2 Ergebnisse
2.2 Zusammenfassung der Ergebnisse
2.2.1 Allgemeine Kriterien für die durchgeführten Untersuchungen
Das Kernstück dieser Dissertation bilden die in den sechs beigefügten Artikeln publizierten Ergebnisse, die die retrospektiven Querschnittsanalysen zusammenfassen.
Der Schwerpunkt der Arbeiten wurde unter der Verwendung eines Frischgewebe-Archivs von Tumor- und ggf. gepaarten Normalgewebsproben durchgeführt. Da die zur Verfügung stehenden Kohorten histologisch heterogen waren, wurden genspezifisch, je nach Fragestellung, an Probenanzahl und klinischen Eigenschaften leicht variierende Tumorsubgruppen untersucht (s. Tabelle 2).
Im Vorfeld wurden Methylierungs- bzw. Expressionsanalysen der untersuchten Loci an einer Auswahl der Zelllinien, die als repräsentative Modelle für normale Gewebszellen und Tumore des Urogenitaltrakts oder gynäkologische Tumoren eingesetzt wurden, durchgeführt (s.
Tabelle 2).
Der Nachweis der DNA-Methylierung wurde mit Hilfe der QMSP ausgeführt. Ein für einige Loci insgesamt relativ niedriger gemessener Methylierungslevel in den untersuchten Geweben wäre eventuell auf die Eigenart der QMSP-Methode zurückzuführen. Die niedrige Methylierungswerte können nicht durch die Heterogenität der Zelltypen, die in dem untersuchten Tumorgewebe enthalten waren, erklärt werden, da ein Tumorzellgehalt von ≥ 50
% histopathologisch gesichert wurde. Da methodenbedingt nur einheitlich hoch und dicht methylierte Regionen erfasst werden, würden beispielsweise das Vorliegen der intra-CGI-Heterogenität103 bzw. die Existenz lediglich einer kleineren Subpopulation von Tumorzellen, die an diesem Locus dicht methyliert sind, als Erklärung für niedrige Werte in Frage kommen.
Diese Überlegung ist für alle mit QMSP untersuchten Gene gültig.
Als zusätzliche Technik zu den QMSP-Analysen wurden gegebenfalls sogenannte Pyrosequenzierungen durchgeführt. Für die Publikationen Nr. 2 und 6 wurden außerdem quantitative Echtzeit-PCR-Analysen (RT-PCR) zum Nachweis der mRNA durchgeführt. Für einen Marker (Publikation Nr. 6) wurden außerdem initiale funktionelle Untersuchungen unter der Verwendung verschiedener Tumorzelllinien der Niere durchgeführt.
Bei den statistischen Untersuchungen wurden im Allgemeinen folgende Verfahren angewendet.
74 Zum Vergleich der mittleren relativen DNA-Methylierungen bzw. mRNA-Expressionslevel gepaarter Tumorgewebsproben und korrespondierender peritumoraler Gewebe wurden gepaarte t-Tests durchgeführt. Die Assoziationen zwischen mittleren relativen DNA-Methylierungen bzw. mRNA-Expressionslevel und klinisch-pathologischen Parametern wurden mit Hilfe univariater logistischer Regressionsanalysen untersucht, die sowohl den statistischen Signifikanzwert (p-Wert) als auch eine Odds Ratio (OR) lieferten, welche als Maß für die beobachteten Effektgrößen diente.
Bei vielen klinischen Studien über die Wirksamkeit des zu testenden Therapeutikums definiert der Begriff progressionsfreies Überleben (PFS) den primären oder sekundären Endpunkt und fließt somit in die Auswertung der Studien ein135. In der Praxis ist die Kenntnis über das PFS einer der wichtigen Faktoren bei den Therapieentscheidungen. Die Assoziationen der mittleren relativen DNA-Methylierungen bzw. mRNA-Expressionslevel mit progressionsfreiem Überleben wurden mit Hilfe des univariaten Cox-Regressionsmodells (Cox proportional hazards regression - en.) bzw. Kaplan-Meier-Überlebensanalysen (Kaplan-Meier survival analysis – en.) untersucht.
