Bakteriologische Untersuchungen

Die Entnahmeart von Gewebeproben bei Fischen kann unter Umständen einen Einfluss auf die festgestellten Keimzahlen haben. So sind in der Literatur verschiedene Arten der Probenentnahme bei Fisch genannt. Einige Autoren beschreiben eine Probenentnahme der Rückenmuskulatur, bei der die Haut des Fisches großflächig mit 95 %-igem Ethanol behandelt, abgeflammt und anschließend entfernt wird. Dies verringert das Risiko, dass Keime der Haut die Gewebeprobe kontaminieren (HERBORG und VILLADSEN, 1975; SCOTT, 1986). Auch MEYER und OEHLENSCHLÄGER (1996) entfernten die Haut von Wittlingen großflächig und achteten darauf, dass die Entnahmestelle der Muskelprobe mindestens 0,5 cm von den Hauteinschnitten entfernt lag.

Bei den Regenbogenforellen der Winteruntersuchungen 1999 wurde mit einem sterilen Skalpell 10 cm² der Haut mit Hilfe einer sterilen Schablone umschnitten, abpräpariert und das darunter liegende Muskelgewebe einschließlich der Schnittkante entnommen. Eine Übertragung von Hautkeimen in die Muskelprobe über die Schnittführung kann daher nicht ausgeschlossen werden. Die Ergebnisse der Keimzahlbestimmung der vorliegenden Arbeit bewegen sich aber im Rahmen der Werte anderer Untersuchungen und liegen nicht höher, was für eine geringe Verschleppung von Keimen beim Schnitt durch die Haut in das Gewebe spricht.

Darauf soll weiter in Kapitel 5.3.2. eingegangen werden. In den späteren Untersuchungen mit Zandern wurde zunächst die Haut großflächig entfernt, bevor die Muskelprobe aus der Mitte der freigelegten Fläche entnommen wurde. Somit wurde sichergestellt, dass keine Kontamination des Muskelgewebes durch die Einschnitte erfolgen konnte.

Die gewählten Methoden der Probenaufbereitung und die Nachweisverfahren zur Bestimmung der aeroben Gesamtkeimzahl auf der Haut, in der Muskulatur und im Darm sowie die Nachweisverfahren für einige humanpathogene Keime wie Listerien oder Salmonellen entstammen der Amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG und den DIN-Normen. Andere Methoden wurden in Anlehnung an Angaben in der Literatur durchgeführt, wie die Untersuchung auf Clostridien (BAUMGART, 1998) oder Vibrionen (BOCKEMÜHL, persönliche Mitteilung) bei Zandern, oder es handelte sich um hauseigene erprobte

Methoden und Laborarbeitsanweisungen. Zum Teil wurden die Methoden modifiziert, um sie auf Fischgewebe anwenden zu können.

Aufgrund der strengen Vorgehensweise bei den Methoden der Amtlichen Sammlung nach § 35 unterliegt auch die Berechnung der Keimzahlen einer vorgeschriebenen Formel. Sind keine koloniebildenden Einheiten in der Erstverdünnung nachweisbar, so wird kein Nullwert, sondern die Keimzahl der Nachweisgrenze angegeben. Aus diesem Grunde liegen die Keimzahlen aller Proben nie unterhalb von log 2,3 (Tropfplattenverfahren) bzw. log 2,0 KbE/g (Spatelplattenverfahren). Diese Methode erwies sich für den Nachweis von Keimen in der Muskulatur als zu unempfindlich. Da die Keimzahlen in der Rückenmuskulatur in den ersten Untersuchungen bei den Regenbogenforellen im Winter 1999 über einen längeren Lagerungszeitraum sehr niedrig waren, wurde bei den Zanderuntersuchungen die empfindlichere 5-tube-MPN-Methode des kooperierenden Hamburger Institutes gewählt. Mit Hilfe dieses Verfahrens konnte ein Keimzahl-Bereich von log 1,6 bis log 4,5 KbE/g abgedeckt, d.h. auch niedrigere Keimzahlen als log 2 bzw. log 3 ermittelt werden. Diese Methode ist für Fischmuskelproben, bei denen während der ersten Lagertage in der Regel von einer Sterilität ausgegangen wird, besser geeignet als die Methode der Amtlichen Sammlung nach § 35.

