensatz zu HSP70, einen Schutz vor dem Zelltod für Monozy-ten darstellt. Dies wird bei Stimulation zusammen mit IFNγ und bei der UV-B-Bestrahlung sichtbar und erreicht bei Kultivierung der Zellen in serumfreien Me-dium Signifikanz. Dieser Einfluss kann klinisch als eher negativ angesehen werden, da die längere Überlebenszeit der professionellen APC im Entzün-dungsgeschehen zu einer Chronifizierung führen kann.
Ob HSP27 die Apoptose oder die Nekrose der Zelle verzögert, ließ sich mit der verwendeten Methode nicht genau differenzieren. Die Vermutung liegt aber na-he, dass es eher ein Schutz vor Apoptose ist, da dies schon für intrazelluläres HSP27 nachgewiesen wurde. Außerdem erscheint ein Schutz vor einem nicht
„natürlichen“ und unprogrammierten Tod durch ein HSP eher als unwahrschein-lich. In der Literatur finden sich dazu meines Wissens auch keine Erkenntnisse.
Nachdem der Einfluss der HSP auf die Apoptose von professionellen APC un-tersucht wurde, sollten auch nicht-professionelle APC in Form von Keratinozy-ten beobachtet werden. Dies ist auf der einen Seite wichtig, da diese Zellen immunologisch relevante Funktionen, ähnlich den der professionellen APC, ü-bernehmen können (siehe Einleitung). Auf der anderen Seite postulierten Traut-mann et al. (2000), dass die Keratinozyten-Apoptose ein Schlüsselereignis in der Pathogenese der atopischen Dermatitis darstellt. Also könnten HSP27 (oder HSP70) durch einen möglichen Schutz, ähnlich dem durch HSP27 bei den Mo-nozyten, einen positiven Einfluss auf den Krankheitsverlauf der atopischen Dermatitis besitzen.
Als erstes wurde die Tumorzelllinie der HaCat-Zellen beobachtet. Sie sind den Kerationzyten ähnlich, lassen sich aber leichter anzüchten und kultivieren. Um einen Zelltod auszulösen wurden diese Zellen entweder mit Glukokortikoiden stimuliert oder mit UV-B-Strahlen bestrahlt. Ein signifikanter Schutz vor dem Zelltod durch HSP27 war allerdings nicht zu erkennen. Lediglich bei der Gluko-kortikoid-Stimulation ist eine Tendenz zu beobachten, die auf einen leichten Schutz durch HSP27 hindeutet.
Diskussion Kapitel 4 Problematisch bei diesen Versuchen war wiederum, dass bei der verwendeten Methode nicht genug Zellen in die Apoptose getrieben wurden. Möglichergli-cherweise liegt der Grund hierfür in der Gewinnung der Zellen, die lange kulti-viert werden müssen und dann aus der Kulturflasche nur mit potentiell zelltoxi-schen Substanzen (Trypsin) abgelöst werden können. Zusätzlich dazu ist anzu-nehmen, dass eine Tumorzelllinie ein gegenüber den Ursprungszellen verän-dertes Apoptoseverhalten besitzt.
Als letztes wurden Versuche an Keratinozyten durchgeführt. Dabei bestätigte sich die bei den Monozyten schon beobachtete Schutzfunktion von extrazellulä-rem HSP27. Ein Schutz vor der Apoptose ist bereits im Medium erkennbar je-doch statistisch nicht signifikant. Unter gleichzeitiger Stimulation mit den pro-apoptotischen Zytokinen IFNγ und TNF-α stellt sich diese Signifikanz jedoch ein. HSP27 schützt also auch Keratinozyten vor der Apoptose. Insofern ist also anzunehmen, dass dieses Protein eine wichtige Rolle im Hinblick auf die immu-nologischen Funktionen dieser Zellen spielt (siehe oben). Außerdem könnten sie somit direkt beteiligt sein in der Pathogenese der atopischen Dermatitis.