Teilweise wurden zusätzlich paarweise gestaltete bivariate Cox-Regressionsanalysen als Simulation der multivariaten Analysen, die aufgrund der begrenzten Kohortengrößen nicht kalkulierbar waren, durchgeführt.
Die Assoziationen der mittleren relativen DNA-Methylierungen mit dem Therapieverlauf wurden mit Hilfe von Kaplan-Meier-Überlebensanalysen und dem Logrank-Test untersucht.
Um die mittleren relativen DNA-Methylierungen und mRNA-Expressionslevel zu vergleichen, wurden Pearson-Korrelationsanalysen durchgeführt.
Für die statistischen Analysen wurde statistische Software R 2.15.2 verwendet.
Mit dem Anliegen der Leserfreundlichkeit und Vermeidung vieler Wiederholungen bei der Beschreibung der Ziele, Gestaltung der Experimenten und Ergebnisse wurden im Folgenden die relevanten Daten über die jeweilige Experiment-Konzeption sowie die Ergebnisse zur besseren Übersicht in vier Tabellen (Nr. 2-5) zusammengefasst.
Die schriftliche Kurzbeschreibung der Ergebnisse ist in drei Unterthemen gegliedert:
- „Ergebnisse funktioneller Analysen“ - Ergebnisse aus den funktionellen Untersuchungen (Publikations-Nr. 6);
- „Deskriptive Ergebnisse“ - Ergebnisse die der beschreibenden Tumorbiologie der Nierenzelltumore zuzuordnen sind (Publikations-Nr. 1-3, 5, 6);
75
-„TranslationaleErgebnisse“- Ergebnisse aus Untersuchungen von Markern auf deren prognostische oder prädiktive Relevanz (Publikations-Nr. 1-6). Tabelle 2. Übersicht über das experimentelle Design der zentralen Untersuchungen.
Gen Analyseebene Messverfahren
primär gesamt
Niere Prostata Blase Brust Sonstige RCC1 ccRCC2 mRCC3 Therapie4
1 Hsa-mir-124-3 2 6 3 4 8 0 111 80 25 - 77 CpG-Methylierung QMSP
2 GATA5 - - - - - - 135 77 21 - 58 mRNA-Expression qRT-PCR
3 GATA3 3 6 3 7 8 1 119 86 27 - 87 CpG-Methylierung QMSP
GATA5 3 6 3 7 8 1 119 86 27 - 87 CpG-Methylierung QMSP
4 MIR124-3 - - - - - - 18 16 - 18 - CpG-Methylierung QMSP
MIR9-4 - - - - - - 18 16 - 18 - CpG-Methylierung QMSP
CST6 - - - - - - 18 16 - 18 - CpG-Methylierung QMSP
LAD1 - - - - - - 18 16 - 18 - CpG-Methylierung QMSP
5 NEFH 3 6 3 7 8 2 132 82 26 18 83 CpG-Methylierung QMSP
6 CRHBP 2 6 3 6 - - - 86 22 - 66 CpG-Methylierung QMSP /
Pyrosequenzierung
- 4 - - - - - - - - - CpG-Methylierung/
mRNA-Expression/
QMSP / qRT-PCR
- 1 - - - - - - - -
CpG-Methylierung/
mRNA-Expression/
Proliferations- und Invasionsverhalten
QMSP / qRT-PCR
RT-Impedanz-Messungen RCC1 renal cell carcinoma
ccRCC2 clear cell renal cell carcinoma mRCC3 metastatic renal cell carcinoma
Therapie4 Subgruppe der Patienten die einer Erstlinien VEGF-Therapie unterzogen wurden - keine Messungen / Analysen durchgeführt
Publikation-Nr.
