III. Material und Methoden
7. Analyse biochemischer und endokrinologischer Para meter
Folgende Tabelle (Tab. 16) gibt einen Überblick über die zu untersuchenden Parameter, das Probenmaterial und die Bestimmungsmethoden.
Tab. 16: Untersuchungsparameter, Probenmaterial und Methode
Parameter Probenmaterial Methode
Ca++
7.1. Parathormon (PTH in pg/l)
Die quantitative Bestimmung des intakten PTH im Plasma erfolgte mit einem Radioimmunoassay (Allegro Intakt PTH Immunoassay System, Fa. Nickols Institute, Bad Nauheim), der für den Nachweis equinen Parathormons geeignet ist.
Messprinzip:
Bei dem Radioimmunoassay für intaktes PTH handelte es sich um einen zweiseitigen immuno-radiometrischen Assay zur Bestimmung der biologisch intakten 84 Aminosäurenketten des PTHs. Es wurden zwei polyklonale Antikörper aus der Ziege verwendet, die für verschiedene Bereiche des intakten Moleküls spezifisch sind. Ein
radioaktiv markierte Antikörper bindet das N-terminale PTH 1-34. Die PTH enthaltende Probe wird gleichzeitig mit einer antikörperbeschichteten Kugel und 125Jod-markierten Antikörper inkubiert. Das in der Probe vorhandene PTH wird von beiden Antiköpern zu einem „Sandwich-Komplex“ gebunden:
Kugel Anti-PTH (39-84) Intaktes PTH (1-84) 125J Anti-PTH(1-34)
Dieser „Sandwich-Komplex”, der für den Nachweis notwendig ist, wird nur mit intaktem PTH gebildet.
Am Ende der Inkubation wurde die Kugel gewaschen, um die nicht gebundenen Komponenten zu entfernen. Die auf der festen Phase gebundene Radioaktivität wurde in einem Gammazähler gemessen und ist direkt proportional zu der in der Probe vorhandenen Menge an intaktem PTH.
Durchführung des Assays:
Je 200 µl der Plasmaproben, testeigenen Kontrollen und Standards und 100 µl 125 J-PTH-Antikörperlösung wurden in Polypropylenröhrchen pipettiert. In jedes Röhrchen wurde eine Antikörper beschichtete Kugel hinzugefügt und anschließend für 22 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Kugeln zweimal gewaschen, indem 2 ml Waschlösung in die Röhrchen gegeben und dann die Flüssigkeit abgesaugt wurde. Jedes Teströhrchen wurde im Gamma-Szintillationzähler für eine Minute gezählt.
Auswertung des Assays:
Die Standardkurve wurde unter Verwendung gebrauchsfertiger PTH Standards erstellt. Von den Doppelwerten der Standards wurden die Mittelwerte der Zählungen pro Minute (CPM) berechnet und der CPM-Mittelwert des Nullstandard-Röhrchens davon subtrahiert. Die CPM jedes Standards wurden gegen die Standardkonzentration aufgetragen und so die Standardkurve erstellt. Aus dieser Standardkurve konnten anschließend die Konzentrationen der Proben extrapoliert werden.
7.2. Osteocalcin (ng/ml)
Die quantitative Bestimmung des intakten Osteocalcins im Plasma erfolgte mit einem kompetitiven Enzymimmunoassay (NovoCalcin-Kit, Fa. Metra Biosystems, Osnabrück).
Messprinzip:
Bei dem Enzymimmunoassay konkurrieren das auf der Festphase (Kavitäten und Strips) gebundene Osteocalcin und das Osteocalcin der Proben, Standards und Kontrollen um die Bindungsstellen, der im Unterschuss vorliegenden monoklonalen Osteocalcin- Antikörper. Ein mit alkalischer Phosphatase markierter Sekundärantikörper (Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörper) wurde nach einem Waschschritt, der die ungebundenen Reaktionspartner entfernt, zugegeben und bindet sich spezifisch an die gebundenen Osteocalcin-Antikörper. Nach Zugabe von p-Nitrophenyl-Phosphat wird das an die Antikörper gekoppelte Enzym (alkalische Phosphatase) zu einem farbigen Endprodukt umgesetzt. Nach Abbruch der enzymatischen Reaktion durch Zugabe einer Stopplösung erfolgt die Messung der Enzymaktivität im Enzymimmunoassay-Reader bei einer Wellenlänge von 450 nm, wobei die gemessene optische Dichte zur Konzentration an Osteocalcin indirekt proportional war. Der in diesem Assay eingesetzte monoklonale Antikörper erkennt spezifisch nur intaktes Osteocalcin, nicht aber Fragmente.
