2 Manuskript 1
4.3 Analyse des neuartigen Multi-Resistenzplasmids pSWS47
sowie der Analyse von Insertionselementen in Hinblick auf Rekombinationsprozesse, die möglicherweise an der Entstehung dieses Plasmids beteiligt waren
4 Diskussion
4.1 Isolierung und Verteilung von MRS
Aus insgesamt 72 Tupferproben von Räumlichkeiten und Oberflächen (n=58), Mitarbeitern (n=4) und stationär aufgenommenen Tieren (n=10) wurden 34 MRS isoliert, davon 29 verschiedene koagulasenegative Staphylococcus-Isolate (MRCoNS). Die restlichen fünf Isolate wurden als MRSA identifiziert. Mit 58 Tupferproben wurden alle relevanten Bereiche innerhalb der Klinikräumlichkeiten abgedeckt. Außerdem wurden alle vorhandenen Patienten sowie Mitarbeiterinnen und Mitarbeiter auf freiwilliger Basis und alle stationär aufgenommenen Tiere beprobt. In Abbildung 4.1 sind die Proben nach Gesamtzahl und Anzahl nachgewiesener MRS-Isolate dargestellt.
Abb. 4.1. Herkunft und Verteilung der Tupferproben
Aus allen Nasentupfern der vier Klinikmitarbeiter wurden MRS-Isolate nachgewiesen.
Das Personal war ohne Anzeichen von Symptomen mit unterschiedlichen MRS kolonisiert. Lediglich ein Isolat wurde auch in anderen Proben gefunden, während die
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Diskussion 4
übrigen zwei MRSE-Isolate sowie ein MRSA-Isolat in keiner weiteren Probe nachgewiesen werden konnten.
Laut eigener Aussage traten in der Klinik bislang keine Probleme mit nosokomialen Infektionen oder postoperativen Wundkomplikationen auf, was in Einklang mit der niedrigen Nachweisrate im Operationsbereich steht. Das einzige, detektierte Isolat stammte von einem Stethoskop, das ausschließlich im Operationsbereich zwecks Narkoseüberwachung verwendet wird. Auf Oberflächen und Behandlungstischen der Behandlungsräume konnten keine MRS nachgewiesen werden. Im Stationsbereich konnte der höchste Anteil MRS isoliert werden (67,6%) und mehrere voneinander unabhängige, unterschiedliche Isolate wurden nachgewiesen. Zudem fanden sich mit den angewandten Typisierungsverfahren nicht unterscheidbare Isolate aus verschiedenen Proben, welche als Klone angesehen werden können. Zudem wurden sich stark ähnelnde Isolate detektiert, die genetisch miteinander verwandt sind. Aus einigen Tupferproben wurden auch mehrere MRS-Isolate isoliert. In Abbildung 4.2 sind die detektierten Spezies dargestellt.
Abb. 4.2. Speziesverteilung methicillinresistenter Staphylokokken (n=34) 62%
(n=21) 15%
(n=5) 17%
(n=6) 6%
(n=2)
S. epidermidis S. aureus S. haemolyticus S. pettenkoferi
4 Diskussion
Bei der Bestimmung der Oberflächenkontamination durch Staphylokokken in einer veterinärmedizinischen Klinik in Großbritannien wurde eine ähnliche Verteilung wie in der vorliegenden Studie beschrieben (AKSOY et al. 2010). So fanden sich im Ver-gleich zu den Sprechzimmern im stationären Bereich zwei- bis vierfach erhöhte Kontaminationsraten, gemessen in koloniebildenden Einheiten je Quadratzentimeter auf dem Selektivagar nach Baird-Parker. Allerdings wurde in dieser Studie weder eine Differenzierung der verschiedenen Staphylococcus-Isolate noch die Untersu-chung auf Methicillinresistenz vorgenommen. Trotzdem identifizierten AKSOY und Kollegen (2010) die stationäre Aufnahme und Behandlung eines Tiers, analog zur Humanmedizin, als Risikofaktor für eine Kolonisierung mit MRS. Die Isolierung von MRS bei sechs von zehn Tieren in der vorliegenden Arbeit deutet darauf hin, dass hier eine ähnliche Situation angenommen werden kann.
4.2 Charakterisierung der MRS-Isolate
Die vier identifizierten MRS-Spezies – S. aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. pettenkoferi – wurden mit etablierten molekularen Typisierungsmethoden charakterisiert und hinsichtlich ihres phänotypischen Resistenzverhaltens und ihrer genotypischen Resistenzmarker untersucht.