Zelllinien (n)
tumoral Subgruppen
Gewebskohorten (n)
korresp.
peritumorales Gewebe (n)
76 2.2.2 Ergebnisse funktioneller Analysen.
In den renalen Tumorzellinien ACHN, A498, RCC-GS und RCC-HS wurde mittels 5-Aza-2`-Deoxycytidin eine unspezifische Reexpression induziert. Anschließend wurden die DNA-Methylierung und mRNA-Level quantifiziert. Es wurde eine inverse Beziehung zwischen DNA-Methylierung und dem mRNA-Level des CRHBP (human corticotrophin releasing factor-binding protein) festgestellt. Die Reduktion der relativen Methylierung ging mit 50-150-facher Erhöhung des mRNA-Expressionslevel einher.
Es wurde eine Charakterisierung des Proliferations- und Invasionsverhaltens der RCC-GS-Zelllinie mittels spezifischer siRNA-Genstillegung (Small interfering RNA) durchgeführt.
Abhängig von der angesetzten Konzentration des 5-Aza-2`-Deoxycytidin (Substanz für die dem siRNA-Experiment vorausgehenden unspezifischen Demethylierung) wurden gegenteilige Effekte beobachtet. Verglichen mit den 5-Aza-2`-Deoxycytidin demethylierten und nicht mit der siRNA behandelten Kontrollen haben die mit der höheren 5-Aza2`-Deoxycytidin-Konzentration (0.5µM) behandelten und mit der siRNA-transfizierten Zellen ein invasiveres Verhalten gezeigt. Für die transfizierten Zellen die mit der niedrigeren Konzentration des Demethylierungsreagenz (0.125µM) vorbehandelt wurden ergab sich ein umgekehrtes Bild.
2.2.3 Deskriptive Ergebnisse.
Zelluläre Modelle. Relative DNA-Methylierung wurde für Genloci in MIR124-3, NEFH (Neurofilament Heavy Chain), GATA3 (GATA Binding Protein 3) und GATA5 mittels QMSP und für das CRHBP-Genlocus als globaler Methylierungsgrad mittels Pyrosequenzierung an den zellulären Modellen verschiedener Tumorentitäten und Primärzellen gemessen.
Während die untersuchten Genregionen in primären Zellen niedrige oder nicht nachweisbare Methylierung zeigten, wiesen die meisten renalen Tumorzelllinien (je nach Gen in 67-100 % der Zelllinien) eine teilweise hohe relative Methylierung auf.
Gewebskohorten. (s. Tabelle 3.) Die Angaben zu den Probenzahlen finden sich in Tabelle 2 und die berechneten statistischen Werte zu den jeweiligen Aussagen in Tabelle 3. Die relative Methylierung der Genloci MIR124-3, GATA3, GATA5, CRHBP und NEFH und der
mRNA-77 Expressionslevel der Gene GATA3, GATA5 und CRHBP wurden für die Kohorten der RCC-Tumorgewebsproben (weiter in Text TUs abgekürzt) und korrespondierende peritumorale Geweben (weiter in Text PTs abgekürzt) verglichen. Teilweise wurden Tumorsubgruppen mit den PTs bzw. unter einander verglichen. Für die ausgewählten CpG-Loci in den Genen GATA5 und CRHBP wurden DNA-Methylierungen und mRNA-Expressionen verglichen.
RCC-Gruppe. Eine statistisch signifikante tumorspezifische Hypermethylierung wurde für die Gene MIR124-3, GATA3, GATA5, CRHBP und NEFH beim Vergleich des gesamten RCC-Kollektivs mit dem PTs gezeigt.
ccRCC-Subgruppe. Statistisch signifikante tumorspezifische Hypermethylierungen für die Gene MIR124-3, GATA3, und GATA5 wurden beim Vergleich der ccRCC-Subgruppe mit dem PTs gezeigt. Für die Genloci MIR124-3, GATA3, GATA5 und NEFH wurde auch eine signifikant höhere relative Methylierung in den ccRCC-Subgruppe verglichen mit der papRCC-Subgruppe gezeigt.
