A NTIFIBROTISCHER E FFEKT VON C GMP/ C GKI IN DER N IERE

Eine Konsequenz der Glomerulosklerose ist die Beeinträchtigung des selektiven Filters, was sich in einer erhöhten Protein-Durchlässigkeit widerspiegelt. Der vermehrte Übertritt von Proteinen in den proximalen Tubulus übersteigt wiederum deren Kapazität zur endozytotischen Rückresorption, wodurch tubulointerstitielle Strukturen geschädigt werden (73). Folglich geht die Glomerulosklerose mit einer tubulointerstitiellen Fibrose einher. Auch deren Begleiterscheinungen sind weitgehend identisch, nämlich überschüssige Bindegewebsvermehrung, unkontrollierte Proliferation sowie Makrophageninfiltration, so dass zwischen den Signalwegen sehr viele Parallelen bzw.

Überschneidungen zu erkennen sind. Dennoch unterscheidet sich die Matrix des Glomerulus von der des tubulären Interstitiums: Während Mesangialzellen im Glomerulus vorzufinden sind, enthält das tubuläre Interstitium primär Fibroblasten.

Immunhistochemisch konnte aber sowohl in Mesangialzellen des Glomerulus als auch in Fibroblasten des Interstitiums cGKIα nachgewiesen werden. Nachdem im vorherigen Kapitel ein antipoliferativer Effekt von cGKI in den Mesangialzellen beschrieben wurde, war nicht auszuschließen, dass durch cGKI auch Proliferationsvorgänge des Interstitiums beeinflusst werden. Deshalb wurde in dieser Arbeit die pathophysiologische Rolle von cGKI bei der Entstehung der interstitiellen Fibrose, für die Proliferationsvorgänge besonders bedeutsam sind, untersucht. Das Modell der unilateralen Ureter Ligation (UUL) eignet sich sehr gut zur Fibrose Induktion bei Mäusen (21). Zudem sei noch darauf verwiesen, dass bei den für die Versuche verwendeten 129sv Mausstamm (im Gegensatz zu BL-6 Mäusen) auch glomerulosklerotische Vorgänge durch die UUL hervorgerufen werden (21). Nach 7 Tagen UUL zeigte sich

eine stark veränderte cGKIα-Expression sowohl auf mRNA-Ebene mittels Light Cycler als auch auf Protein-Ebene mittels immunhistochemischer Aufnahmen und Western-Blot. Diese Ergebnisse sprachen für eine Involvierung von cGKIα an fibrotischen Vorgängen. Wie in Abb. 27 (siehe 2.10.4) deutlich zu erkennen ist, nimmt die Expression der cGKIα-mRNA 7 Tage nach der Fibrose Induktion viel stärker zu (6,8±0,6) als die der β-Isoform (2,6±0,2). Auch auf Protein-Ebene (mittels Western-Blot) dominierte in der Ureter ligierten Niere die cGKIα-Expression gegenüber der cGKIβ (siehe 2.10.3, Abb. 30 A). Immunhistochemisch wurde die erhöhte cGKIα-Expression in den renalen Strukturen näher analysiert: So zeigten beide Isoformen in der gesunden Niere im cortikalen Interstitium nur eine schwache Färbung, während in der Ureter ligierten Niere die α-Isoform wesentlich deutlicher hoch reguliert wurde als die β-Isoform. Dagegen war im medullären Interstitium der Unterschied zur gesunden Niere wesentlich schwächer, da dort bereits vor der Ligation cGKIα stark exprimiert vorlag.

Nachdem die cGKIα-Expression sowohl auf mRNA-, als auch auf Protein-Ebene am deutlichsten erhöht war, stand im Vordergrund deren Funktion in Hinblick auf die Fibrose zu untersuchen. Der sGC-Aktivator YC1 bzw. der NO-Donor ISDN stimuliert durch erhöhte cGMP-Konzentrationen cGKI. Nach Applikation von YC1 bzw. ISDN an WT-Mäusen wurden die mRNA-Mengen der profibrotischen Stimuli signifikant erniedrigt.

Deshalb erschien ein protektiver Effekt zumindest von NO/cGMP naheliegend. Um sicher zu stellen, dass auch cGKI involviert war, wurde das gleiche Prozedere mit den cGKIα-Rescue-Mäusen wiederholt. Ohne YC1- bzw. ISDN-Gabe glichen sowohl immunhistochemisch als auch auf mRNA-Ebene die fibrotischen WT-Nieren den fibrotischen Rescue-Nieren. Die mRNA-Mengen für die profibrotischen Faktoren waren zwar bei den Rescues tendenziell höher, jedoch im Vergleich zu den WT nicht signifikant. Erst nach ISDN Applikation wurde der Unterschied zwischen beiden Maus-linien deutlich, indem die in den WT detektierte „down-regulation“ der Fibroseindikatoren in den Rescue-Mäusen unterblieb. Eine Erklärung hierfür wäre:

Die fibrosebedingt, vermehrt gebildeten Myofibroblasten exprimierten weiterhin cGKIα, weshalb in der fibrotischen WT-Niere erhöhte cGKIα-Mengen nachgewiesen wurden.