In dieser Studie lag mit insgesamt fünf MRSA-Isolaten der Anteil an MRSA im Testkollektiv (n=72) bei 6,9%. Diese Detektionsrate ist etwas geringer als in einer Studie von LOEFFLER und Kollegen (2005), bei welcher der MRSA-Anteil am Gesamtprobenaufkommen bei 9,3% lag. Die höhere Detektionsrate könnte aufgrund der höheren Probenzahl (n=300) ebenso wie durch die Tatsache, dass die untersuchte Klinik in der Studie von LOEFFLER und Kollegen (2005) deutlich größer war, erklärt werden. Allerdings war auch in der Studie von LOEFFLER und Kollegen (2005) keines der Tiere von einer klinischen Infektion mit MRS betroffen. Von den fünf MRSA-Isolaten in der vorliegenden Studie gehörten vier dem klonalen Komplex (clonal complex; CC) 398 an. MRSA aus diesem CC werden als Nutztier-assoziierte beziehungsweise „livestock-associated“ MRSA (LA-MRSA) bezeichnet (MONECKE et al. 2011).
Diskussion 4
SpeziesProbenherkunftIsolat Resistenzphänotypa Resistenzgenotyp . aureusBox Katze 2: Decke17BLA-SPT-TETblaZ-mecA-tet(K)-tet(M) Katze 220BLA-SPT-TETblaZ-mecA-tet(K)-tet(M) Katze 849BLA-CHL/FFC-SPT-SXT-TETblaZ-mecA-fexA-dfrK-tet(K) Box Katze 5: Decke51-1BLA- MLi-SPT-SXT-TETblaZ-mecA-erm(C)-dfrK-tet(K) Tierarzt: Nasentupfer 66BLA-ENR-MLcblaZ-mecA-erm(C) epidermidisBox Katze 1: Griff 5BLA-ENR-MLcblaZ-mecA-erm(C) Katze 748BLA-ENR-MLcblaZ-mecA-erm(C) Katze 546BLA-MLc-TETblaZ-mecA-erm(C)-tet(K)-tet(M) Box Katze 3: Napf 16BLA-ENR-MLc-TETblaZ-mecA-erm(C)-tet(K) Box Katze 7: Decke58BLA-ENR-MLc-TETblaZ-mecA-erm(C)-tet(K) Katze 647BLA-CHL/FFC-ENR-MLc-SPT-SXT-TET-TIAblaZ-mecA-fexA-erm(C)-vga(A)-dfrK-dfrS1-tet(L)-tet(M) Katze 950BLA-CHL/FFC-ENR-MLc-SPT-SXT-TET-TIAblaZ-mecA-fexA-erm(C)-vga(A)-dfrK-dfrS1-tet(L)-tet(M) Box Katze 5: Griff 52BLA-CHL/FFC-ENR-MLc-SPT-SXT-TET-TIAblaZ-mecA-fexA-erm(C)-vga(A)-dfrK-dfrS1-tet(L)-tet(M) Box Katze 6: Napf 54BLA-CHL/FFC-ENR-MLc-SPT-SXT-TET-TIAblaZ-mecA-fexA-erm(C)-vga(A)-dfrK-dfrS1-tet(L)-tet(M) Box Katze 6: Decke55BLA-CHL/FFC-ENR-MLc-SPT-SXT-TET-TIAblaZ-mecA-fexA-erm(C)-vga(A)-dfrK-dfrS1-tet(L)-tet(M) Box Katze 7: Griff 57BLA-CHL/FFC-ENR-MLc-SPT-SXT-TET-TIAblaZ-mecA-fexA-erm(C)-vga(A)-dfrK-dfrS1-tet(L)-tet(M) Station: Utensilo62BLA-CHL/FFC-ENR-MLc-SPT-SXT-TET-TIAblaZ-mecA-fexA-erm(C)-vga(A)-dfrK-dfrS1-tet(L)-tet(M) Station: Behandlungstisch64-2BLA-CHL/FFC-ENR-MLc-SPT-SXT-TET-TIAblaZ-mecA-fexA-erm(C)-vga(A)-dfrK-dfrS1-tet(L)-tet(M) Personal: Nasentupfer 67BLA-CHL/FFC-ENR-MLc-SPT-SXT-TET-TIAblaZ-mecA-fexA-erm(C)-vga(A)-dfrK-dfrS1-tet(L)-tet(M) Box Katze 5: Decke51-2BLA-CHL/FFC-ENR-MLc-SPT-SXT-TETblaZ-mecA-fexA-erm(C)-dfrK-dfrS1-tet(L)-tet(M) Box Katze 6: Griff 53-2BLA-CHL/FFC-ENR-MLc-SPT-SXT-TETblaZ-mecA-fexA-erm(C)-dfrK-dfrS1-tet(L)-tet(M) Box Katze 7: Napf 56BLA-CHL/FFC-ENR-MLc-SPT-SXT-TETblaZ-mecA-fexA-erm(C)-dfrK-dfrS1-tet(L)-tet(M) Praktikant: Nasentupfer 68BLA-MLi-SPTblaZ-mecA-erm(C) Personal: Nasentupfer 69BLA-MLi-TETblaZ-mecA-erm(C)-tet(K)-tet(L) OP: Stethoskop74BLA-MLc-TETblaZ-mecA-erm(C)-tet(K)-tet(L) Box Katze 4: Griff 12BLA-ENR-MLc-SXT-TETblaZ-mecA-erm(C)-dfrS1-tet(K)-tet(L) aemolyticusBox