Die mRNA-Expression in den ccRCCs wurde für GATA5 signifikant reduziert, vergleichen mit den Normalgeweben, gezeigt.
Ergänzender Vergleich der Methylierung- und Expressionsdaten für GATA5 und CRHBP zeigte inverse Korrelationen zwischen den beiden molekularen Ebenen.
78
Tabelle 3. Eine Übersicht der wichtigsten beschreibenden Ergebnisse zur Tumorbiologie der Nierenzelltumore. Zusammengefasst nach Genen, Kohorten und Analyseebenen.
mRNA -Expression
RCC1 vs. PTs2 ccRCC3 vs. papRCC4 ccRCC3 vs. PTs2
MIR124-3 p-Wert <0.0001* <0.0001* 0.026** <0.011* -
-Aussage hypermethyliert in RCC hypermethyliert in ccRCC schwache Assoziation
mit Tumorentwicklung höher methyliert in ccRCC -
-GATA3 p-Wert 0.006* 0.001* - 0.006* -
-Aussage hypermethyliert in RCC hypermethyliert in ccRCC - höher methyliert in ccRCC -
-GATA5 p-Wert <0.001* <0.001* - 0.015* <0.001* <0.001***
Aussage hypermethyliert in RCC hypermethyliert in ccRCC - höher methyliert in ccRCC reduzierter
mRNA-Level in ccRCC inverse Korrelation
NEFH p-Wert <0.001 - - 0.027* -
-Aussage hypermethyliert in RCC - - höher methyliert in ccRCC -
-CRHBP p-Wert <1x10-12* - - - - <2.7x 10-12***
Aussage hypermethyliert in RCC - - - - inverse Korrelation
RCC1 renal cell carcinoma * gepaarter t-Test (gepaarte Proben, wenn nicht anders kennzeichnet) PTs2 Kohorte korrespondierender peritumoraler Gewebe ** Pearson´s Korrelationsanalyse gepaarter Proben
ccRCC3 clear cell renal cell carcinoma *** Regressionsanalyse
papRCC4 papillary renal cell carcinoma - Keine Messungen/Analysen durchgeführt bzw. keine Angaben mRNA-Expression Vergleich innerhalb der ccRCC-Subgruppe
vs. relative Methylierung5
relative DNA-Methylierung
mRNA-Expression vs.
relative Methylierung5
Kohortenvergleich ccRCC3 vs. PTs2
Analyseebene
79 2.2.4 Translationale Ergebnisse.
Mit der Prognose assoziierte Ergebnisse.
Die Einzelwerte zu den jeweiligen Aussagen über die Signifikanz sind in Tabelle 4 aufgeführt.
Relative Methylierungen von Genloci MIR124-3, GATA3, GATA5, NEFH und CRHBP waren signifikant mit klinisch-pathologischen Parametern wie Metastasenstatus (p-Werte variierten zwischen <0.0001 und 0.005) und lokalisierte / fortgeschrittene Krankheit (p-Werte variierten zwischen <0.001-0.024) assoziiert.
Des Weiteren wurde für MIR124-3, GATA5 und NEFH eine Assoziation mit dem Tumorgrad (p-Werte: 0.0063-0.012) gezeigt.
Nur der GATA5-Genlocus war mit Lymphknotenstatus (p-Wert = 0.03) schwach assoziiert.
Für alle weiteren Parameter konnte keine signifikante Assoziation mit den relativen Methylierungen gezeigt werden.
Es konnte keine Assoziationen des mRNA-Expressionslevels des GATA5-Gens mit klinisch-pathologischen Parametern, außer mit dem Tumordiameter (P=0.02), gezeigt werden.
