2. Material und Methoden
2.9 Analytik zur Zellkultur
2.9.6 Antikörpernachweis mit der ELISA-Methode
Der quantitative Nachweis des CSLEX-Antikörpers bzw. des E-Selektin-IgG-Proteins er-folgte mit Hilfe des ELISA-Testes (engl.: Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay). Im Rahmen dieser Arbeit wurde der antigenunabhängige Sandwich-ELISA (siehe Abbildung 2.14) und der antigenabhängige indirekte ELISA angewendet. Im Sandwich-ELISA wurde das zu bestimmende Protein zwischen zwei Antikörper gebunden, von denen der zuletzt gebundene Enzym-konjugiert war. Für diesen Test war das Antigen für den nachzuweisen-den Antikörpers nicht notwendig. Zur Funktionsüberprüfung der Bindungaktivität zwi-schen dem produzierten Antikörper bzw. E-Selektin-IgG und seinem Antigen bzw. Ligan-den wurde der Primärantikörper durch humane Granulocytenganglioside ersetzt.
E
Substrat
3. Antikörper mit Enzym gekoppelt
nachzuweisender Antikörper
1. Antikörper an der Festphase immobilisiert
Festphase
Abbildung 2.14: Prinzip des Sandwich-ELISA.
Im Sandwich-ELISA wurde der Primärantikörper gegen das nachzuweisende Protein im ersten Schritt an die feste Phase - eine Mikrotiterplatte (Immuno Plate Maxi Sorp, NUNC) - gebunden. Danach wurde das E-Selektin-IgG bzw. der CSLEX-Antikörper zupipettiert.
Nachgewiesen wurde dieser Komplex, indem die Peroxidase bzw. die alkalische Phospha-tase des Sekundärantikörpers ihre Substrate in einer Farbreaktion enzymatisch umsetzten.
Als Substrat der Peroxidase wurde ABTS (2,2´-Azino-di[3-ethylthiazolin-sulfonat(6)]) eingesetzt, das in folgender Reaktion zu dem stabilen ABTS-Radikalkation (ABTS+) um-setzt wurde:
H2O2+ 2 ABTS + 2H+ Peroxidase 2 H2O + 2 ABTS+
Das Radikalkation hat Absorptionsmaxima bei 650 und 414 nm und erschien im sichtbaren Licht als grüner Farbstoff. Die Extinktion der Verbindung wurde bei einer Wellenlänge von λ = 405 nm photometrisch mit einem ELISA-Reader (BIO-TEK Instr., ELX 808) er-faßt. Als Substrat der alkalischen Phosphatase wurde di-Natrium 4-Nitrophenylphosphat eingesetzt, dessen Umsatzprodukt 4-Nitrophenol ebenfalls bei 405 nm vermessen wurde.
Aufgrund des kleinen Antigenanteils aus den CH2 und CH3-Domänen des E-Selektin-IgG-Proteins wurden als Primär- und Sekundärantikörper für diesen Nachweis keine komplet-ten Antikörpermoleküle, sondern nur die antigenbindenden Fab-Anteile verwendet. Somit konnte eine sterische Behinderung verhindert werden.
Proben Standard
1 9
2 10
3 11
4 12
5 13
6 14
7 15
8 16
Blanks
Abbildung 2.15: Schematische Darstellung der Probenbelegung auf der ELISA-Mikrotiterplatte.
Da die Reaktion nicht abgestoppt wurde, konnte die Zunahme der Extinktionswerte über einen längeren Zeitraum verfolgt werden. Zur Konzentrationsberechnung wurde ein inter-ner Standard in eiinter-ner Verdünnungsreihe mitgeführt (siehe Abbildung 2.15). Im Falle des CSLEX-Nachweises war dies ein aus Zellkulturüberstand aufgereinigter monoklonaler κ -IgM-Antikörper (DIANOVA). Für den E-Selektin-IgG-Nachweis diente humanes IgG (SIGMA) als Standard.
