2 LITERATURÜBERSICHT
2.9 Auswirkungen von Clenbuterol auf die Skelettmuskulatur
Aufgrund seiner positiven Effekte auf die Mastleistung wurde Clenbuterol lange Zeit bei Schwein, Kalb, Schaf und Geflügel als Futterzusatz verwendet. Unter der Wirkung von β2 -Sympathomimetika kommt es zu einer Verbesserung der Futterverwertung, einer speziesabhängigen Zunahme des Wachstums, einer Erhöhung des Muskelansatzes und einer Verminderung des Fettansatzes, so dass das Muskel-/Fett-Verhältnis steigt. Die Ursache für diese Effekte ist eine Umverteilung („Repartitioning“) der Nährstoffauswertung vom Fett- zum Muskelgewebe, da β2-Symppthomimetika die Fettsäurebildung hemmen und die
Lipolyse fördern (KEARNS et al. 2001; FREY u. LÖSCHER 2002). Die anabole Wirkung tritt jedoch meist erst bei einer deutlich höheren Dosis als der therapeutisch angewandten Dosierung auf (FEY 2006). Zusätzlich scheinen β-Mimetika den Abbau von Muskelproteinen zu hemmen und die Proteinsynthese zu steigern. Dabei kommt es im Muskel vor allem zu einer Hypertrophie von Typ-II-Fasern (BEEKLEY et al. 2003; BURNISTON et al. 2007). Die Kontraktionsrate der schnellen weißen Muskelfasern wird erhöht, während die der langsamen roten Fasern erniedrigt wird. Dadurch kann es zu Tremor und vermehrter Wärmebildung im Skelettmuskel kommen (FREY u. LÖSCHER 2002). In einer Studie wurde Ratten 14 Tage lang Clenbuterol in einer Dosierung von 10µg/kg/Tag verabreicht. Anschließend wurde der M. plantaris isoliert und histochomisch untersucht. Es konnte eine deutliche Zunahme der Muskelmasse und des Proteingehaltes beobachtet werden. In den schnellen Fasern wurde eine Reduktion der optische Dichte der Mitochondrien um 20% und ein 30% geringerer Glycogengehalt als bei Kontrolltieren festgestellt (BURNISTON et al. 2007). Bei Pferden, denen Clenbuterol verabreicht wurde, war zwar die Muskelmasse 16% größer als bei einer Kontrollgruppe, doch ermüdeten die behandelten Pferde bei Belastung deutlich schneller als die unbehandelten (KEARNS u. MCKEEVER 2002). Dieser Effekt könnte auf den erhöhten Gehalt an den schnell ermüdenden Typ-II-Fasern zurückzuführen sein, der bei Clenbuterolverabreichung beobachtet wird.
Doch bei einer deutlich über der therapeutischen Dosis liegenden Menge an Clenbuterol treten muskeltoxische Effekte auf. Bei einer Dosierung von >10 µg/kg konnte eine negative Wirkung von Clenbuterol auf die Skelettmuskulatur von Ratten beobachtet werden. Es kam vier Stunden nach der Clenbuterolgabe zu einer Apoptose in der Skelettmuskulatur. In den meisten Fällen wurden die apoptotischen Myocyten dieser Ratten lytisch und nekrotisierten (BURNISTON et al. 2005).
Die regulatorischen Mechanismen für die durch Clenbuterol induzierte Hypertrophie der Skelettmuskulatur sind noch weitestgehend ungeklärt. Bei Ratten wurden nach einer dreiwöchigen Clenbuterolgabe erhöhte Level an mRNA für verschiedene transforming growth factors (TGF) gemessen. Diese erhöhten Level korrelierten positiv mit einem ebenfalls erhöhten Gewicht der Massetermuskulatur bei diesen Ratten. Somit scheint Clenbuterol einen Einfluss auf bestimmte Wachstumsfaktoren zu haben, was ein Erklärungsansatz für die anabolen Effekte sein könnte (AKUTSU et al. 2006).