Die Assoziationen mit progressionsfreiem Überleben wurden in univariaten Cox-Regressionsanalysen mit den relativen Methylierungen für die Genloci MIR124-3, GATA5 und NEFH gezeigt. Die Hazard Ratios betrugen dabei 9.4, 13.0 und 8.6. Bei den gepaarten bivariaten Cox-Regressionsanalysen wurden die relativen Methylierungen dieser drei Genloci als statistisch unabhängige prognostische Faktoren, die mit der PFS stark assoziiert sind, gezeigt.
Eine signifikante Assoziation des reduzierten mRNA-Expressionslevel des GATA5-Gens mit verkürztem PFS wurde in univariaten Cox-Regressionsanalysen gezeigt. Eine Assoziation des mRNA-Expressionslevel mit verkürztem PFS wurde bei gepaarten bivariaten Cox-Regressionsanalysen für die Parameter Geschlecht, Alter und Lymphknotenstatus gezeigt.
80 Tabelle 4. Eine Übersicht der wichtigsten prognose-assoziierten Ergebnisse.
Zusammengefasst nach Genen, Analyseparametern und statistischen Verfahren.
Assoziation mit klinikopath.
Parametern
*
p-Wert p-Wert HR p-Wert HR
Hsa-mir-124-3
relative Methylierung - 0.0005 9.73 -
-Geschlecht - 0.2080 2.11 0.0004 10,90
Alter - 0.7058 0,82 0.0005 18,20
Metastasen <0.0010 0.0032 4.86 0.0003 13
Lymphknoten 0.2253 0.8751 1.18 -
-Lok/Adv <0.0001 0.0260 4,28 0.0081 5.87
Grad 0.0063 - - -
-Diameter 0.0620 0.4278 1.67 0.0006 18.20
GATA3
relative Methylierung - <0.001 13.0 -
-Geschlecht - - - -
-Alter - 0.362 0.59 <0.001 29.7
Metastasen <0.001 0.012 4.07 <0.001 19.3
Lymphknoten 0.03 - - -
-Lok/Adv <0.001 0.061 3.44 0.002 9.55
Grad 0.003 0.001 8.46 0.04 5.35
mRNA-Expression - 0.023 0.25 -
-Geschlecht: n. s. 0,489 1.510 0.023 0.25
Alter: n. s. 0.155 0.420 0.035 0.27
Metastasen: n. s. 0.009 4.27 0.113 0.370
Lymphknoten n. s. 0.398 1.20 0.032 0.26
Lok/Adv n. s. 0.03 4.18 0.137 0.390
Grad n. s. <0.001 9.48 0.511 0.640
Diameter 0.02 - - -
NEFH
relative Methylierung - <0.001 8.61 -
-Geschlecht - 0.187 2.14 <0.001 7.88
Alter - 0.560 0.75 <0.001 17.1
Metastasen 0.005 <0.001 5.88 <0.001 11
Lymphknoten 0.202 0.283 2.26 -
-Lok/Adv <0.001 <0.001 5.33 <0.001 6.96
Grad 0.012 - - -
-Diameter 0.178 0.200 2.23 0.022 5.07
CRHBP
Grad Tumorgrad / -differentation: Hoch- (G>2) und Niedrig (G<=2)
n. s. keine signifikante Assoziation; keine Einzelwerte in der Publikation gezeigt Methylierungs-Status Status der relativen Methylirerung bzw. globalen Methylierungsgrades
HR Hazard Ratio Gene
Assoziation mit progressionsfreiem Überleben
** ***
fortgeschritten (pT ≥ 3 und / oder pos. Lymphknoten (N+) und / oder pos. Fernmetastasen (M+)) vs.
lokalisiert (lokalisiert und lokal fortgeschritten pT ≤ 2, Lymphknoten und Metastasen negativ)
81 Mit dem Therapieansprechen assoziierte Ergebnisse.
Die Einzelwerte zu den jeweiligen Aussagen über die Signifikanz sind in Tabelle 5 zusammengestellt.
Für die Genloci MIR124-3 und MIR9-1 konnten keine statistischen Assoziationen der relativen Methylierungen mit dem Therapieverlauf festgestellt werden.