Für die Isolierung von Aeromonas spp. aus Lebensmittel- und Umweltproben werden in der Literatur verschiedene Medien diskutiert. Die Ergebnisse sind zum Teil widersprüchlich und führen zu entgegengesetzten Empfehlungen für die Wahl eines geeigneten Selektivmediums für die quantitative Bestimmung von Aeromonaden.

Beispielsweise verglichen TSAI und CHEN (1996) an Muschel- und Fischproben die Selektivität von drei verschiedenen, für den Nachweis von Aeromonas spp.

empfohlenen Medien und ermittelten mit Ryan-Agar die schlechtesten Ergebnisse.

Auch GOBAT und JEMMI (1995) erhielten beim Vergleich von 7 Selektivmedien mit Ryan-Agar die niedrigste Wiederfindungsrate von Aeromonaden aus Fisch- und Fleischprodukten. Hingegen erzielten PIN et al. (1994) mit Ryan-Agar gute Ergebnisse mit einer Wiederfindung von A. sobria von 95,5 % in Lebensmittel- und Wasserproben.

Aufgrund von eigenen Voruntersuchungen wurde in den Winteruntersuchungen 1999 an Regenbogenforellen für den Nachweis von Aeromonaden das Ryan-Medium ausgewählt, da es im Vergleich mit vier anderen in der Literatur empfohlenen

Nährböden die höchste Selektivität und Sensibilität aufwies. Während im ersten der vier Versuchsdurchgänge noch Aeromonaden quantifiziert werden konnten, ergaben sich bei der Verwendung des Ryan-Agars in den nachfolgenden Versuchsdurchgängen einige Schwierigkeiten. Auf der Platte wuchs viel Begleitflora mit ähnlicher Morphologie, wodurch sich die Bestimmung der verdächtigen Kolonien als sehr aufwändig erwies; das Medium zeigte eine zu geringe Selektivität. Bei der qualitativen Untersuchung auf Aeromonaden auf der Hautoberfläche von Zandern zeigten sich ähnliche Selektivitätsprobleme des Mediums, eine stark wuchernde Begleitflora machte eine Abgrenzung von Aeromonaden gegenüber anderen Bakterien schwierig. Hier erwies sich bei weiteren Differenzierungsreaktionen rund ein Drittel der Isolate auf Ryan-Agar nicht als Aeromonas spp. Von den als Aeromonas-verdächtig untersuchten Kolonien konnte keine einer Spezies zugeordnet werden, auch nicht durch das API-System. Ergebnisse der oben genannten Studien sowie die der eigenen Untersuchungen lassen darauf schließen, dass für die Isolierung von Aeromonas spp. gerade aus Fischproben zur Zeit noch kein optimales Nährmedium existiert.

Für den Nachweis von Enterobacteriaceae wurde in Anlehnung an die Methode der Amtlichen Sammlung nach § 35 LMBG L 06.00-25 zur Bestimmung dieser Keime bei Fleisch und Fleischerzeugnissen VRBG-Agar als Selektivmedium (ohne weitere Bestätigungsreaktionen) gewählt. Die Koloniemorphologie von Enterobacteriaceae auf VRGB ist stark unterschiedlich, so werden kleine, trockene, dunkelrote sowie auch große, feuchte, weiße Wachstumsformen als Enterobacteriaceae angesehen.

In der Methode heißt es, dass auch Kolonien, die rosa sind und/oder keine Präzipitationshöfe aufweisen, mitzuzählen sind. In den Erläuterungen der Methode wird darauf hingewiesen, dass bei anaerober Bebrütung „unter Verzicht auf Subkultivierung und Oxidase-Test alle Kolonien als Enterobacteriaceae ausgezählt [werden].“ Die Bestätigung von Einzelkolonien nach Reinzucht durch den Oxidasetest wird in der Methode wegen des großen Arbeitsaufwandes als nicht praktikabel angesehen.

Da auch atypische Kolonien beim Wachstum auf VRBG zu der Familie der Enterobacteriaceae gehören können, verwendeten LEROI et al. (2001) bei ihrer Untersuchung an kaltgeräucherten Lachsen unterschiedliche Zählarten zur Keimzahlbestimmung von Enterobacteriaceae. Zum einen zählten sie alle

gewachsenen Kolonien auf VRBG-Agar, zum anderen nur Kolonien mit der für Enterobacteriaceae typischen Wachstumsform, nutzten jedoch den Gesamt-Enterobacteriaceae-Gehalt bei der Interpretation ihrer Ergebnisse.