Glukokortikoide haben eine katabole Wirkung. Es kommt zu einem Proteinabbau im Muskel und zu einer Mobilisierung von Aminosäuren, welche dann in der Leber zur Glukoneogenese bereitstehen (KARLSON et al. 1994). Dies kann sich auf die Muskulatur als Steroid-induzierte Myopathie auswirken, die bei Glukokortikoidabusus oder beim Cushing-Syndrom beobachtet wird. DECRAMER et al. (1996) zeigten eine generalisierte Faseratrophie und eine verringerte Kraft im Musculus quadrizeps femoris nach einem Steroideinsatz beim Menschen.
3 MATERIAL UND METHODE
3.1 Pferde
Für die vorliegende Studie wurden insgesamt 32 Pferde untersucht. Es handelte sich um 30 Warmblutpferde verschiedener Zuchtgebiete und zwei deutsche Reitponys. Vier dieser Pferde waren Patienten der Klinik für Pferde der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, die zur Untersuchung auf eine vorberichtlich erwähnte Lungenerkrankung vorgestellt wurden.
Desweiteren wurden 20 klinikeigene Pferde und acht Pferde des Instituts für Tierzucht und Tierverhalten der Forschungsanstalt für Landwirtschaft Mariensee untersucht. Eine Stute wurde im Turniersport bis zur Klasse S in der Dressur eingesetzt. Drei weitere Pferde wurden freizeitmäßig geritten, während die anderen 28 untrainiert waren. Insgesamt handelte es sich bei den untersuchten Pferden um 17 Wallache, 14 Stuten und einen Hengst. Das durchschnittliche Alter der Pferde betrug 13 Jahre wobei das jüngste Pferd drei und das älteste 20 Jahre alt war. Das Gewicht der Pferde betrug 385 kg bis 705 kg mit einem Durchschnittswert von 563 kg.
3.1.1 Haltung und Fütterung
Während der Untersuchungsperiode wurden die Probanden und Patienten unter gleichen Haltungsbedingungen einzeln in großzügigen Außenausläufen gehalten. Die an RAO erkrankten Pferde erhielten Späne als Einstreu und als Rauhfutter ausschließlich nasses Heu.
Die Pferde der gesunden Kontrollgruppe wurden konventionell mit Stroheinstreu und trockenem Heu als Rauhfutter gehalten. Um eine ausreichende Adaptation zu gewährleisten und den Einfluss der Haltungsbedingungen auf die geplanten Untersuchungen so gering wie möglich zu halten, wurden die Pferde bereits zwei Wochen vor Untersuchungsbeginn der beschriebenen Haltungsform zugeführt. Alle Pferde wurden während der vierwöchigen Untersuchungszeit auf die gleiche Weise bewegt, wie zuvor auch. Die Pferde, die vorberichtlich nicht geritten oder anderweitig bewegt wurden, erhielten einmal täglich freien Auslauf in der Reithalle. Die vier Pferde, die in regelmäßigem Reiteinsatz waren, wurden während der Untersuchungsperiode weiter trainiert wie vor der Studie.
3.2 Klinische Untersuchung 3.2.1 Vorbericht
Bei der Erhebung des Vorberichtes wurde speziell nach Symptomen einer Lungenerkrankung wie Husten, Dyspnoe oder Leistungsabfall und der Dauer dieser Erkrankung gefragt.
Außerdem wurden die Haltungsbedingungen der Pferde, die Nutzungsrichtung, der Trainingszustand und eventuelle medikamentelle Vorbehandlungen festgehalten.