Katze 1: Decke7BLA-ENR-GEN-KAN-MLc-SMXblaZ-mecA-erm(C)-aacA/aphD-aadD Box Katze 1: Napf 8BLA-ENR-GEN-KAN-MLc-TET-SMXblaZ-mecA-erm(C)-aacA/aphD-aadD-tet(K) Box Katze 6: Griff 53-1BLA-ENR-MLi-KAN-SPT-SXTblaZ-mecA-erm(C)-aadD-dfrK-dfrS1 Station: Lüftung63BLA-ENR-MLi-GEN-KAN-SXTblaZ-mecA-erm(C)-aacA/aphD-aadD-dfrK Station: Behandlungstisch64-1BLA-ENR-MLi-KAN-SXTblaZ-mecA-erm(C)-aadD-dfrK-dfrS1 Station: Lichtschalter 65BLA-ENR-MLi-GEN-KAN-SPT-SXTblaZ-mecA-erm(C)-aacA/aphD-aadD-dfrK pettenkoferiBox Katze 8: Decke60BLA-ENR-MLc-SPTblaZ-mecA-erm(C)-spc Box Katze 8: Napf 61BLA-ENR-MLc-SPT-SXTblaZ-mecA-erm(C)-spc-dfrK-dfrS1
elle 4.1. Resistenzeigenschaften der 34 MRS (modifiziert nach WEIß et al. 2013a) β-Laktame; CHL: Chloramphenicol; ENR: Enrofloxacin; FFC: Florfenicol; GEN: Gentamicin, KAN: Kanamycin; MLc: Makrolide/Lincosamide (konstitutiv); MLi: Makrolide/Lincosamide (induzierbar), SPT: nomycin; SMX: Sulfamethoxazol, SXT: Sulfamethoxazol/Trimethoprim,TET: Tetrazykline; TIA: Tiamulin
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abelle 4.2. Molekulare Eigenschaften der 34 MRS (modifiziert nach WEIß et al. 2013a) SpeziesProbenherkunftIsolat SCCmecdruspaCC/ST S. aureusBox Katze 2: Decke17Vdt11at011CC398 Katze 220Vdt11at011CC398 Katze 849Vdt12wt034CC398 Box Katze 5: Decke51-1Vdt12wt034CC398 Tierarzt: Nasentupfer 66IVdt10at032ST217 S. epidermidisBox Katze 1: Griff 5IVdt9bbn.a.b ST5 Katze 748IVdt10cbn.a. ST5 Katze 546IVdt10gn.a. ST5 Box Katze 3: Napf 16IVdt10cbn.a. ST5 Box Katze 7: Decke58IVdt10cbn.a. ST5 Katze 647IVdt10an.a. ST5 Katze 950IVdt10an.a. ST5 Box Katze 5: Griff 52IVdt10an.a. ST5 Box Katze 6: Napf 54IVdt10an.a. ST5 Box Katze 6: Decke55IVdt10an.a. ST5 Box Katze 7: Griff 57IVdt10an.a. ST5 Station: Utensilo62IVdt10an.a. ST5 Station: Behandlungstisch64-2IVdt10an.a. ST5 Personal: Nasentupfer 67IVdt10an.a. ST5 Box Katze 5: Decke51-2IVdt10an.a. ST5 Box Katze 6: Griff 53-2IVdt10an.a. ST5 Box Katze 7: Napf 56IVdt10an.a. ST5 Praktikant: Nasentupfer 68IVdt10an.a. ST66 Personal: Nasentupfer 69n.t.a dt10an.a. ST48 OP: Stethoskop74IVdt10r n.a. ST10 Box Katze 4: Griff 12n.t. dt9bcn.a. ST2 S. haemolyticusBox Katze 1: Decke7n.t. dt11cn.a. n.a. Box Katze 1: Napf 8n.t. dt11cn.a. n.a. Box Katze 6: Griff 53-1Vdt5i n.a. n.a. Station: Lüftung63Vdt5i n.a. n.a. Station: Behandlungstisch64-1Vdt5i n.a. n.a. Station: Lichtschalter 65Vdt5i n.a. n.a. S. pettenkoferiBox Katze 8: Decke60IVdt10an.a. n.a. Box Katze 8: Napf 61IVdt10an.a. n.a. n.t. = nicht typisierbar;b n.a. = nicht anwendbar
Diskussion 4
Die Isolate stammten von zwei verschiedenen stationär aufgenommenen Katzen, einer dem Patienten zugehörigen Box und einer weiteren Box, in welcher sich eine mit MRSE kolonisierte Katze befand, die aber nicht Träger des entsprechenden MRSA CC398-Isolats war. Gemäß dem heutigen Kenntnisstand gelten Schweine-, Rinder- und Geflügel-Nutztierbestände als das Hauptreservoir von LA-MRSA, die sich allerdings durch geringe Wirtsspezifität auszeichnen. So beschreiben CUNY und Kollegen (2013) Kolonisierungsraten bei Landwirten von bis zu 86%, die Verbreitung im Haushalt von Mensch zu Mensch betrage etwa vier Prozent. Generell würden LA-MRSA in Krankenhäusern in Deutschland aber eher selten isoliert (0,8 - 2%). Aller-dings könnte sich durch das vermehrte Auftreten von LA-MRSA bei Haustieren die Nachweisrate erhöhen. Bei Liebhabertieren wurde MRSA CC398 bereits bei Pferden und Hunden nachgewiesen (NIENHOFF et al. 2009, FLORAS et al. 2010, VAN DUIJKEREN et al. 2011). Neben asymptomatischer Kolonisation können LA-MRSA bei Haustieren auch maßgeblich am Krankheitsgeschehen beteiligt sein, wie von FLORAS und Kollegen (2010) berichtet. Trotz des Auftretens bei diversen Haustier-spezies wurden MRSA bei der Katze bisher noch nicht beschrieben. Ob sich LA-MRSA bei Haustieren etablieren oder ob sie weiterhin nur vereinzelt auftreten werden, ist noch nicht absehbar. Die Entwicklung von LA-MRSA bei Haustieren sollte in jedem Fall überwacht werden, um diese als neue Infektionsquelle frühzeitig identi-fizieren zu können.
Auch die Resistenzsituation von LA-MRSA-Isolaten von Nutztieren sollte weiter überwacht werden, auch wenn derzeit noch viele LA-MRSA-Isolate von Nutztieren lediglich resistent gegenüber zwei Wirkstoffklassen sind (KADLEC et al. 2009, FEßLER et al. 2010a), und somit noch gute Behandlungsmöglichkeiten bei klinischer Infektion durch LA-MRSA bestehen.
In dieser Studie wiesen die LA-MRSA-Isolate bereits Resistenzen gegen drei bis fünf Wirkstoffklassen auf. Das fünfte MRSA-Isolat (Isolat 66) mit dem Multilocus-Sequenztyp (ST) 217 stand in keinem Zusammenhang mit den vier Übrigen. Es wurde aus dem Nasentupfer eines Klinikmitarbeiters isoliert. MRSA ST217 ist eine Variante eines endemischen, nosokomialen MRSA-Klons, EMRSA-15 ST22 (QI et al.
2005, LOZANO et al. 2009, MONECKE et al. 2011). Die
Multilocus-Sequenz-Typisie-4 Diskussion
rung (MLST) ergibt lediglich ein abweichendes Allel für das Gen tpi (Triosephosphat-Isomerase) zu ST22. Über die Umstände, die zur Kolonisation geführt haben, lassen sich nur Vermutungen anstellen. Dass kurativ tätige Tierärzte oder Mitarbeiter in der tierärztlichen Praxis Träger von MRSA sein können, wurde bereits beschrieben (HANSELMAN et al. 2006).
Die hohe Zahl methicillinresistenter, koagulasenegativer Staphylokokken (MRCoNS) ist auffällig, aber nicht mit anderen Ergebnissen vergleichbar, da keine weiteren Studien zur Isolierung und Charakterisierung von MRCoNS aus Kleintierkliniken und -praxen vorliegen. Zumeist werden MRCoNS in der Fragestellung von Studien nicht berücksichtigt. Dies mag neben der umstrittenen Rolle als Ursache nosokomialer Infektionen in der Veterinärmedizin auch an den Kultivierungsmethoden vieler Stu-dien liegen. Häufig wird auf Staphylococcus aureus- oder MRSA-selektive Nährbö-den, wie etwa Chromagar, zurückgegriffen oder es werden Oxacillin-Konzentrationen verwendet, die nicht berücksichtigen, dass MRCoNS zum Teil deutliche niedrigere minimale Hemmkonzentrationen aufweisen als MRSA (Feßler et al. 2010b).