Bei den statistischen Analysen zeigte die Therapiekohorte bereits anhand der relativen Methylierungen in den Genloci CST6 (cystatin E/M), LAD1 (ladinin 1) und NEFH eine bimodale Verteilung in zwei niedrig und hoch methylierten Gruppen auf. Eine statistische Assoziation der relativen Methylierungen mit dem Therapieansprechen wurde für alle drei Genloci gefunden.
Die niedrig und hoch methylierten Gruppen zeigten für CST6 ein medianes progressionsfreies Überleben 11.4 vs. 2.0 (p-Wert=0,009; HR=4.1). Das mediane Gesamtüberleben lag bei 22.9 vs. 3.4 Monate (p-Wert=0.011; HR=4.1).
Für den LAD1-Genlocus lagen medianes PFS bei 11.4 vs. 2.0 Monate (p-Wert=0.004;
HR=6.4) und OS bei 16.4 vs. 3.4 (p-Wert=0.043; HR=2.9).
Die niedrig und hoch methylierten Gruppen zeigten für NEFH ein medianes progressionsfreies Überleben 29.8 vs. 9.8 (p-Wert=0,028).
Die Eignung der relativen Methylierung für die Voraussage des Therapieversagens wurde durch die Berechnung der Sensitivität und der Spezifität beurteilt. Der Grenzwert (cutoff - en.) des PFS, welches als ein Parameter für bessere Auftrennung der Therapie-Ansprecher von den Nicht-Ansprechern vorgeschlagen wurde23, wurde auf 6 Monaten gelegt. Bei dichotomisierten Methylierungswerten des Genlocus CST6 ergaben sich die Sensitivität von 0.86 und Spezifität von 0.82. Für den Genlocus LAD1 - 1.0 und 0.73. Für den Genlocus NEFH wurde eine Sensitivität von 0.91 berechnet.
82 Tabelle 5. Eine Übersicht der wichtigsten mi dem therapieansprechen assoziierten Ergebnisse.
Zusammengefasst nach Genen, Analyseparametern und statistischen Verfahren.
medianes Überlebensratio niedriegmethyliert hochmethyliert (HR) CST6
PFS 0.009 11.4 2.0 4.1 -
-OS 0.011 22.9 3.4 4.1 -
-Prädiktion des
Therapieversagens - - - - 0.86 0.82
LAD1
PFS 0.004 11.4 2.0 6.4 -
-OS 0.043 16.4 3.4 2.9 -
-Prädiktion des
Therapieversagens - - - - 1.00 0.73
NEFH
OS 0.028 29.8 9.8 - -
-Prädiktion des
Therapieversagens - - - - - 0.91
* Kaplan-Meier-Schätzer und Log-Rank-Test
** Cut Off-Wert = 6 Monate für die Dichtomisierung der Patienten in Responder und Non-Responder (auf die Therapie ansprechende Patienten und nicht auf die Therapie ansprechende Patienten) - Keine Angaben / Keine Messungen bzw. Analysen durchgeführt
CI Confidence Interval HR Hazard Ratio
PFS progresson-free survival (progressionsfreies Überleben) OS overall survival (Gesamtüberleben)
Gen p-Wert
Überlebensanalysen* Prädiktion des Therapieversagens**
medianes Überleben (Monate, 95%
CI) Spezifität Sensitivität
83
3 Diskussion
Die Dissertation basiert auf sechs bereits veröffentlichen Publikationen, die dieser Schrift beigefügt sind.
Tabelle 6. Übersicht über die Publikationen, Gene und Zitierungen.
Publikationen Nr.
Untersuchtes Gen Anzahl der Zitierungen
(PubMed (Stand 09.05.2019))
1 MIR124-3 27
2 GATA5 3
3 GATA3, GATA5 3
4 MIR124-3, MIR9-1, CST6, LAD1 7
5 NEFH 6
6 CRHBP 2
Die publizierten Ergebnisse können grob drei Themenbereichen zugeordnet werden.