Durchführung der Assays:
Je 25 µl der Plasmaproben (1:4 Verdünnung), testeigenen Kontrollen und Standards und jeweils 125 µl Osteocalcin- Antikörperlösung wurden in die entsprechende Kavität pipettiert und für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde dreimal mit je 300 µl verdünnter Waschlösung gewaschen und diese zum Entfernen der Flüssigkeit ausgeschlagen.
Nach Zugabe von 150 µl Enzym-Konjugatlösung wurde eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einem erneuten Waschschritt wurde jeweils 150 µl Substratlösung in jede Kavität gegeben und für 30 Minuten inkubiert. Danach wurde in jede Kavität 50 µl Stopplösung pipettiert und innerhalb von 30 Minuten bei einer optischen Dichte von 405 nm die Enzymaktivität im Enzymimmunoassay-Reader gemessen.
Auswertung der Assays:
Zur Auswertung des Assays wurden die bei 405 nm gemessenen optischen Dichten (linear) gegen die Osteocalcin-Konzentration (logarithmisch) aufgetragen. Mit Hilfe von sechs Osteocalcin-Standards wurde eine Standardkurve erstellt. Die optische Dichte der Proben wurden durch die optische Dichte des Nullstandards dividiert und die prozentuale Bindung gegen die Konzentrationen (logarithmisch) aufgetragen, so dass die Osteocalcin-Konzentrationen der Proben abgelesen werden konnten.
7.3. Carboxyterminales Telopeptid des Typ-I-Collagen (ICTP µg/l)
Die quantitative Bestimmung des ICTP im Plasma erfolgte mit einem Radioimmunoassay (ICTP-RIA. Fa. Orion Diagnostica, Espoo, Finnland).
Messprinzip:
Bei dem Radioimmunoassay handelte es sich um einen einseitigen kompetetiven Assay, bei dem 125J-markiertes ICTP mit dem ICTP der Probe um Bindungsstellen des ICTP-binden Antikörpers konkurriert. Zum Nachweis des gebunden 125J markierten ICTP diente ein proteinfällender zweiter Antikörper. Der ICTP-Gehalt in der Probe war umgekehrt proportional zu der Radioaktivität des Niederschlages.
Durchführung des Assays:
Je 10 µl der Plasmaproben, testeigenen Kontrollen und Standards, 200 µl ICTP-Antiserum und 200 µl 125J-markiertes ICTP wurden in Polypropylenröhrchen pipettiert und für zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Eine Separationslösung bestehend aus dem zweiten Antikörper wurde zugegeben und die Röhrchen bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert und anschließend für 30 Minuten bei 3000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde aspiriert und verworfen. Das Sediment wurde im Gamma-Szintillationszähler für eine Minute gezählt.
Auswertung der Assays:
Mit Hilfe von sechs gebrauchsfertigen ICTP Standards wurde eine Standardkurve erstellt, an der die ICTP-Gehalte der Proben abgelesen werden konnten. Von den Doppelwerten der Standards wurden Mittelwerte berechnet und um die Zählrate der unspezifischen Bindung korrigiert. Im Verhältnis zur Negativkontrolle wurde aus den Mittelwerten die prozentuale Bindungsrate jeder einzelnen Standardkonzentration berechnet. Dabei wurde die
Reaktionsrate der Negativkontrolle mit 100% eingesetzt. Die prozentuale Bindung wurde gegen die Konzentration jeder Standardkonzentration aufgetragen und mittels Regressionsgleichung im Näherungsverfahren als Kurve dargestellt.