3.2.2 Allgemeinuntersuchung
Bei allen Pferden wurde zu Beginn eine klinische Allgemeinuntersuchung durchgeführt, in deren Rahmen Haltung, Verhalten, Habitus sowie der Ernährungs- und Pflegezustand beurteilt wurden. Es wurden die Herz- und Atemfrequenz, rektal gemessene Körpertemperatur, Farbe der Konjunktiven und der Maulschleimhaut sowie die kapilläre Füllungszeit ermittelt. Die Mandibularlymphknoten wurden palpiert und eventuell vorhandener Nasen- und Augenausfluss wurde dokumentiert. Das Herz, die Lunge und die Trachea wurden auskultatorisch untersucht, wobei bei Lunge und Trachea auf pathologische Atemgeräusche geachtet wurde, während beim Herz Frequenz, Intensität, Rhythmus, Abgesetztheit und eventuelle Nebengeräusche befundet wurden. Desweiteren wurde die allgemeine Bemuskelung, sowie speziell die Muskulatur an Hals, Kruppe, Schulter, Rücken und den Hintergliedmaßen adspektorisch und palpatorisch beurteilt.
3.2.3 Spezielle Untersuchung des Atmungsapparates
Im Rahmen der speziellen klinischen Untersuchung der Atemwege wurde die Atemfrequenz, der Atemtyp, eine eventuell verlängerte In- oder Exspiration, sowie spontaner oder durch Druck auf den Kehlkopf auslösbarer Husten beurteilt. Desweiteren wurde auf eine Doppelschlägigkeit der Atmung, das Vorhandensein einer Dampfrinne, Nüsternblähen oder einer Afteratmung geachtet. Zusätzlich wurde die Größe des Lungenfeldes und eventuell überlauter oder gedämpfter Schall perkutatorisch ermittelt.
3.2.3.1 arterielle Blutgasanalyse
Alle Pferde wurden im Ruhezustand einer arteriellen Blutgasanalyse unterzogen. Dazu wurde mit einer Kanüle (22G, 0,7 x 30 mm, BD Microlance™3, Becton Dickinson, Spanien) nach lokaler Hautdesinfektion aus der rechten Arteria carotis communis Blut gewonnen und in natrium-heparinisierte Kapillaren (1,7-1,8 mm Ø, WU Mainz) abgefüllt. Mit Hilfe des AVL OMNI 1 Modular System-Analysegerätes wurden der Sauerstoffpartialdruck, der Kohlenstoffdioxidpartialdruck und die arterio-alveoläre Druckdifferenz bestimmt.
3.2.3.2 Bronchoskopische Untersuchung
Unter einer Sedierung mit einem alpha2-Agonisten (Detomidin [Domosedan®, Pfizer Tiergesundheit, Karlsruhe, Deutschland] in einer Dosierung von 0,01-0,1 mg/kg i.v.) wurde bei allen Pferden mit einem flexiblen Videoendoskop eine bronchoskopische Untersuchung durchgeführt. Nach einer Beurteilung der Nasengänge, Larynx, Pharynx und der Luftsackklappen, wurde das Endoskop durch den Kehlkopf in die Trachea eingeführt. Bei vorliegendem Sekret, wurden zunächst die Menge und die Viskosität nach den Angaben von Diekmann und Deegen (1990) subjektiv beurteilt. Anschließend wurde mittels eines Spülkatheters und einer 20ml Spritze (BD Discardit™ II, Becton Dickinson, Spanien) Sekret aspiriert und zur Analyse im hauseigenen Labor der Klinik für Pferde der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover untersucht.
Des weiteren wurde die Schleimhautfarbe von Trachea und Hauptbronchien beurteilt und auf das Vorhandensein einer Verdickung im Bereich der Bifurcatio tracheae geachtet.
3.2.3.3 Tracheobronchialsekretanalyse
Das gewonnene Tracheobronchialsekret wurde auf einem Objektträger ausgestrichen, nach Pappenheim gefärbt und unter dem Lichtmikroskop zytologisch untersucht. Es wurde der Gehalt von Makrophagen, neutrophilen Granulozyten, eosinophilen Granulozyten und Mastzellen von nicht vorhanden (-) bis hochgradig vorhanden (++++) eingestuft. Das Vorkommen von Kreola-Körperchen, Epithelzellen, Ziliozytophtoria, Becherzellen, Riesenzellen, Curschmann-Spiralen, Hyphen, Konidien und Bakterien wurde als geringgradig bis hochgradig beziehungsweise nicht vorhanden kategorisiert.
