3. Ergebnisse
3.6 Analyse der AP-2γ-Knockout-Maus
3.6.4 AP-2-Expression im Wildtyp während der frühen
In der frühen Entwicklung ist die Nährstoffversorgung des Embryos im wesentlichen über Diffusionsprozesse sichergestellt. Mit zunehmender Größe des Embryos wäre dieser rein physikalische Prozeß viel zu langsam, um eine ausreichende Versorgung des Embryos zu gewährleisten. Diese Aufgabe wird deshalb von einer Gruppe hoch spezialisierter extraembryonaler Zellen übernommen, den Trophoblastenzellen. Am Tag 6,5 und 8 der Embryonalentwicklung führte ich in Wildtypembryonen eine pan-Antikörperfärbung von AP-2 durch (Abb. 3.15).
Die Zellen des ektoplazentalen Konus (ek) und die Riesenzellen (rz) zeigen am Tag 6,5 dpc. eine starke nukleäre AP-2-Expression (Abb. 3.15, A). Das extraembryonalen Ektoderm (Abb. 3.15, B, Schnittebene c) ist schwach AP-2-positiv (Pfeile ohne Schaft). Ab Tag 8 der Embryonalentwicklung (Abb. 3.15, C) wird AP-2 zusätzlich im Neuroepithel (ne) und dem Amnion (am) exprimiert.
Die Hauptexpressionsorte von AP-2 sind in der frühen Embryonalentwicklung (bis 6,5 dpc.) auf extraembryonale Strukturen beschränkt, wobei in den Trophoblastenzellen des ektoplazentalen Konus und in den Riesenzellen die stärkste AP-2-Expression detektiert wird. Mit Beginn der Neurulation wird AP-2 erstmals embryonal, im Neuroepithel der apikalen Neuralfalte nachgewiesen.
Während der weiteren Embryonalentwicklung persistiert die starke AP-2-Expression in den Trophoblastenzellen.
A C
B c
rz
rz ek
ee rz
ne
dz dz
dz
ee
500 µm 150 µm
100 µm
am
ek
Abbildung 3.15: AP-2-Expression im Trophoblasten von Wildtyp-Embryonen.
Immunhistochemische Analyse mit einem pan-AP-2-Antiserum. Die Abbildung zeigt Schnitte durch Embryonen in der Dezidua (dz) an Tag 6,5 (A, B) und 8 (C) der Embryonalentwicklung. Bei A und C handelt es sich um Sagittalschnitte durch den Embryo, bei B um einen Transversalschnitt. Die Schnittebene c von B ist in A rot eingezeichnet. Die Riesenzellen (rz) und der ektoplazentale Konus (ek) zeigen ein starkes braunes AP-2-Signal. Das etwas schwächere Signal im extraembryonalen Ektoderm (ee) ist im Transversalschnitt B erkennbar (Pfeile ohne Schaft). Am Tag 8 dpc. wird AP-2 erstmals im Embryo selbst exprimiert. Zusätzlich zu den Trophoblastenzellen ist das Neuroepithel (ne) der apikalen Neuralfalte und das Amnion (am) AP-2-positiv.
Ist also die dramatische Wachstumsretardierung der AP-2γ-Nullmutante ein sekundärer Defekt, dessen Ursache auf eine Trophoblastendysfunktion
zurückzuführen ist? Um diese Frage zu beantworten, untersuchte ich die Proliferation des Trophoblasten.
3.6.4.1 Verminderte Proliferation im ektoplazentalen Konus und im extraembryonalen Ektoderm der Nullmutante am Tag 7,5 der Embryonalentwicklung
Im Sagittalschnitt werden in der wachstumsretardierten Nullmutante (Abb. 3.16, B) morphologische Defekte des ektoplazentalen Konus (ek) sichtbar. Der in B markierte Ausschnitt ist in D vergrößert dargestellt. In der Vergrößerung erkennt man, daß dieses Gewebe bei der Nullmutante weniger kompakt ist als im Kontrollembryo (A, bzw. Vergrößerung C). Als Folge davon kommt es bei der Nullmutante zu Einblutungen (weißer Pfeil markiert rote Blutkörperchen) im ektoplazentalen Konus.
Proliferierende Zellen können mit einem PCNA-Antikörper nachgewiesen werden. Die PCNA-Färbung (Abb. 3.16, C und D) zeigt, daß im ektoplazentalen Konus der Mutante die Zellproliferation stark verringert ist. Nur vereinzelt erkennt man proliferierende Zellen (weiße Pfeile ohne Schaft), während im Kontrollembryo über 90% der Zellen im ektoplazentalen Konus das rote PCNA-Signal zeigen.
Das extraembryonale Ektoderm (ee) begrenzt als innerste Zellschicht den ektoplazentalen Konus. Die punktierten Linien kennzeichnen die Grenze zwischen beiden Strukturen. Zusätzlich zur eingeschränkten Proliferation des ektoplazentalen Konus zeigt die Nullmutante einen Proliferationsverlust im extraembryonalen Ektoderm, während im Kontrollembryo fast alle Zellen proliferieren.
A B
C D
500 µm
125 µm
ee ee
ek ek
Abbildung 3.16: Proliferationsverlust im ektoplazentalen Konus und extraembryonalen Ektoderm der Nullmutante am Tag 7,5 der Embryonalentwicklung.