Aus dieser Standardkurve konnten anschließend die Konzentrationen der Proben extrapoliert werden.
7.4. Carboxyterminales Propeptid vom Typ-I-Collagen (PICP µg/l)
Die quantitative Bestimmung des PICP im Plasma erfolgte mit einem Radioimmunoassay (Orion Diagnostica PICP kit).
Messprinzip:
Bei dem Radioimmunassay für PICP handelt es sich um einen einseitig kompetitiven Assay.
125Jod-markiertes PICP konkurriert dabei mit dem PICP aus der Probe um die Bindungsstellen eines PICP-bindenden Antikörpers. Anschließend werden die restlichen freien Antikörper von den Antigen-Antikörperkomplexen getrennt und deren Radioaktivität bestimmt. Der Betrag der radioaktiven Antigene in den Antigen-Antikörperkomplexen ist umgekehrt proportional zu dem in der Probe enthaltenden PICP.
Durchführung der Assays:
Je 100 µl der Plasmaproben, testeigenen Kontrollen und Standards, 200 µl PICP Ant iserum und 200 µl 125Jod-markiertes PICP wurden in Polypropylenröhrchen pipettiert und für zwei Stunden bei 37 °C inkubiert. Nach Zugabe einer aus dem zweiten Antikörper bestehenden Separationslösung wurden die Röhrchen für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend für 15 Minuten bei 3000 g zentrifugiert. Danach erfolgte für eine Minute die Zählung der Radioaktivität im Sediment mit Hilfe eines Gammazählers.
Auswertung der Assays:
Mit Hilfe von fünf gebrauchsfertigen PICP-Standards erfolgte die Erstellung einer Standardkurve.
Hierzu wurde der Mittelwert der nichtspezifischen Bindungen ermittelt und anschließend von den Werten aller Standards und den Werten der Proben subtrahiert. Dieser Wert wurde mit 100 multipliziert und ins Verhältnis zum korrigierten Mittelwert der Null-Standartprobe
gegen die Konzentration der Standards aufgetragen und mittels Regressionsgleichung im Näherungsverfahren als Kurve dargestellt.
7.5. pH Wert
Der pH-Wert wurde mit einer ionensensitiven Elektrode gemessen (ISE-Analyzer 987-S; FA:
AVL, Bad Homburg).
7.6. Lactat (mmol/l)
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Die Lactatmessung in mmol / l erfolgte mit Hilfe eines enzymatischen Verfahrens (LOD-PAP-Methode), dabei wird Lactat mit Hilfe von Lactatoxidase in Pyruvat und H2O2
umgewandelt. H2O2 reagiert mit 4-Aminophenazon und 4-Chlorphenol und es entsteht unter Vermittlung von einer Peroxidase (POD) Chinoniminfarbstoff. Mit einem Photometer (Diaglobal Lactat-Photometer, Fa. Dr. Lange GmbH, mit einprogrammierten Berechnungsformeln) wurde die optische Dichte der Lösung bei einer Messwellenlänge von 520 nm bestimmt und daraus die Lactatkonzentration rechnerisch ermittelt.
Als Probenmaterial wurde venöses Vollblut benutzt, welches sofort in Einzelküvetten pipettiert wurde. In den Einzelküvetten war eine Pufferlösung (4-Chlorphenol 1,8 mmol/l, Natriumazid < 0,1%, PIPES-Puffer 20 mmol/l) vorpipettiert. Von dieser Lösung wurde im Photometer die Extinktion bestimmt, anschließend wurde die Startreagenz (Lactatoxidase (LOD) >450 U/l, Peroxidase (POD) >750 U/l, 4-Aminophenazon 0,23 mmol/l) hinzugegeben und wiederum im Photometer gemessen.