3.2.3.4 Bronchoalveoläre Lavage
Bei 30 Pferden wurde zusätzlich eine Bronchoalveoläre Lavage durchgeführt. Hierzu wurden die Pferde mit Detomidin ([Domosedan®, Pfizer Tiergesundheit, Karlsruhe, Deutschland] in einer Dosierung von 0,01-0,1 mg/kg i.v.) und Levomethadon (0,05-0,075 mg/kg i.v., L-Polamivet®, Intervet Deutschland GmbH, Unterschleissheim, Deutschland) sediert und in einen Untersuchungsstand verbracht. Im Rahmen der bronchoskopischen Untersuchung, wurden über den Arbeitskanal des Endoskopes 20 bis 40 ml 1%ige Lidocainhydrochloridlösung (Xylocain 2%, Astra Zeneca GmbH, Wedel, Deutschland) zur Ausschaltung des Hustenreizes an die Bifurcatio tracheae injiziert. Das Endoskop wurde in den linken Hauptbronchus eingeführt und möglichst dorsal bis zur Einkeilung vorgeschoben.
Anschließend wurden 500 ml körperwarme, sterile PBS- Lösung (Phosphat- Buffered-Saline) instilliert und als Lavageflüssigkeit zurückgewonnen. Diese wurde im klinikeigenen Labor zytologisch untersucht. Es wurde der Gehalt an Makrophagen, Lymphozyten, Mastzellen, neutrophilen und eosinophilen Granulozyten ausgezählt und der prozentuelle Anteil errechnet.
Auf die gleiche Weise wurde das Vorkommen von Epithelzellen, Riesenzellen, Bakterien, Hyphen, Konidien oder Erythrozyten quantifiziert. Die Referenzbereiche anhand derer die Pferde in eine Gruppe mit unauffälliger Lavage-Flüssigkeit und eine Gruppe mit veränderter Lavage-Flüssigkeit eingestuft wurden, werden in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1: Referenzbereiche der Zellgehalte in der BAL-Flüssigkeit
Zellen Referenzbereich (Staempfli, Viel 1993)
Makrophagen 45 – 70 %
Lymphozyten 30 – 50 %
Mastzellen 0 – 5 %
Neutrophile Granulozyten 0 – 8 %
Eosinophile Granulozyten 0 – 2 %
3.2.3.5 Röntgenologische Untersuchung der Lunge
Bei allen Pferden wurde im Rahmen der speziellen Untersuchung des Atmungsapparates eine radiologische Untersuchung der Lunge durchgeführt. Es wurde mit einem Röntgengerät (Phillips Optimus 80) und digitalem Speicherfoliensystem eine kaudoventrale (125 kV, 20 mAs, 31,2 ms) und eine kaudodorsale (125 kV, 16 mAs, 25 ms) Röntgenaufnahme angefertigt und mit einem Score- System ausgewertet (siehe Abb.2).