Die Antikörperbestimmung im Sandwich-ELISA gliederte sich in neun Arbeitsschritte.
Tabelle 2.13: Arbeitsschritte zur Durchführung des Sandwich-ELISA-Tests zum Nachweis des E-Selektin-IgGs.
1. Binden des Primärantikörpers an der Mikrotiterplatte:
100 µL Beschichtungspuffer mit einer 1:1000-Verdünnung des Kaninchen anti human-IgG (Fcγ) (DIANOVA) Fab-Antikörpers in jedes well vorlegen und ü.N. bei 4°C inkubieren
2. Absättigen freigebliebener Bindungsstellen der Platte:
100 µL Absättigungslösung in jedes well aufschichten, 30 min bei Raumtemperatur schütteln 3. Waschen zur Entfernung nicht gebundenerAntikörper bzw. des Absättigers:
5x waschen (Microplate Washer ELP-40, BIO-TEK INSTRUMENTS) und anschließend ausklopfen 4. Auftragen der zu bestimmenden E-Selektin-IgG-Proben und des Standard-Antikörpers:
100 µL PBS-Blau in jedes well vorlegen, Standard 1:2500 in PBS-Gelb vorverdünnen und in Standar-dreihe auftragen, Blanks nur mit 100 µL PBS-Blau befüllen
100 µL der in PBS-Gelb vorverdünnten Proben in die vorgesehenen wells einpipettieren und mit der 12-Kanalpipette (Titertek) je 1:2 weiterverdünnen
5. Waschen zur Entfernung des nicht gebundenen Probenantikörpers:
Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur erneut 5x waschen und ausklopfen
6. Binden des enzymgekoppelten Sekundärantikörpers an das E-Selektin-IgG und den Standardantikörper:
100 µL Konjugatlösung mit 1:20000 verdünntem Peroxidase-konjugierten Ziege anti human-IgG (Fcγ) Fab-Antikörpers in jedes well pipettieren
7. Waschen zur Entfernung der nicht gebundenen, enzymgekoppelten Antikörper:
Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur 5x waschen und ausklopfen 8. Auftragen des Substrates zum Start der Enzymreaktion (Farbreaktion):
100 µL ABTS-Substratlösung in jedes well einpipettieren, 20 min auf Schüttler inkubieren 9. Bestimmung der Extinktion:
Mikrotiterplatte in den ELISA-Reader legen und Messung starten, nach jeweils 10 min erneut messen, bis sich die Extinktionen im auswertbaren Bereich befinden
Folgende Reagenzien wurden für den ELISA-Test benötigt:
Tabelle 2.14: Lösungen und Antikörper für den Sandwich ELISA-Test zum E-Selektin-IgG Nachweis.
Bestandteil Zusammensetzung
Beschichtungspuffer: 4,29 g Na2CO3⋅10 H2O 2,93 g NaHCO3
auf 1 L dest. H2O, pH 9,4
Absättiger: 5% BSA (azidfrei) in 0,137 M Phosphatpuffer Phosphatpuffer (0,137 M): 13,7 g Na2HPO4⋅2 H2O
9,3 g NaH2PO4⋅H2O auf 1 L dest. H2O, pH 7,0 PBS-Gelb: 2,77 g Na2HPO4⋅12 H2O
0,34 g NaH2PO4⋅H2O 8,75 g NaCl
0,1 g Tartrazin (SERVA 35754) auf 1 L dest. H2O, pH 7,2 PBS-Blau: 0,44 g Na2HPO4⋅12 H2O 0,13 g NaH2PO4⋅2 H2O 8,75 g NaCl
1,8 g BSA
1,65 g Chloramphenicol (SIGMA C-0378) 0,034 g Neomycinsulfat (SIGMA N-1876) 0,1 g Alphazurine A (EGA 19814-5) 0,5 mL Tween 20
auf 1 L dest. H2O, pH 7,2 Waschlösung: 0,05 % Tween 20 in dest. H2O PBS/Tween: 0,44 g Na2HPO4⋅12 H2O
0,13 g NaH2PO4⋅2 H2O
8,7 g NaCl 0,5 mL Tween 20 auf 1 L dest. H2O pH 6,7
Konjugatlösung: 5 mL PBS/Tween
5 mL BSA 5% (azidfrei) ABTS-Substratpuffer: 0,94 g NaBO3⋅4 H2O
0,83 g Citric-monohydrat 21,47 g Na2HPO4⋅12 H2O auf 1 L dest H2O, pH 4,5
ABTS-Substrat: ABTS (2,2´-Azino-di[3-ethyl-benzthialozin-sulfonat(6)]) (BOEHRINGER Mannheim)
Substratlösung: 27,4 mg ABTS auf 25 mL Substratpuffer
Für den Nachweis des CSLEX-Antikörpers im Sandwich-ELISA ergeben sich folgende Änderungen:
Tabelle 2.15: Unterschiede des CSLEX-ELISAs zum E-Selektin-IgG Nachweis.
