ABWEICHENDEN I ONENKONZENTRATIONEN IN C GKI Α -R ESCUE -M UTANTEN
12. ANHANG
ASDN Aldosteron sensible distales Nephron BSA Bovines Serum-Albumin
ERK 1/2 extracellular-signal regulated kinase 1/2 FACS fluorescence -activated cell sorting FSC Forward Scatter
HBBS Hank’s balanced Salt Solution HPLC High pressure liquid chromatography HRP Horse redish peroxidase
IRAG IP3-Rezeptor-assoziiertes cGK-Substrat ISDN Isosorbid-2,5-dinitrat;
MYPT1 Myosin Phosphatase target Subunit 1
n nano
RT- Reverse Transkription / Transkriptase RT Raumtemperatur
12.2 Abbildungen und Tabellen
Abbildungen:
Abb. 1: NO/cGMP-Signaltransduktionsweg…...8
Abb. 2: Schematische Darstellung der Struktur der cGKs...10
Abb. 3: Trimerer Komplex……….……….12
Abb. 4: Aufbau eines Nephrons...12
Abb. 5: Schematische Ansicht eines Nierenkörperchens...13
Abb. 6: Stoffwechselkäfig...32
Abb. 7: HPLC-Chromatogramme ………...34
Abb. 8: Magnet für Glomeruli Isolierung………...………...36
Abb. 9: Analyse der Expression von cGKI im JGA………...………...55
Abb. 10: Expression der cGKI im Mesangium………..………..………...56
Abb. 11: Glomeruläre Strukturen ohne cGKI Expression…………...………...57
Abb. 12: Verteilungsmuster von Desmin, cGKIα, cGKβ und sGC innerhalb der Mesangialzellen ..58
Abb. 13: Analyse möglicher Substratproteine der cGKIα und cGKIβ……….59
Abb. 14: Immuno-Blot muriner Mesangialzellen……….60
Abb. 15: 24 h Trink- und Urinvolumina………..……….………61
Abb. 16: Glomeruläre Filtrationsrate………..………..63
Abb. 17: Analyse der Na+- und K+-Konzentrationen..………...……....65
Abb. 18: Immuno-Blot muriner Mesangialzellen………..………..77
Abb. 19: cGMP-Effekt in Abhängigkeit von der Passagenhöhe ……….78
Abb. 20: Kalibriergerade zur Bestimmung der Zellzahl………..………..78
Abb. 21: Übersicht über das Proliferationsverhalten von WT- und cGKIα-Rescue-Mesangialzellen ………..………..80 VASP Vasodilatatorisches Phosphoprotein
VSMC Vascular-smooth-muscle-cells vWF von Willebrand Faktor VIP Vasoaktives intestinales Peptid WT Wildtyp
WB Western-Blot
Abb. 22: Effekt von 1 mM 8-Br-cGMP auf kultivierte Mesangialzellen………...………81
Abb. 23: Übersichtsbild einer mit cGKIα-AK gefärbten WT Niere………...83
Abb. 24: Übersichtsbild einer mit cGKIβ-AK gefärbten WT Niere………...83
Abb. 25: Analyse der cGKI-Expression im medullären Interstitium……….84
Abb. 26: Fibrose-Entwicklung post UUL nach unterschiedlichen Progressionszeiten……….85
Abb. 27: Analyse der mRNA-Expression 1d/7d/14d post UUL………86
Abb. 28: n-fache Zunahme der mRNA-Expression von TGF, FSP, cGKI und sGC nach 7 Tagen UUL………87
Abb. 29: n-fache Expressionszunahme der mRNA-Mengen von TGF, FSP, RhoA und ROCK...89
Abb. 30: Analyse der Protein-Expression von WT-Nieren 7d post UUL mittels Western-Blot……90
Abb. 31: WT-Nieren: Vergleich gesund - fibrotisch - behandelt bzgl. cGKIα-Expression…..…...92
Abb. 32: WT-Nieren: Vergleich gesund - fibrotisch bzgl. cGKIα- bzw. cGKIβ-Expression…..……92
Abb. 33: αSMA-Färbung von WT- versus Rescue-Nieren………..……….93
Abb. 34: Deletion des IRAG Proteins……….102
Abb. 35: Darstellung der erhöhten Aggregabilität………103
Abb. 36: Detektion der Aggregation/Sekretion……….104
Abb. 37 Statistische Darstellung der ATP-Sekretion und Aggregation………109
Abb. 38: FACS-Analyse der P-Selektin-Sekretion und der GPIIb/IIIa Aktivierung………...112
Abb. 39: Statistische Darstellung der Hemmung der GPIIb/IIIa Aktivierung und P-Selektin-Sekretion ……….……….……….…....113
Abb. 40: Vergleich der GPIIb/IIIa Aktivierung und P-Selektin-Sekretion mit dem cAMP-Analogon cBIMPS als Inhibitor………..………114
Abb. 41: Statistische Darstellung der Hemmung der Fibrinogenbindung und der Adhäsion……115
Tabellen: Tab. 1: Puffer und Lösungen...28
Tab. 2: Liste der verwendeten Antikörper...29
Tab. 3: Adsorptions- und Emissionswellenlängen der Fluoreszenz-Farbstoffe…...30
Tab. 4: Bezeichnung der Geräte und technische Daten des HPLC-Laufs...33
Tab. 5: Urin-Verdünnungen für Flammenphotometer...34
Tab. 6: Zusammensetzung der SDS-Polyacrylamidgele...39
Tab. 7: Mastermix für Reverse Transkription...45
Tab. 8: Zusammensetzung des verwendeten Puffers………..….50
Tab. 9: Konzentration/Inkubationszeit der verwendeten Agonisten und Inhibitoren………54