Name: __________________________ IdN: ________________
Gesamte Lunge erfasst? ja nein
Röntgenbild scharf/unscharf scharf unscharf
Aufnahme in maximaler Inspiration? ja nein
1. Verdichtungen im kaudalen Bereich:
keine Verdichtungen (0) deutlich (1) sehr deutlich (2)
2. Interstitielle Verdichtungen im Bereich der Zwischenrippenräume:
keine Verdichtungen (0)
geringgradig (1) mittelgradig (2) hochgradig (3)
3. Bronchienwände:
keine Verdickung der Bronchienwände (0)
geringgradig (1) mittelgradig (2) hochgradig (3) 4. Halos:
keine Halos (0)
geringgradig (1) mittelgradig (2) hochgradig (3)
5. postkardiales Dreieck:
scharf abgegrenzt (0)
ggr. verschattet (1) mgr. verschattet (2) hgr. verschattet (3)
0-2 Punkte ohne besonderen Befund
3-6 Punkte geringgradige Befunde Summe: ___________
7-10 Punkte mittelgradige Befunde über 11 Punkte hochgradige Befunde
Abbildung 2: Röntgenuntersuchungsbogen
3.2.3.6 Graduierung der Lungenerkrankung
Die Pferde wurden anhand der Untersuchungsergebnisse einer lungengesunden Gruppe und einer Gruppe mit RAO zugeteilt. Die Klassifizierung wie auch die Einstufung des Schweregrades der Lungenerkrankung erfolgte nach einem, in der Klinik routinemäßig zur Diagnostik von chronischen Pneumopathien verwendeten, Score- System nach OHNESORGE et al. (1998) (siehe Tabelle 2).
Tabelle 2: Score nach Ohnesorge et. al. (1998) zur Graduierung von Lungenerkrankungen beim Pferd
Untersuchungsparameter Ergebnis Score
Husten nein 0
vorberichtlich, spontan oder auslösbar 1
Ruhedyspnoe nicht vorhanden 0
verstärkt abdominal 1
Nüsternblähen, Dampfrinne 3
Auskultation vesikulär oder vesikulär verschärft 0
Rasseln oder Giemen 3
Perkussion des Lungenfeldes o.b.B. 0
> eine handbreit erweitert 1
> zwei handbreit erweitert 2
AaDO2 0 – 7 mmHg 0
8 – 14 mmHg 1
> 14 mmHg 2
Bifurcatio tracheae deutlich verdickt 1
Menge
anhand der Endpunktzahl wird der Grad der Erkrankung definiert. Es geht jedoch bei einem Untersuchungsparameter nur ein Wert in das Ergebnis mit ein. Dieses ist immer der höchste Wert. So werden für die Ruhedyspnoe bei einem Pferd mit verstärkter abdominaler Atmung und Nüsternblähen nur drei Punkte für das Nüsternblähen gezählt. Der Wert für die verstärkte abdominale Atmung wird nicht berücksichtigt, da es sich um den geringeren Wert handelt.
Insgesamt können in diesem Score-System 14 Punkte erreicht werden. Die Gradeinteilung anhand der ermittelten Scorewerte wird in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3: Auswertung des Score-Systems nach Ohnesorge et. al. (1998)
Score Grad der Erkrankung
0 – 1 gesund
2 – 3 geringgradige Ausprägung der Befunde
4 – 6 mittelgradige Ausprägung der Befunde
7 – 14 hochgradige Ausprägung der Befunde
3.2.4 Belastungsuntersuchung
Zur Beurteilung der Belastbarkeit, Kondition und der Beruhigungswerte von Herz- und Atemfrequenz wurden alle Pferde einer standardisierten Belastungsuntersuchung unterzogen.
Sie wurden zunächst fünf Minuten im Schritt geführt und dann durchgängig zehn Minuten im Arbeitstrab und fünf Minuten im Arbeitsgalopp bewegt. Während der Untersuchung wurden die zurückgelegten Runden gezählt und der Longierradius gemessen, um die Durchschnittsgeschwindigkeit zu errechnen. Zusätzlich wurde während der Belastung auf Verspannungen, Steifheit, verkürzte Tritte und vermehrte Triebigkeit geachtet.
Zur Ermittlung der Beruhigungswerte wurden unmittelbar nach der Belastung Herz- und Atemfrequenz ermittelt und danach in fünf minütigen Abständen bis zum Erreichen der Ausgangswerte dokumentiert.