1. Binden des Primärantikörpers an der Mikrotiterplatte:
100 µL Beschichtungspuffer mit einer 1:250-Verdünnung des Ratte IgG anti Maus-IgM (PHARMINGEN) Antikörpers in jedes well vorlegen und ü.N. bei 4°C inkubieren
4. Auftragen der zu bestimmenden CSLEX-Proben und des Standard-Antikörpers:
100 µL PBS-Blau in jedes well vorlegen, Standard 1:2500 in PBS-Gelb vorverdünnen und in Standard-reihe auftragen, Blanks nur mit 100 µL PBS-Blau befüllen
100 µL der in PBS-Gelb vorverdünnten Proben in die vorgesehenen wells einpipettieren und mit der 12-Kanalpipette (Titertek) je 1:2 weiterverdünnen
6. Binden des enzymgekoppelten Sekundärantikörpers an den CSLEX- und den Standardantikörper:
100 µL Konjugatlösung mit 1:1000 verdünntem, mit alkalischer Phosphatase-konjugiertem Ratte anti Maus-IgM Antikörpers (PHARMINGEN) in jedes well pipettieren
8. Auftragen des Substrates zum Start der Enzymreaktion (Farbreaktion):
100 µL 4-Nitrophenyl-Substratlösung in jedes well einpipettieren, 20 min auf Schüttler inkubieren
Tabelle 2.16: Unterschiede der Lösungen für den CSLEX-Nachweis im Sandwich-ELISA.
Bestandteil Zusammensetzung
4-Nitrophenyl-Substratpuffer:
(Glycinpuffer)
100 mM Glycin
1 mM ZnCl2, auf pH 10,4 einstellen
4-Nitrophenyl-Substrat: Di-Natrium-4-Nitrophenylphosphat Hexahydrat Substratlösung: 16 mM in 4-Nitrophenyl-Substratpuffer
Der indirekte antigenabhängige ELISA ist in den ersten vier Schritten durch Änderungen gegenüber dem Sandwich-ELISA gekennzeichnet.
Tabelle 2.17: Unterschiede des indirekten ELISAs zum Sandwich-ELISA.
1. Binden des Antigens an der Mikrotiterplatte:
Reihe ansteigender Volumina aber gleicher Konzentration humaner Granulocytenganglioside in Metha-nol/Wasser (2/1) vorlegen und ü.N. bei Raumtemperatur eintrocknen
2. Absättigen freigebliebener Bindungsstellen der Platte:
Keine Absättigung
3. Waschen zur Entfernung nicht gebundenerAntikörper bzw. des Absättigers:
Kein Waschen
4. Auftragen der zu bestimmenden E-Selektin-IgG- bzw. der CSLEX-Proben:
100 µL der gleichkonzentrierten Proben in die vorgesehenen wells einpipettieren
(alternativ können auch die Proben in einer Verdünnungreihe aufgetragen werden, dann muß in Schritt 1 in jedes well die gleiche Menge Antigen pipettiert werden)