Allerdings nehmen nosokomiale Infektionen mit MRCoNS in der Humanmedizin ste-tig zu und treten auch in der Veterinärmedizin auf, was zukünfste-tig die Identifizierung der koagulasenegativen Spezies sowie eine detaillierte Charakterisierung erfordern wird.
Neben MRSA sind MRSE die häufigsten, mit nosokomialen Infektionen assoziierten Staphylokokken in der Humanmedizin, verfügen allerdings nicht über ähnlich ausge-prägte Virulenzfaktoren wie MRSA (OTTO 2009). Sie gelten als Kommensalen; ihnen wird aber auch eine Rolle als Reservoir für diverse Resistenzgene zuerkannt (ZIEBUHR et al. 2006). In der Humanmedizin sind sie die Hauptverursacher Kathe-ter-assoziierter Infektionen und können in immunsupprimierten Individuen chronische Erkrankungen hervorrufen (MIRAGAIA et al. 2008). Auch in dieser Studie wurden MRSE nicht nur als häufigste MRCoNS, sondern als insgesamt häufigste MRS-Spe-zies (n=21) nachgewiesen. Innerhalb der MRSE-Isolate fanden sich Isolate mit deut-lich erweitertem Resistenzspektrum. Diese verfügten dementsprechend auch über Resistenzgene gegen minimal drei und maximal zehn verschiedene Antibiotika-Klas-sen. In einer Publikation von FLUIT und Kollegen (2001), der Daten aus dem
inter-Diskussion 4
nationalen Überwachungsprogramm SENTRY zugrunde gelegt sind und in der die Multiresistenz der zehn meist isolierten bakteriellen Erreger thematisiert wird, er-scheint S. epidermidis als Erreger mit im Vergleich zu S. aureus höheren Resistenz-raten. Alle MRSE wurden neben den SCCmec-assoziierten Typi-sierungsmethoden mittels MLST charakterisiert, bei welcher sieben Haushaltsgene als Zielstruktur einer allelbasierten Sequenzanalyse verwendet werden (THOMAS et al. 2007). Die se-quenzbasierte Analyse der Haushaltsgene zeigte, dass bei S. epidermidis die geneti-sche Auffächerung innerhalb der klonalen Komplexe vornehmlich durch Rekombina-tionen stattfindet (MIRAGAIA et al. 2007). Dies steht im Gegensatz zu S. aureus, bei dem die Diversität innerhalb der klonalen Komplexe durch Punktmutationen entsteht (FEIL et al. 2003). Die fünf in dieser Studie nachgewiesenen MLST-Typen ST2, ST5, ST10, ST48 und ST66 gehören alle bis auf ST66 (bei Isolat 68) dem CC2 an, wel-cher der größte und am weitesten verbreitete CC bei S. epidermidis ist (MIRAGAIA et al. 2007). Die Analyse der Resistenzeigenschaften sowie der molekularen Cha-rakteristika der MRSE-Isolate in dieser Studie zeigte ein nicht unterscheidbares Ilat, das im Stationsbereich der Klinik, bei zwei stationär aufgenommenen Katzen so-wie beim Personal detektiert wurde.
Abb. 4.3. SmaI Restriktionsmuster von MRSE Isolaten (modifiziert nach WEIß et al., 2013a). Der MRSE Klon ist durch ein Sternchen (*) gekennzeichnet. Die mit M bezeichneten Spuren zeigen den mit SmaI-verdauten Marker S. aureus NCTC8325; die Fragmentgrößen des Markers sind in kb
4 Diskussion
Alle Isolate trugen ein SCCmec Typ IV Element, zeigten dru (direct repeat unit) Typ dt10a, MLST-Typ ST5 und wiesen ein identisches Resistenzmuster auf. Die SmaI-Makrorestriktionsanalyse bestätigte die Klonalität dieses MRSE-Isolates durch nicht unterscheidbare SmaI-Muster.Außerdem passte das leicht veränderte SmaI-Muster dreier sehr ähnlicher Isolate (Isolate 51-2, 53-2 und 56) zum abweichenden Resistenzmuster bei ansonsten gleichen molekularen Charakteristika. Auch wenn der Ursprung des MRSE-Klons ungeklärt bleibt, zeigt die Isolierung aus verschiedenen Umgebungsproben die Wichtigkeit von Hygiene im Stationsbereich auf. In Abbildung 4.3 ist der Nachweis des MRSE-Klons illustriert; anhand der unter-schiedlichen Probenherkünfte innerhalb des Stationsbereichs lassen sich häufig getätigte Handgriffe vermuten (Öffnen und Schließen der Boxen, Untersuchung und Behandlung des Patienten auf dem Behandlungstisch, Applikation von Medika-menten). Außerdem wird mit dieser Studie die speziesübergreifende Kolonisation durch multiresistente MRCoNS und damit ihr zoonotisches Potential belegt.