3.2.5 Spezielle Untersuchung der Muskulatur 3.2.5.1 Adspektion und Palpation
Um eventuelle Schwellungen, Schmerzhaftigkeit, vermehrte Wärme oder Verspannungen zu diagnostizieren, wurde die Hals-, Schulter-, Rücken-, Kruppen- und Oberschenkelmuskulatur adspektorisch und palpatorisch untersucht. Zusätzlich wurde der Grad der allgemeinen Bemuskelung subjektiv bestimmt und dokumentiert.
3.2.5.2 Analyse von Muskelenzymen und Laktat
Im Rahmen der Belastungsuntersuchung wurden die Enzyme Creatinkinase, Aspartat-Aminotransferrase, Laktatdehydrogenase und der Laktatwert bestimmt. Hierzu wurde vor der Belastung, direkt nach der Belastung, sowie vier und 24 Stunden im Anschluss an die Belastungsuntersuchung Blut in einem Lithium-heparinisierten Röhrchen (LH 85 I. U., BD Vacutainer™-System, Großbritannien) aus einer Jugularvene gewonnen. Dieses wurde direkt im Anschluss bei 3000 Umdrehungen pro Minute für sechs Minuten zentrifugiert (Universel 16, Hettich AG, Schweiz). Mittels dem Vitros® DT 60 II System und dem Vitros® DTSC II Modul (Ortho-Clinical Diagnostics, Deustschland) wurden in dem gewonnenen Plasma die Enzymgehalte bestimmt.
3.3 Muskelbiopsie
3.3.1 Biopsieentnahme und Versand
Die Muskelbiopsieentnahme erfolgte mit der Biopsiestanze nach Bergström (Abb. 3 und Abb.
4) aus dem Musculus glutaeus medius. Am ersten Tag der Untersuchung wurde eine Biopsie entnommen, welche als Ruhe- und Ausgangswert diente. Es folgte eine weitere 24 Stunden nach dem Belastungstest, um Einflüsse der Belastung auf die Muskulatur im Vergleich zwischen lungengesunden und lungenkranken Pferden zu untersuchen. Bei einem Pferd musste aufgrund übermäßiger Wehrigkeit auf die zweite Biopsie 24 Stunden nach Belastung verzichtet werden.
Für die Entnahme wurden die Pferde in einen Untersuchungsstand verbracht und mit Detomidin (Domosedan®, Pfizer Tiergesundheit, Karlsruhe, Deutschland) in einer Dosierung
coxae wurde rasiert, mit Iodseife gereinigt und anschließend mit Alkohol und Iodlösung (Braunol®, Povidon-Iod, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland) desinfiziert.
Nach einer subkutanen Lokalanästhesie mit Lidocain (Xylocain 2% mit Adrenalin, Astra Zeneca GmbH, Wedel, Deutschland) erfolgte mit einer 22er Skalpellklinge eine ca. 1cm lange Stichinzision durch Haut und Muskelfaszie. Die Biopsiestanze wurde durch die Inzisionsstelle fünf bis acht Zentimeter tief in die Gluteaenmuskulatur eingeführt und die Muskelprobe ausgestanzt. Die Hautinzision wurde mittels eines Hautklammergerätes verschlossen, mit Vetsept-Salbe® (Albrecht GmbH, Aulendorf, Deutschland) versorgt und mit einer sterilen Kompresse abgedeckt.
Bei fünf Pferden wurde zusätzlich eine offene Biopsie aus dem Musculus splenius entnommen. Hierfür wurde ca. eine Handbreit cranial des Schulterblattes und eine Handbreit dorsal der Wirbelsäule eine 10 x 10 cm große Fläche rasiert und wie oben beschrieben gereinigt und desinfiziert. Nach einer subkutanen Lokalanästhesie mit Lidocain (Xylocain 2%
mit Adrenalin, Astra Zeneca GmbH, Wedel, Deutschland) wurde mit einem sterilen Einmalskalpell eine 1 bis 2 Zentimeter lange Inzision parallel zum Mukelfaserverlauf durch die Haut vorgenommen. Der Muskel wurde in der Tiefe dargestellt und ein ca. 1 x 1 cm großes Stück Muskulatur wurde entnommen. Die Wunde wurde mit Donati-Einzelheften (Supramid® 4 metric, Fa. BBraun, Melsungen) versorgt und mit Aluminium-Spray abgedeckt.