Zum dem Bereich funktioneller Analysen gehören die Ergebnisse aus den Reexpressions-experimenten. (Publikation Nr. 6).
Die Ergebnisse aus den DNA-Methylierungs- und mRNA-Analysen in den in vitro-Zellmodellen und in den Kohorten der Tumor- und Normalgewebe des Nierenzellkarzinoms können dem Bereich der deskriptiven Tumorbiologie zugeordnet werden.
(Publikationen Nr. 1- 3, 5, 6).
Zu dem Bereich der translationalen medizinischen Forschung zählen die Ergebnisse aus den prognostischen und prädiktiven Fragestellungen der These, die sich mit der Überprüfung der möglichen Bedeutung der untersuchten Marker für die klinische Medizin beschäftigten.
(Publikationen Nr. 1 - 6).
Im Folgenden werden diese Aspekte im Kontext des jeweiligen Gens diskutiert.
84 3.1 MIR124-3.
Die MicroRNAs sind wichtige Faktoren in der Genregulation auf der posttranskriptionellen Ebene, unter anderem auch bei den neoplastischen Prozessen136-140. Die Herunterregulierung der miRNA-Synthese wurde als ein frühes weitverbreitetes Ereignis bei der Tumorgenese beobachtet141,142. Inzwischen wurden einige miRNAs wie zum Beispiel MIR122 für das metastasierende ccRCC143 und für die Wildtyp-BAP1-Subgruppe in einem 11-miRNAs-Panel als prognostische Biomarker vorgeschlagen144.
Die miR-124 ist an der Kontrolle der Proliferation, des Zellzyklus und der Migration hämatopoetischer Zellen145 und an Neurogenese beteiligt146-149. Sie wird spezifisch im adulten Nervensystem exprimiert und unterdrückt dort die Expression von hunderten nicht-neuronalen Genen150. Sie wird als vermutlicher Tumorsuppressor angesehen151-157. Es wurde unter anderem über die Herunterregulierung des aggressiven Onkogen EVI1 (Ectopic virus integration 1)158,159 und ebenfalls tumorrelevanten Transkriptionsfaktor Sox9 (SRY-Box 9) durch die miR-124 vermutlich infolge einer Interaktion mit den jeweiligen mRNAs berichten.
Anderseits beeinflussen die beiden Proteine ihrerseits die miR-124-Konzentration (hier wäre eine epigenetische Genrepression wahrscheinlich)157,160-166. Des Weiteren wurde sie mit den Prozessen des pathologischen Alterns und dessen Beitrag zu der Tumorgenese in Zusammenhang gebracht152,167.
Unsere QMSP-Analysen an den in vitro-Zellmodellen und an den Tumorgewebsproben und korrespondierenden peritumoralen Geweben führten zu der Neuidentifizierung hypermethylierter Loci und sind deskriptiver Tumorbiologie zuzuordnen. Im Gegensatz zur früher berichteten MIR124-3-Hypermethylierung bei den Prostata-Zelllinien LNCaP, DU145 und PC3168 konnten wir in diesen Zelllinien in den von uns untersuchten Loci keine Methylierung bzw. in DU145 lediglich eine niedrige Methylierung detektieren. Als wahrscheinliche Ursache hierfür würde die Erfassung unterschiedlicher Methylierungsstellen mit unterschiedlichen Nachweismethoden (Bisulfitsequenzierung versus QMSP) in Frage kommen.