7.7. Ionisiertes Kalzium (Ca++ mmol/l)
Die Konzentration des ionisierten Kalziums wurde im Vollblut mit einer ionensensitiven Elektrode gemessen (ISE Analyzer 987-S, Fa. AVL, Bad Homburg). Da die Konzentration des ionisierten Kalziums pH-abhängig ist, wurde der pH-Wert zur Normierung der Kalziumwerte gleichzeitig mit dem ISE-Analyzer bestimmt und die Konzentration des ionisierten Kalziums (Ca korr) angegeben und nach folgender Formel auf den pH-Wert 7,4 korrigiert:
Ca++korr = Ca++gem x 100,22 x ( pH – 7,4 )
Ca++gem = Ca gemessen im Vollblut Ca++korr = Ca korrigiert auf pH 7,4 7.8. Gesamtkalzium (mmol/l)
Das Gesamtkalzium wurde im Plasma mittels Atomabsorptionsspektroskopie (Unicam Solar 969, Fa. Unicam, Offenbach) nach der Methode von SLAVIN (1968) bestimmt. Die Probenlösung wurde verascht und fein zerstäubt durch eine Acetylen-Luft-Flamme gesaugt.
Dadurch wurden die enthaltenen Elemente in den atomaren Zustand überführt.
Atome absorbieren jeweils die Strahlen einer bestimmten, charakteristischen Wellenlänge, so dass die Extinktion proportional zur Konzentration des Elementes in der Lösung ist.
Die Empfindlichkeit der Methode wird durch den Einsatz von spezifischen Hohlkathodenlampen erzielt, die Strahlung in einem engen Wellenbereich aussenden. Die Kathode dieser Lampe enthält jeweils das zu messende Element, so dass ein charakteristisches Linienspektrum, aus dem die Resonanzlinie hervorragt, ausgesendet.
7.9. Anorganisches Phosphat (mmol/l)
Das anorganische Phosphat wurde im Lithium- Heparin-Plasma mit einem UV Test für Phosphat (PHOS, scill animal care company GmbH, Viernheim) gemessen.
Dieser Test basiert auf der Methode der Molybdat-Reaktion, in diesem Fall bindet anorganisches Phosphat in schwefelsaurer Lösung einen Ammonium-Phosphomolybdat-Komplex.
Es wurde aus 20 µl destilliertem Wasser und 1000 µl der Reagenz (Mischung 7:3 aus gebrauchsfertiger Leerwertreagenz und gebrauchsfertiger Phosphatreagenz) ein Reagenzienleerwert ermittelt. Aus 20 µl eines mitgelieferten und gebrauchsfertigen Kalibrator und 1000 µl der Reagenz wurde ein Standard hergestellt. Zur Messung des Phosphatgehaltes wurden dann 20 µl Plasma mit 1000 µl Reagenz gemischt.
Die optischen Dichten dieser Lösungen wurden in einem Photometer (UV – 1602) bei 340 nm und einer Inkubationstemperatur 20-37 °C bestimmt. Es wurden Küvetten mit einer Schichtdicke von 1 cm verwendet.
Anschließend wurde der Gehalt anorganischen Phosphates (C P r) mit folgender Formel in mmol/l berechnet:
E P r – E RL
C Pr = CStd x --- E Kalib –E RL
C Stdx = Konzentration Standard, E P r = Extinktion Probe, E Std = Extinktion Standard, E Lw = Extinktion Leerwert, CP r = Konzentration der Probe
7.10. Gesamteiweiß
Die Bestimmung des Gesamteiweiß erfolgte mit Hilfe eines Handrefraktometers (Fa.
Clinical).
7.11. Herzfrequenz und Laktat
Die Ermittlung und Auswertung der Herzfrequenz- und Lactatdaten waren Gegenstand von zwei parallel zu dieser Arbeit angefertigten Dissertationen unter der Betreuung von Herrn Prof. Dr. Ellendorf Mariensee. Die Werte der Anreitphase wurde von Frau Angela Hellmold in ihrer Dissertation mit dem Titel: Aufbautraining von Vielseitigkeitspferden erfasst. Die folgenden zwei Trainingsabschnitte wurden von Herrn Michael Dahlkamp in seiner Dissertation zum Ausdauertraining mit Vielseitigkeitspferden dokumentiert