Die Muskelproben wurden in einem kleinen unbehandelten Plastikröhrchen verpackt und bei 4°C gekühlt innerhalb von 24 Stunden in das Institut für Neuropathologie der Heinrich-Heine-Universität in Düsseldorf versandt (TNT Express, Übernacht Express).
Abbildung 3: Muskelbiopsiestanze nach Bergström in zusammengesetztem Zustand
Abbildung 4: Muskelbiopsiestanze nach Bergström, Einzelteile
3.3.2 Weitere Bearbeitung der Muskelproben
Im Institut für Neuropathologie der Heinrich-Heine-Universität in Düsseldorf wurden die Muskelproben zunächst von Fett- und Bindegewebe befreit. Anschließend wurden sie auf einer kleinen Korkscheibe (SLEE Mainz, Deutschland) in Tragant (Merck Darmstadt, Deutschland) gebettet. Hierbei wurde besonders darauf geachtet, dass die Muskelfasern möglichst quer zur späteren Schnittrichtung verlaufen. Die so präparierten Proben wurden in einem mit flüssigem Isopentan gefülltem Duwargefäß (KGW Isotherm, Karlsruhe, Deutschland) in flüssigem Stickstoff 20 Sekunden lang gefroren.
Im Kryostat (Leica CM 1900, Fa. Leica Microsystems Nussloch GmbH, Deutschland) wurden ca. 10 µm dicke Schnitte angefertigt und auf Objektträgern (Engelbrecht, Deutschland) fixiert und damit für die unten beschriebenen Färbemethoden vorbereitet.
3.3.3 Färbemethoden
3.3.3.1 Hämatoxilin-Eosin
Die auf Objektträgern fixierten Schnitte wurden für vier Minuten in Hämalaun verbracht und anschließend ca. drei Minuten unter fließendem Leitungswasser gespült. Es folgten 30 Sekunden in Eosin und ein erneutes kurzes Spülen mit Leitungswasser.
3.3.3.2 Modifizierte Gomori-Trichromfärbung (ENGEL u. CUNNINGHAM 1963)
Die Proben wurden zehn Minuten in Shandon-Hämatoxylin gefärbt und danach für 15 Minuten zum Bläuen in Leitungswasser belassen. Nach dem Bläuen wurden die Schnitte in der Gomori-Lösung (nach Engel) erneut gefärbt. Im Anschluss an das Färben wurden die Proben kurz in Leitungswasser gespült.
3.3.3.3 Ölrot-Fettfärbung (Oil-red)
Für die Ölrot-Fettfärbung wurden die Präparate zunächst für wenige Sekunden in 60%igen Isopropylalkohol getaucht und daraufhin für zehn Minuten in die zuvor filtrierte Färbelösung verbracht. Anschließend wurden sie zuerst kurz in destilliertem Wasser gespült, dann erneut
in 60%igen Isopropylalkohol getaucht und nochmals in destilliertem Wasser gespült. Danach wurden die Proben für eine Minute zum Färben in Hämalaun verbracht. Es folgte das Bläuen in Leitungswasser und kurzes Spülen in destilliertem Wasser.
3.3.3.4 Saure-Phosphatasefärbung
Für die Saure-Phosphatasefärbung wurde das Leucognost®-SP Kitt (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) verwendet. In der nach Anleitung angefertigten Färbelösung wurden die unfixierten Schnitte für 60 bis 90 Minuten zum Inkubieren bei 37°C in einen Brutschrank verbracht. Nach dem Inkubieren wurde die Färbelösung abgegossen und die Schnitte in destilliertem Wasser gespült. Anschließend wurden sie für 30 Sekunden in Hämalaun gefärbt und für eine Minute zum Bläuen in Leitungswasser verbracht.