Jedoch war die Aktivierung der cGKI zu gering, um auch ohne ISDN Unterschiede zwischen WT- und Rescue-Mäusen feststellen zu können. Der PKG-Effekt wurde aber nach ISDN-Gabe deutlich, nachdem erhöhte cGMP-Spiegel zu einer Aktivierung der cGMP-abhängigen Kinase beigetragen haben. Demzufolge kann angenommen werden, dass der antifibrotische Effekt von NO/cGMP über cGKI vermittelt wurde.

Die cGKI wiederum besitzt verschiedene Effektoren. Das im Zusammenhang mit Fibrose wohl am häufigsten diskutierte Substrat der cGKI stellt das bereits erwähnte RhoA und

deren Kinase ROCK (Rho-associierte Protein-Kinase) dar (siehe Kap. 1.3.3). Wie bereits in der Einleitung (siehe Kap. 1.3.3) beschrieben, kann die RhoA/ROCK Kaskade durch Vasokonstriktoren oder Wachstumsfaktoren aktiviert werden (81, 139, 111).

Anschließend werden smad-Transkriptionsfaktoren phosphoryliert, wodurch die Gentranskription profibrotischer Proteine initiiert wird (140).

Auch die Ureter ligierten Nieren zeigten (7d post UUL) leicht erhöhte mRNA-Mengen für RhoA/ROCK. Nach ISDN-Gabe wurde jedoch die mRNA-Menge von RhoA/ROCK nur in WT und nicht in Rescue-Mäusen signifikant verringert. Demzufolge liegt es nahe, dass der protektive Effekt von cGKI unter anderem über RhoA/ROCK vermittelt wird.

Ein cGMP-abhängiger antifibrotischer Effekt wurde bereits aufgrund einer verminderten Expression des Glycoproteins TSP-1 (Thrombospondin 1) diskutiert (59, 154). TSP-1 wird nicht nur bei der diabetischen Nephropathie durch die erhöhten Glucosespiegel, sondern auch bei der Thy1 induzierten Glomerulonephritis vermehrt gebildet. Erhöhte TSP-1-Spiegel wiederum aktivieren den Wachstumsfaktor TGFβ, der wie bereits erwähnt als Initiator für die Signalkaskade fungiert, indem er über die Phosphorylierung von smad-Proteinen die Gentranskription von Matrixproteinen und somit die Matrix-Expansion begünstigt (59, 154). Erhöhte cGMP-Spiegel - induziert in der einen Arbeit durch die Hemmung von PDE5 (59), beziehungsweise durch die Gabe eines NO-Donors (154) - inhibierten den Ablauf dieser Signalkaskade, indem sie die TSP-1-Expression und nachfolgende TGFβ Aktivierung verminderten. Zusätzlich wurde noch auf eine cGMP-abhängige Aktivierung der PKG geschlossen, nachdem der PKG-Inhibitor KT5823 den NO/cGMP-Effekt aufhob, dagegen durch die konstitutive Expression der katalytischen Domäne der cGKI die Wirkung von NO/cGMP wiederhergestellt werden konnte (154). Neben dem Einfluss auf die TSP-1-Expression soll cGKI auch direkt in die Gentranskription eingreifen, indem es zusammen mit - durch TGFβ aktiviertem - smad4 einen Komplex ausbildet und dadurch deren Funktion für die Gentranskription unterbindet.

Weiterhin ist die ungehemmte Proliferation auf einen pathologisch veränderten Ablauf des Zellzyklus zurückzuführen. Sowohl bei der Thy1 induzierten Glomerulonephritis als auch bei der diabetischen Nephropathie findet eine erhöhte Zellteilung durch einen ungehemmten Eintritt von der G1- in die S-Phase statt. Ein Zusammenspiel verschiedener Proteine bestimmt deren Ablauf: Beginnend mit dem rb (retinoblastoma)-Protein, das den Übergang von der G1- zur S-Phase kontrolliert. Das rb-Protein selbst wird durch CDK (Cyclin-abhängige Kinasen) kontrolliert. Deren Aktivität wiederum wird durch das p21 und p27 Protein determiniert. Folglich lässt eine durch p21 und p27 vermittelte verringerte Hemmung dieser CDKs eine verstärkte Stimulierung des

rb-Proteins zu. PKG soll hier inhibierend auf die erhöhte Cyclin-Expression eingreifen, dagegen stimulierend auf die erniedrigte p27- bzw. p21-Aktivität. In beiden Fällen wird die erhöhte Cyclin-abhängige Kinasen-Aktivität vermindert, wodurch das rb-Protein weniger stimuliert und nachfolgend auch die Zellteilung normalisiert wird (153, 61).

Denkbar wäre, dass auch dieser PKG-Effekt über RhoA vermittelt wird. Wie bereits in Kap. 1.3.3 erwähnt, wird RhoA ein regulatorischer Einfluss auf Cycline und nachfolgender Zellteilung, speziell dem Übergang von G1- zur S-Phase, zugesprochen (164).

8. Zusammenfassung Niere-Teil 2: Pathophysiologische