Tab. 10: Vergleich der prozentualen Unterschiede zwischen Trinkvolumina………..62
Tab. 11: Vergleich der prozentualen Unterschiede zwischen Urinvolumina………..………..62
Tab. 12: GFR in [µl/min/g(BW)] von WT- und cGKIα-Rescue………..64
Tab.13: Kreatininkonzentrationen in mg/dl in Serum und Urin………64
Tab. 14: Na+-Konzentrationen [mM] im Urin bei Normal-, Hoch- und Niedrig-Salz-Diät………….66
Tab. 15: K+-Konzentrationen [mM] im Urin bei Normal-, Hoch- und Niedrig-Salz-Diät………66
Tab. 16: Vergleich der prozentualen Unterschiede von WT und cGKIα-Rescue……….……..67
Tab. 17: Übersicht über die prozentuale Hemmung der Proliferation durch 1 mM 8-Br-cGMP in Abhängigkeit von der Passagenhöhe ……….79
Tab. 18: Zusammenfassung der Abb. 21………...………….81
Tab. 19: n-fache Expressionszunahme der mRNA-Mengen………..……….88
Tab. 20: Prozentuale Abnahme der mRNA-Mengen profibrotischer Marker nach Verabreichung von ISDN (30 bzw. 60 mg/kg) und YC1……….…………..88
Tab. 21: Zusammenfassung der mRNA-Mengen aus Abb. 29………....89
Tab. 22: Vergleich der Aggregationsrate [in%] zwischen WT- und IRAG-KO Thrombozyten......105
Tab. 23: Zusammenfassung der IC50 Werte von 8-pCPT-cGMP, SNP bzw. DEA-NO…...…….106
Tab. 24: Vergleich der Hemmung der Sekretion von WT Thrombozyten mit der von IRAG-KO Thrombozyten………108
Tab. 25: FACS-Analyse der Hemmung der P-Selektin-Sekretion……….113
Tab. 26: FACS-Analyse der Hemmung der GPIIb/IIIa Aktivierung………...………113
12.3 Danksagung
An dieser Stelle möchte ich allen Personen, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben, meinen herzlichen Dank aussprechen.
Zuallererst möchte ich Herr Prof. Dr. Schlossmann für die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe, die Überlassung des Themas, die hervorragende Betreuung und die Bereitstellung der Mittel zur Durchführung dieser Arbeit danken. Des Weiteren danke ich Herrn Prof. Dr. Kees für seinen unermüdlichen Einsatz zur Optimierung des HPLC-Protokolls, seine Hilfsbereitschaft und für seine Fürsorglichkeit. Sowie unseren Sekretärin Rita und den TAs, Katharina, Astrid, Gertraud, Maria und Susanne, vor allem Susanne war für mich in den letzten Monaten nicht mehr weg zu denken. Sie zeigten sich alle jederzeit hilfsbereit auch bzgl. Schokoladensucht, Pflasterversorgung oder sonstigen guten und witzigen Ratschlägen.
Von anderen Lehrstühlen möchte ich noch danken Marion Kubitzka, Barbara Reich, v.a. aber Herrn Prof. Dr. Kurtz und seiner TA Anna, für das Lernen von Methoden und deren Hilfsbereitschaft.
Ein besonderes Dankeschön auch an meine Laborkollegen Andrea, Katharina, Petra, Irena, Melanie, Matthias und Higgl, die mir stets mit Rat und Tat (und Schoggi) zur Seite standen und den Arbeitsalltag jeden Tag auf’s Neue amüsant (auch wenn es der Higgl manchmal übertrieben hat) und abwechslungsreich gestalteten. Vornehmlich möchte ich Korrekturlesern ein herzliches
„Dankeschön“ aussprechen (Andrea, Melli, Petra und Kathi). Das einmalige Arbeitsklima war sicherlich für das Gelingen dieser Arbeit in jeder Beziehung nur förderlich und möchte ich auch in Zukunft keinesfalls missen.
Schließlich gebührt (neben meinen drei Brüdern) meiner lieben Mama mein größter Dank für die Ermöglichung meines Studiums, nicht nur aus finanzieller Hinsicht, sondern vor allem auch dafür, dass sie jederzeit ein offenes Ohr hatte, stets motivierend und mich immer mit gutem Zuspruch versorgte.
12.4 Erklärung
Ich erkläre hiermit an Eides statt, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe.
Die aus anderen Quellen direkt oder indirekt übernommenen Daten und Konzepte sind unter Angabe des Literaturzitats gekennzeichnet. Weitere Personen waren an der inhaltlich-materiellen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt.
Insbesondere habe ich hierfür nicht die entgeltliche Hilfe eines Promotionsberaters oder anderer Personen in Anspruch genommen. Niemand hat von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Die Arbeit wurde bisher weder im In- noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.
……… ……….
(Ort, Datum) (Unterschrift)