Die Proliferation der Nullmutante wurde am Tag 7,5 der Embryonalentwicklung mittels PCNA-Färbung untersucht. Aus den Übersichten eines normal entwickelten Embryos (A) und eines retardierten Tieres (B) wurde der ektoplazentale Konus im eingerahmten Bereich vergrößert dargestellt (C, D). Die Mutante (D) zeigt neben des retardierten Größenwachstums eine verminderte Proliferation im extraembryonalen Ektoderm (ee) und im ektoplazentalen Konus (ek) (weiße Pfeile ohne Schaft markieren einzelne proliferierende Zellen). Zusätzlich treten bei der Mutante Einblutungen im ektoplazentalen Konus auf (weißer Pfeil markiert Erythrozyten). Die Grenze zwischen ee und ek wurde durch eine Strichlinie angedeutet.
3.6.4.2 Die Nullmutante entwickelt kein Labyrinth, die Anzahl der Riesenzellen ist verringert
Durch die vorangegangenen Versuche wurde in der Mutante eine Proliferationdefizienz sowohl im extraembryonalen Ektoderm als auch im ektoplazentalen Konus festgestellt. Beide Gewebe sind während der weiteren Trophoblastenentwicklung am Aufbau komplexer plazentaler Strukturen beteiligt. So bildet der ektoplazentale Konus Riesenzellen, die in distaler Richtung wandern und den Konzeptus als mehrschichtige Zellage umschließen.
Das extraembryonale Ektoderm fusioniert mit der mesodermalen Allantois und bildet schließlich das Labyrinth. Deshalb wurde die Mutante gezielt auf Defekte bei der Labyrinthbildung und auf eine Fehlregulation bei der Entstehung der Riesenzellen untersucht.
Die Abbildung 3.17 zeigt eine AP-2-Färbung mit einem pan-Antiserum im Wildtypkonzeptus (A) und der Nullmutante (B), um die Morphologie des positiven ektoplazentalen Konus (ek) zu verdeutlichen und um die AP-2-exprimierenden Riesenzellen vom maternalen Deziduagewebe zu unterscheiden.
Die Mutante zeigt im Vergleich zur Kontrolle im Bereich des ektoplazentalen Konus eine reduzierte Zahl von Riesenzellen (rz). Die Riesenzellen des Wildtypkonzeptus wandern in der Dezidua in distaler Richtung und bilden mehrschichtige Zellagen aus, welche durch Pfeile markiert wurden. Die Nullmutante hingegen bildet lediglich eine einzelne Zellschicht (Pfeile) um den Konzeptus. In C und D wurde der eingerahmte Bereich aus A und B vergrößert dargestellt. Abbildung 3.17 C zeigt die AP-2-positive Labyrinthanlage im Wildtypembryo, deren Grenze durch eine Strichlinie verdeutlicht wurde. Der Mutante (D) fehlt diese Struktur vollständig.
A B
D C
rz
la rz
ek ek
250 µm
100 µm
rz rz rz
Abbildung 3.17: AP-2γ-Mutante entwickelt kein Labyrinth und bildet weniger Riesenzellen.
Die Abbildung zeigt eine immunhistochemische Färbung für AP-2 im Kontrollembryo A und in der Mutante B an Tag 8 der Embryonalentwicklung. Die Mutante besitzt im Bereich des ektoplazentalen Konus (ek) weniger Riesenzellen (rz) als der Kontrollembryo. Weiterhin bildet die Mutante lediglich eine Einzelschicht von Riesenzellen um den proximalen Bereich des Konzeptus, während der Kontrollembryo mehrere Schichten von Riesenzellen besitzt (Pfeile). Die in A und B markierten Bereiche wurden in C bzw. D vergrößert dargestellt. In der Vergrößerung wird deutlich, daß der Kontrollembryo (C) eine normale Labyrinthanlage entwickelt, welche in der Nullmutante (D) komplett fehlt. Die Grenze der Labyrinthanlage (la) ist im Kontrollembryo durch eine Punktlinie markiert Die Schnitte sind mit Hämatoxylin gegengefärbt.
Zusammenfassend zeigen die bisherigen Ergebnisse, daß AP-2γ essentielle Funktionen bei der Entwicklung des Trophoblasten übernimmt. Dieser Prozeß
ist von einer massiven Zellproliferation in bestimmten Geweben des Trophoblasten abhängig. Der Verlust der AP-2γ-Expression im Trophoblasten führt zu einer Proliferationsdefizienz im ektoplazentalen Konus, was die Ursache für die eingeschränkte Bildung der Riesenzellen sein könnte. Ebenso läßt sich die gestörten Entwicklung der Labyrinthanlage durch die Proliferationsdefizienz des extraembryonalen Ektoderms erklären. Da AP-2γ in allen Zellen des Trophoblasten exprimiert wird, handelt es sich bei diesen Phänotypen um Primärdefekte der AP-2γ-Defizienz. Im Gegensatz dazu muß der Gastrulationsphänotyp und die dadurch gestörte Mesodermbildung in der Nullmutante auf einen sekundären Defekt zurückgeführt werden, weil AP-2γ im Mesoderm nicht exprimiert wird (Shi & Kellems, 1998). Das retardierte Wachstum und die gestörte Mesodermbildung des Embryos könnte auf die unzureichende Nährstoffversorung zurückzuführen sein, deren Ursache der Defekt im Trophoblasten sein könnte.