3.3.3.5 PAS-Färbung (mit und ohne Diastase)
Bei der PAS-Färbung (Periodic Acid Schiff) mit Diastase wurden die Schnitte für 20 Minuten mit Speichel bedeckt und daraufhin zunächst in Leitungswasser und dann in destilliertem Wasser gespült.
Die dann folgenden Färbeschritte wurden sowohl bei der Färbung mit Diastase, als auch bei der ohne Diastase durchgeführt.
Die Objektträger wurden für 20 Minuten mit 1%iger Perjodsäure bedeckt. Anschließend wurden die Schnitte unter fließendem Leitungswasser gespült und in Schiff`s Reagenz für 15 Minuten im Kühlschrank zum Färben belassen. Die Präparate wurden für 15 Minuten in Leitungswasser verbracht, anschließend 30 bis 60 Sekunden lang in Hämalaun gefärbt und zum Bläuen erneut für fünf Minuten in Leitungswasser gestellt.
3.3.4 Aufsteigende Alkoholreihe und Eindeckeln
Mit Ausnahme der Ölrot-Fettfärbung wurden die Schnitte im Anschluss an die Färbung in einer aufsteigenden Alkoholreihe (70%, 96%, 100%) und danach in Xylol fixiert.
Das Eindeckeln erfolgte in der Eindeckelmaschine (Leica CV 5030, Fa. Leica Microsystems GmbH, Österreich). Die ölrotgefärbten Schnitte wurden mit Glycerin per Hand eingedeckelt.
3.3.5 Mikroskopische Beurteilung
Die angefertigten Präparate wurden unter einem Lichtmikroskop in unterschiedlichen Vergrößerungen begutachtet. Erhöhte Enzymaktivität und morphologische Veränderungen wurden beurteilt und dokumentiert. Die Auswertung erfolgte verblindet durch drei unabhängige Gutachter. Aus den Ergebnissen wurden die Mittelwerte gebildet und statistisch ausgewertet.
3.3.5.1 Histologische Auswertung
Anhand der Hämatoxillin-Eosin Färbung und der modifizierten Gomori-Trichrom-Färbung wurden die Schnitte histologisch untersucht. Nach der Beurteilung von Schnitt- und Färbequalität, wurden Faserkaliberverschiebungen in Form von Atrophien und Hypertrophien, zentrale Kerne, myogene Kernhaufen, Zellnekrosen und entzündliche Infiltrate bewertet. Insbesondere die nach Gomori-Trichrom gefärbten Präparate wurden auf myofibrilläre Verplumpungen und eine pathologisch erhöhte mitochondriale Aktivität in Form von verbreiterten roten Randsäumen untersucht.
3.3.5.2 Histochemische Auswertung
Die histochemische Auswertung erfolgte bei allen Pferden anhand der Ölrot-Fettfärbung, der PAS-Färbung mit und ohne Diastase und der Saure-Phosphatase-Färbung.
Die ölrotgefärbten Präparate wurden auf eine pathologisch erhöhte Fettspeicherung untersucht, während mit der Sauren-Phosphatase-Färbung Zellnekrosen ausgeschlossen werden konnten. Mittels der PAS-Färbung kann der Glycogengehalt der Muskelzellen dargestellt und beurteilt werden. Zunächst wurde in der Färbemethode ohne Diastase die Menge und Verteilung des Glycogens beurteilt, um anschließend die Schnitte mit Diastasevorinkubation auf eine vollständige Verdauung des PAS-positiven Materials zu kontrollieren.
3.3.5.3 Graduierung der Muskelveränderungen
Die mitochondriale Aktivität wurde anhand der Breite der roten Randsäume in der
Die mitochondriale Aktivität wurde anhand der Breite der roten Randsäume in der