Aufnahmetechnik der Gele mit einer CCD-Kamera

Die richtige Belichtung der Bilder ist ein entscheidender Punkt. Aus einer mäßigen Aufnahme eines Agarosegels kann keine vernünftige Quantifizierung erfolgen.

Evident, aber doch erwähnenswert erscheint, daß jede Aufnahme einen möglichst großen Ausschnitt des zu quantifizierenden Gels zeigt (s. a. Diplomarbeit von Annette Reith, 1997, Seite 62). Nur so können sogenannte Rundungsfehler beim image processing vermieden werden.

Eine ähnliche Rolle spielt die Belichtungszeit. Alle zu vermessenden DNA-Banden müssen optimal belichtet sein. Dies ist in Abbildung 7 und Abbildung 8 dargestellt. Bei zu großer Belichtungszeit können nicht alle Banden auf dem Agarosegel ausgewertet werden, einige Banden überbelichtet werden und damit das Verhältnis der belichteten

Ergebnisse 52 Werte zu den real vorhandenen Werte aufgehoben wird (nicht dargestellt, da evident).

Bei Unterbelichtung (in diesem Fall 30 ms) streuen die Ergebnisse der Quantifizierung stark. Die Messung zeigt eine hohe Ungenauigkeit. Bei optimaler Belichtung (in diesem Fall 80 ms) verringert sich die Streuung sichtbar (Abbildung 8).

In der Praxis hat sich zur Optimierung der Belichtungszeiten ein sogenannter Falschfarben-look-up table (LUT) bewährt. Die Grauwerte der Ausgangsaufnahme werden auf dem Bildschirm durch einen sogenannten look-up table dargestellt (LUT).

Jeder Grauwert der Aufnahme wird sozusagen in eine Falschfarbe übersetzt. Dadurch kann der Kontrast wesentlich gesteigert werden, da wir nur ca. 80 Graustufen, jedoch mehrere millionen Farben wahrnehmen können (genauere Erklärung s. u.).

Überbelichtete Stellen auf dem image können damit sofort erkannt werden. Sie erscheinen bei dem verwendeten LUT „16 color ramp“ als Grautöne. Der Hintergrund stellt sich als verschiedene Blau- bzw. Grüntöne dar. Dadurch kann in kurzer Zeit eine optimal belichtete Aufnahme erzielt werden.

Bei der Cybertech CS-1-Kamera war dieses Vorgehen nicht möglich, da zur Betrachtung nur ein Schwarz-Weiß-Monitor zur Verfügung stand. Mit diesem konnte in der Praxis keine Überbelichtung erkannt werden. Hier mußten von einem Gel immer mehrere Aufnahmen mit empirisch ermittelten Aufnahmezeiten gemacht werden.

Diese konnten erst nach Übertragung auf einen Computer ausgewertet werden. Da am Anfang dieser Arbeit kein Farbmonitor zur Verfügung stand, konnten die Bilder in einem Bildverarbeitungsprogramm mit einer sogenannten „Pipette“ einzeln ausgewertet werden. Dazu wurden die hellsten Stellen innerhalb des Bildes mit der

„Pipette“ abgefahren und überprüft, ob einzelne Pixelwerte 255 oder 0 erreichen.

Diese Bilder waren nicht zur Quantifizierung brauchbar.

Ein überbelichtetes Bild zeigt für die entsprechenden Banden zu geringe Werte an.

Die Pixelkurve, die man aus einer Bande erhält, wird sozusagen abgeschnitten und die Werte, welche über diesen Punkt hinausgehen nicht mitgerechnet. Es entsteht ein systematischer Fehler, der die großen DNA-Mengen falsch quantifiziert. Leider ist diese Phänomen nicht mehr ohne weiteres sichtbar, wenn man ohne genaue Betrachtung des Ausgangsbildes die DNA-Banden mit NIH Image auswertet. Man ermittelt in dem von NIH Image verwendeten Verfahren die Durchschnittswerte über die Breite. Da die Banden an der Seite im allgemeinen durch die Gelelektrophorese nicht mehr scharf abgrenzbar sind, werden bei der Mittelwertberechnung auch diese Grauwerte mitgerechnet. Man erhält plausible Werte, die im Durchschnitt nicht auf eine Übersättigung hinweisen. Bei genauer Betrachtung mit dem Falschfarben LUT ist dies sofort sichtbar (genauere Erklärung im nächsten Kapitel).