Abb. 4.4. Skizze des Stationsbereichs der Kleintierklinik. Station und Isolierstation jeweils mit Boxen für Patienten, Behandlungstisch, Kanülenspender, Stauraum, Spültisch. Das Dreieck zeigt die Probenherkunft der neun MRSE-Isolate.
Diskussion 4
Als weitere MRCoNS-Spezies wurden S. haemolyticus-Isolate identifiziert, die von Boxen (Isolate 7, 8, 53-1), dem Behandlungstisch (Isolat 64-1) und der Lüftung (Isolat 63) sowie von einem Lichtschalter (Isolat 65) stammten.
Methicillinresistente S. haemolyticus werden in der Humanmedizin mit nosokomialen Infektionen assoziiert und nach MRSE als nächsthäufig auftretende MRCoNS bezeichnet (YU et al. 2010). Auch in der Veterinärmedizin konnten bereits methicillinresistente S. haemolyticus isoliert werden, die an Infektionen bei Haustieren beteiligt waren (KERN u. PERRETEN 2013). In der vorliegenden Studie wurden sie allerdings nur aus Umgebungsproben isoliert. Ungeachtet der Tatsache, dass methicillinresistente S. haemolyticus die dritthäufigste Gruppe Krankenhaus-assoziierter Staphylokokkenspezies darstellen, sind zum jetzigen Zeitpunkt keine weiteren sequenzbasierten Typisierungsmethoden für S. haemolyticus verfügbar. In dieser Studie wurde zusätzlich die dru Typisierung verwendet, die für alle MRS verwendet werden kann, und ergab neben dem bekannten dru Typ dt11c auch den neuen dru Typ dt5i.
Unter den MRCoNS wurden auch zwei methicillinresistente S. pettenkoferi identifiziert, die vom Boxenboden (Isolat 60) sowie Futter- und Wassernapf (Isolat 61) einer belegten Box stammten. Bei der Katze selbst wurde ein MRSA CC398-Isolat (CC398-Isolat 49) identifiziert. Die Entdeckung dieser recht neuen CoNS-Spezies wurde 2002 durch TRÜLZSCH und Kollegen publiziert, die S. pettenkoferi aus unterschiedlichen Proben (Wundtupfer, Blutkultur) eines humanen Patienten mit klinischer Infektion isolieren konnten. Auch in der vorliegenden Studie waren diese Staphylokokken mit dem verwendeten, kommerziellen, biochemischen Testkit ID32 STAPH nicht identifizierbar. Die 16S rDNA-Sequenzierung ergab allerdings eine vollständige Übereinstimmung zu der in der NCBI-Datenbank hinterlegten Sequenz von S. pettenkoferi. Obwohl wenige Fallberichte zu nosokomialen Infektionen mit methicillinresistenten S. pettenkoferi in der Humanmedizin existieren (SONG et al.
2009), wurde das Auftreten von methicillinresistenten S. pettenkoferi im veterinärmedizinischen Bereich noch nicht berichtet. In den wenigen, beschriebenen Fällen waren die humanen Patienten deutlich immunsupprimiert, häufig lagen mehrere Erkrankungen gleichzeitig vor. In der vorliegenden Studie wurden
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methicillinresistente S. pettenkoferi aus Umgebungsproben isoliert. Ob dies als Zufallsbefund anzusehen ist oder ob methicillinresistente S. pettenkoferi auch in der Veterinärmedizin zukünftig eine Rolle spielen könnten, bleibt zu beobachten.
4.3 Analyse des neuartigen Multi-Resistenzplasmids pSWS47
Plasmide spielen eine zentrale Rolle im horizontalen Gentransfer und somit in der Verbreitung von Resistenzgenen. Außerdem können sie als Vektoren für Transposon-assoziierte Resistenzgene fungieren (SCHWARZ et al. 2011). Kleinere, häufig vollständig sequenzierte Plasmide, die über ein einzelnes Resistenzgen verfügen, sind in den Staphylokokkenpopulationen weit verbreitet (SCHWARZ et al.
2011). Auf größeren Plasmiden können mehrere Resistenzgene liegen und häufig findet man in deren genetischer Umgebung Sequenzen aus bereits bekannten kleineren Plasmiden (SCHWARZ et al. 2011). Die Sequenzierung von Resistenzplasmiden kann Aufschluss über Entstehungsmechanismen und Resistenzausbreitung liefern. Alle MRS-Isolate wurden in dieser Studie auf ihren Plasmidgehalt untersucht. Neben einigen Isolaten mit kleineren Plasmiden fielen einige MRSE-Isolate durch größere Plasmide auf, darunter auch der MRSE-Klon, der aus neun Proben isoliert wurde. Das größte Plasmid dieses Klons wurde komplett sequenziert. Die nun vorliegende, 28.743 Basenpaare (bp) umfassende Sequenz des Multi-Resistenzplasmids pSWS47 aus dem felinen MRSE-Isolat 47 trägt fünf intakte Resistenzgene, die einen entsprechenden Resistenzphänotyp vermitteln.