Die eigenen Untersuchungen zeigten, dass sowohl typische als auch untypische Kolonien zu einem großen Teil keine Enterobacteriaceae sein können.

Zunächst erwies sich das gewählte Medium in Beimpfungsversuchen bei den eigenen Vor-Untersuchungen als sehr zuverlässig, in den Hauptversuchen mit Forellen- und Zander-Proben wuchs aber auf VRBG-Agar eine große Anzahl an unterschiedlichen und zum Teil oxidase-positiven Kolonien. Dieses Medium scheint bei Fischproben im Gegensatz zu Fleischproben wegen der spezifischen Fischflora wenig selektiv für Enterobacteriaceae zu sein und somit wenig geeignet für den Enterobacteriaceae-Nachweis in Fischgewebe. Der § 35-Methode folgend wurden aber bei der Auswertung alle Kolonien in die Keimzahlberechnung eingebracht, da eine Durchführung des Oxidasetests bei sämtlichen Kolonien zu arbeitsaufwändig gewesen wäre. Bei der Interpretation der Ergebnisse muss aufgrund der methodenbedingten Einschränkungen von einem Maximalwert mit zum Teil falsch-positiven Keimen ausgegangen werden, bei dem einige der oxidase-falsch-positiven und somit falsch-positiven Keime mit eingerechnet wurden. Somit wäre eine Überbewertung der Enterobacteriaceae-Keimzahlen denkbar. Zu ähnlichen Ergebnissen kam auch LAGRANGE (2002) in seiner Arbeit. Etwa 10 bis 30 % der aufgrund der variablen Koloniemorphologie von Enterobacteriaceae eigentlich zu dieser Familie zu zählenden Kolonien waren oxidase-positiv oder nicht zum fermentativen Glucoseabbau fähig und schieden damit als Enterobacteriaceae aus.

Bei den Sommerforellen wurden, um den Anteil der auf VRBG-Agar gewachsenen Enterobacteriaceae zu erfassen, insgesamt 21 unterschiedliche Kolonieformen auf VRBG-Agar weiter mit API 20 E biochemisch differenziert. 3 der 21 Kolonien waren oxidase-positiv und schieden demnach als nicht-Enterobacteriaceae aus. Eine davon erwies sich mit Hilfe von API 20 E mit einer guten Identifizierung als Aeromonas hydrophila/caviae. Von den restlichen 18 oxidase-negativen Keimen wurde zweimal Hafnia alvei und einmal Escherichia vulneris identifiziert, andere Keime waren gar nicht oder nur ungenügend identifizierbar.

Eine mögliche Einschränkung der Selektivität des VRBG-Nährbodens für Enterobacteriaceae wird auch vom Hersteller des Nährbodens bestätigt, da auch

einige mitwachsende Begleitkeime (z.B. Aeromonas spp., Pseudomonas spp.) durch eine Rotfärbung der Kolonien die gleichen Reaktionen wie Enterobacteriaceae zeigen können (OXOID, 1993). Da Aeromonaden bei Fischen zur natürlichen Keimflora gehören, und ihr Vorkommen in mehreren Zehnerpotenzen pro g bzw. cm² häufig beschrieben wird (HUSS, 1995), ist ihr Vorhandensein auf Fischproben sehr wahrscheinlich.

So heißt es auch in den Empfehlungen von BAUMGART (1996), dass zur Unterscheidung von Aeromonaden und Enterobacteriaceae mindestens 10 verdächtige Kolonien pro Probe reingezüchtet werden sollten, der Oxidasetest durchgeführt und auf die Fähigkeit des fermentativen Glucoseabbaus getestet und anschießend das prozentuale Verhältnis des Vorkommens von Enterobacteriaceae errechnet werden sollte.

Für den Nachweis dieser Keime bei den Zandern wurde die ISO-MPN-Methode 21528-2: 2000 (E) angewandt. Sie schließt von vornherein die Keime, die nicht oxidase-negativ und nicht in der Lage sind, Glucose zu fermentieren, aus. Diese Methode ist bei Untersuchungen an Fischgewebe vorzuziehen, ist jedoch bei routinemäßigen Untersuchungen mit großem Probenaufkommen aufgrund des erheblichen Arbeitsaufwandes schwer durchführbar. In Kapitel 0 wird näher auf die Ergebnisse des Enterobacteriaceae-Nachweises eingegangen.