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Abbildung 7: Auf einem mit SYBR Green I angefärbten Agarosegel wurden 0,03 bis 0,5 µg pBluescript-DNA (Pvu II behandelt, bezogen auf das 450 bp-Fragment) aufgetrennt. Das gleiche Agarosegel wurde mit verschiedenen Belichtungszeiten aufgenommen. Die verschiedenen images zeigen in etwa die gleichen Absolutwerte, da der Hintergrund graphisch subtrahiert wurde. Unterschiede in den Genauigkeiten werden in Abbildung 8 dargestellt.

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Abbildung 8: Vergleich der Genauigkeiten bei der Quantifizierung bei verschiedenen Aufnahmezeiten desselben Agarosegel mit den in Abbildung 7 gezeigten Mengen an pBluescript. Es ist die Abweichung der Werte von der gefitteten Geraden dargestellt. Die quadratischen Punkte zeigen die Werte für eine Aufnahmezeit von 80 ms, die runden Punkte eine kürzere Belichtungszeit von 30 ms. Längere Aufnahmezeiten konnten wegen der beginnenden Überbelichtung nicht ausgewertet werden. Kleinere Mengen an DNA zeigen prinzipiell eine größere Abweichung, da hier die Pipettierfehler starker ins Gewicht fallen.

Insgesamt zeigen die Werte bei einer geringeren Belichtungszeit eine wesentlich größere Streuung. Optimale Belichtungszeiten sind essentiell für einen kleinen systematischen Fehler bei der Quantifizierung von DNA aus Agarosegelen.

Um die optimale Belichtung besser ermitteln zu können, gibt es bei NIH Image die Möglichkeit, die Bilder in Falschfarben darstellen zu lassen. Diese Falschfarbendarstellung verändert nicht die eigentlichen Grauwerte der TIF-Bilder, sondern dient nur zur Darstellung auf dem Bildschirm.

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Abbildung 9: Look-up table zur Verwendung mit NIH Image (Farbdarstellung, in Schwarz-Weiß nicht adäquat darstellbar): "16 color ramps". Die Grauwerte werden auf dem Bildschirm in Form einer sogenannten look-up table (LUT) dargestellt. Die hier dargestellte LUT wird "16 color ramp" bezeichnet. Sie erlaubt eine optimale Belichtung einer Aufnahme.

Man kann auf den ersten Blick über- und unterbelichtete Stellen in jeder Aufnahme erkennen.

Eine essentielle Voraussetzung zur Quantifizierung. Unterbelichtete Stellen werden als weiß-hellgrau, überbelichtete Stellen als tief dunkelblau dargestellt. Richtig belichtete Stellen erscheinen dagegen als Farben (rot-gelb-grün-blau). Zusätzlich werden kleinste Farbnuancen durch die zusätzliche Kontrastierung der Grauwerte durch Farben sichtbar gemacht.

Abbildung 10: Darstellung der realen Werte eines überbelichteten Bildes versus die mit NIH Image gemittelten Werte. Die dunkle Kurve stellt die realen Werte der Aufnahme eines überbelichten Gels dar, die graue Kurve die gemittelten Werte. Man kann die Überbelichtung in der Kurve der realen Werte sofort an den Plateaus in den oberen Bereich erkennen; bei den gemittelten Werten ist dies nicht mehr möglich. Der Falschfarben-LUT dagegen läßt die überbelichten Stellen sofort erkennen. Richtig belichtete Helligkeitsstufen werden in beiden Abbildungsarten ohne Plateau dargestellt.

Ergebnisse 56 Mit Hilfe des im NIH Image-Programms benutzten LUT „16 color ramp“ kann man sehr genau Über- oder Unterbelichtung jedes Punktes innerhalb eines Bildes abschätzen.

Er erlaubt weiterhin feinste Abstufungen innerhalb des Bildes durch die geschickte Farbauswahl mit maximalem Farbkontrast darzustellen. Während unser Auge nur ca.

80 Graustufen wahrnehmen kann, besteht die Möglichkeit mehrere millionen Farben zu unterscheiden. Deshalb stellt die Umwandlung einer Grauskala in Farbe eine deutliche Verbesserung feiner Nuancen der Aufnahme für das menschliche Auge dar.