Hinzu kommt ein inaktives Resistenzgen.
Das Resistenzgen vga(A) kodiert für einen ABC-Transporter und vermittelt durch aktiven Efflux Resistenz gegenüber Lincosamiden, Pleuromutilinen und Streptogramin A Antibiotika. Es wurde als auf Plasmiden oder dem Transposon Tn5406 lokalisiert beschrieben. Bei pSWS47 liegt eine Sequenzübereinstimmung von 100% auf einer Länge von 2166 bp mit den vga(A)-tragenden Resistenzplasmiden pUR4128 (7500 bp Gesamtgröße) und pUR2355 (7600 bp Gesamtgröße) vor, die in MRSE und MRSA humanen und animalen Ursprungs detektiert wurden (LOZANO et al. 2012). MENDES und Kollegen (2011)
Diskussion 4
identifizierten ein etwa 24 Kilobasenpaare (kb) großes vga(A)-tragendes Plasmid aus einem MRSA CC398 von Schweinen und einem Mitarbeiter desselben Betriebs.
Auch auf dem kleinen Plasmid pCPS32 aus einem weiteren MRSA CC398 Isolat porcinen Ursprungs konnte vga(A) detektiert werden (KADLEC et al. 2010b). Dieses Plasmid weist eine hohe, strukturelle Ähnlichkeit zum vga(A)-tragenden Plasmid pVGA aus MRSA humanen Ursprungs auf (Sequenzidentität 99,9%), was auf einen Austausch dieses Plasmids hindeutet (GENTRY et al. 2008, KADLEC et al. 2010b).
Die Pleuromutiline Tiamulin und Valnemulin finden in Deutschland vor allem bei Schweinen und Geflügel Anwendung. Durch die Streptogramin A-Resistenz werden in der Empfindlichkeitsprüfung intermediäre Hemmkonzentrationen für das Streptogramin A/B-Gemisch Quinupristin/Dalfopristin erreicht. Diese Wirkstoffkombination wird in der Humanmedizin zur Therapie von Infektionen mit vancomycinresistenten Enterokokken eingesetzt (ALLINGTON u. RIVEY 2001).
Das Resistenzgen aadD kodiert für eine Adenyltransferase, die die Aminoglykoside Kanamycin, Neomycin und Tobramycin inaktiviert. Es ist unter Staphylokokken weit verbreitet und kann sowohl chromosomal als auch plasmidlokalisiert sein (SCHWARZ et al. 2011, WENDLANDT et al. 2013b). Transformanden mit pSWS47 zeigten nur leicht erhöhte minimale Hemmkonzentrationen (MHKs) für die Wirkstoffe Neomycin und Tobramycin und keinen nennenswerten Anstieg bei Kanamycin im Vergleich zum leeren Empfängerstamm. Der Leserahmen von aadD bei pSWS47 ist intakt und auch die Promotorregion ist vollständig erhalten. Dieses Phänomen, wenn auch ungeklärt, wird allerdings häufiger beobachtet, zum Beispiel auch bei dem Multi-Resistenzplasmid pERGB; der durchgeführte Etest ergab in diesem Fall eine MHK von 6 mg/L für Kanamycin (RUIZ DE GOPEGUI et al. 2012).
Das Tetracyclin-Resistenzgen tet(L) kodiert für ein Effluxprotein der Major Facilitator Superfamilie (ROBERTS 2005). Zunächst bei diversen Bacillus Spezies identifiziert, wurde tet(L) auch in Staphylokokken nachgewiesen (SCHWARZ et al. 1992). Bei Staphylokokken ist tet(L) meist plasmidlokalisiert (WENDLANDT et al. 2013b). Bei pSWS47 wies die stromaufwärts von tet(L) lokalisierte, regulatorische Region eine Mutation des Startcodons mit Deletion des Leserahmens für das regulatorische Peptid auf. Dennoch konnte gezeigt werden, dass Tetracyclinresistenz durch tet(L)
4 Diskussion
vermittelt wurde. Diese Beobachtung steht im Einklang mit dem Nachweis von funktionell aktiven tet(L)-Genen bei Pasteurella multocida und Mannheimia spp., bei denen die gesamte Regulatorregion fehlte (KEHRENBERG et al. 2005).
Das Gen dfrK kodiert für eine trimethoprimresistente Dihydrofolatreduktase und wurde erstmals 2009 auf dem Plasmid pKKS2187 aus einem MRSA CC398 porciner Herkunft beschrieben (KADLEC u. SCHWARZ 2009). Das Trimethoprim-Resistenzgen dfrK, dessen Ursprung bisher unbekannt ist, wurde auch in Enterokokken gefunden (LÓPEZ et al. 2012). Bisher wurde dfrK in Staphylokokken chromosomal auf dem Transposon Tn559 und auf Plasmiden detektiert (KADLEC u.
SCHWARZ 2010, WENDLANDT et al. 2013b). Auf Plasmiden ist dfrK häufig zusammen mit tet(L) zu finden (KADLEC u. SCHWARZ 2009). Es wurde aber auch das etwa 6 kb große Plasmid pKKS966 von einem porcinen Staphylococcus hyicus subsp. hyicus komplett sequenziert und beschrieben, welches lediglich dfrK trägt (KADLEC et al. 2012b). Ein Bereich von 7107 bp von pSWS47 zeigt 99%
Sequenzidentität mit dem Multi-Resistenzplasmid pERGB, das in einem klinischen MRSA ST125 Isolat detektiert wurde (RUIZ DE GOPEGUI et al. 2012). Dieser Bereich ist von zwei Insertionssequenzen des Typs IS257 flankiert und umfasst die Resistenzgene aadD, tet(L) und dfrK sowie das Plasmidrekombinationsgen pre. Das Plasmid pERGB trägt zusätzlich das Resistenzgen cfr, welches einen Multiresistenzphänotyp gegen Oxazolidinone, Phenicole, Lincosamide, Pleuromutiline und Streptogramin A Antibiotika vermittelt (LONG et al. 2006). Es verdient besondere Beachtung, weil es das bisher einzige, transferable Resistenzgen gegen das in der Humanmedizin eingesetzte Reserveantibiotikum Linezolid ist und weil es mittlerweile nicht nur bei Isolaten diverser Staphylokokkenspezies, sondern auch bei Vertretern mehrerer anderer Gram-positiver und Gram-negativer Genera nachgewiesen wurde (WITTE u. CUNY 2011, SHEN et al. 2013). Das Resistenzgen cfr konnte allerdings in keinem der Isolate der vorliegenden Studie nachgewiesen werden.
Das Resistenzgen tet(M) kodiert für ein ribosomales Schutzprotein, vermittelt neben Tetracyclin- auch Minocyclinresistenz und ist bei Staphylokokken bis jetzt nur als Teil konjugativer Transposons (Tn), wie Tn916, in chromosomaler Lokalisation detektiert
Diskussion 4
worden. Der Nachweis eines aktiven, resistenzvermittelndem tet(M)-Gens als Teil eines verkürzten, Tn916-ähnlichen Elements auf pSWS47 stellt die Erstbeschreibung dieses Resistenzgens auf einem Plasmid bei Staphylokokken dar. Auf einer Länge von 3099 bp zeigt pSWS47 eine Sequenzidentität von 99% zum tet(M)-tragenden Plasmid pMD5057, isoliert aus Lactobacillus plantarum 5057 (DANIELSEN 2002).
Das 10.877 bp große Plasmid pMD5057 trägt neben mehreren Leserahmen unbekannter Funktion oder nicht intakter Strukturen das Resistenzgen tet(M) und ein intaktes Replikationsgen. Über die Herkunft von tet(M) und die Umstände, unter denen sich pMD5057 formierte, gibt es keine Hinweise. Tn916 oder Tn916-ähnliche Elemente finden sich außer bei Staphylokokken unter anderen auch bei Enterokokken, aus denen dieses Transposon erstmals isoliert wurde, sowie bei Clostridien, Listerien und Streptokokken (FLANNAGAN et al. 1994, ROBERTS et al.
2001).
Über einen Bereich von 10.764 bp zeigt pSWS47 99% Sequenzidentität zu pSAP016A, einem 43.807 bp großen Resistenzplasmid, isoliert aus dem humanen, klinischen S. epidermidis Isolat CDC8 (SHEARER et al. 2011). In diesem Abschnitt liegt das funktionell inaktive β-Laktam-Resistenzgen ∆blaZ. Das Plasmid pSAP016A trägt wie pSWS47 ebenfalls ein inkomplettes Tn552. Das Transposon Tn552 der
Über einen Bereich von 10.764 bp zeigt pSWS47 99% Sequenzidentität zu pSAP016A, einem 43.807 bp großen Resistenzplasmid, isoliert aus dem humanen, klinischen S. epidermidis Isolat CDC8 (SHEARER et al. 2011). In diesem Abschnitt liegt das funktionell inaktive β-Laktam-Resistenzgen ∆blaZ. Das Plasmid pSAP016A trägt wie pSWS47 ebenfalls ein inkomplettes Tn552. Das Transposon Tn552 der