Um die mögliche translationale Relevanz der Ergebnisse einzuschätzen, wurden statistische Evaluationen durchgeführt. Bei den gepaarten Analysen der Tumorgewebe und der korrespondierenden peritumoralen Gewebe wurde für die erhöhte Methylierung eine nominal signifikante tumorspezifische Assoziation gefunden (p=0.026). Beim Vergleich der relativen
85 Methylierungslevel der gepaarten Gewebe ist eine heterogene Zusammensetzung der Gruppe zu erkennen (Publikation Nr. 1; Fig. 3B). Es ist eine Subgruppe mit etwa gleichbleibenden Methylierungsleveln in Tumoren und peritumoralen Geweben und eine zweite Subgruppe mit starkem Anstieg der Methylierung bei den Tumoren auszumachen. Für gastrisches Gewebe wurde ein Anstieg der MIR124-3-Methylierung bereits mit präneoplastischen Prozessen assoziiert169. In zervikalen Geweben wurde graduell verlaufende Erhöhung der Methylierung von prämalignen zu malignen Geweben gefunden170. Unsere Daten weisen eher daraufhin, dass erst progrediente Tumore in der Niere eine erhöhte Methylierung aufweisen.
Entsprechend wurde von uns eine statistische Assoziation zwischen Methylierung und aggressiven Tumoren sowie zwischen Methylierung und Gesamtüberleben gezeigt. Im statistischen Überlebenszeitmodell wurde demonstriert, dass die MIR124-3-Methylierung unabhängig von anderen klinisch-pathologischen Parametern mit dem Gesamtüberleben assoziiert. Insofern kann dieser Locus als unabhängiger Kandidatenprognostikator für die Hochrisiko-Subgruppe vorgeschlagen werden. Die Frage, ob auch weitere Methylierungsänderungen des MIR124-3-Gens bei der RCC-Kanzerogenese als frühes oder spätes Ereignis auftreten, ist noch zu klären.
Der MIR124-3-Genlocus wurde ebenfalls in einem prädiktiven Untersuchungsansatz geprüft.
Es wurde in untersuchten Therapiesubgruppen keine statistische Assoziation gefunden.
Durch andere Arbeitsgruppen wurde, nach der Publikation unserer Ergebnisse, mittlerweile das diagnostische171 und prognostische157,172,173 Potential der MIR-124-3-Methylierung für andere Tumore bestätigt. Für das Ovarialkarzinom wurden MIR124-3- und MIR9-1-Methylierungen als diagnostische und prognostische Kandidaten mit sehr hoher Sensitivität und Spezifität vorgeschlagen174.
Inzwischen gibt es Ansätze, die Exo-miR-124 als Krebstherapeutikum einzusetzen. Sie wurde als das effektivste Behandlungsmittel bei dem Gliom gezeigt, und es wird für diesen neuen Therapieansatz aktuell die Option erforscht, die mesenchymalen Stammzellen als natürliche Biofabriken für deren Produktion zu benutzen.175.
Es wäre interessant, die Einblicke in die mit MIR124-3 verbundenen Signalwege des EVI1, des Sox9 und der Alterung bei Nierenkarzinomen durch funktionelle Untersuchungen zu vertiefen, auch mit der Aussicht auf Entdeckung neuer therapeutischer Targets.
86 3.2 MIR9-1.
Die miRNA9-1 wird hochexprimiert in Gehirn und beteiligt sich an der Regulation der neuronalen Differenzierung176. Aus der Literatur geht eine mehrdeutige Rolle der miR-9 bei verschiedenen Tumorentitäten hervor177. Es wurde sowohl über ihre Rolle als Onkogen178-181, als auch als Tumorsuppressor182-186 berichtet. Für ccRCCs wurde sie als tumorsuppressiv88,187 beschrieben und des Weiteren wurde eine Assoziation der MIR9-1-Methylierung mit dem Gesamtüberleben gezeigt88. Die berichteten gegensätzlichen Merkmale dieses Mikromoleküls könnten durch uneinheitliche Signalwege verschiedener Tumorentitäten und intratumoraler Subtypen oder durch das Differieren infolge unterschiedlicher zeitlicher Dynamik der Krankheit oder der Chemotherapie erklärt werden188. Zudem ist anzumerken, dass eine Assoziation der Hypermethylierung bestimmter Loci mit klinisch-pathologischen Parametern (bei der von uns untersuchten MIR9-1-Hypermethylierung war deren Assoziation mit einer schlechteren Prognose der Fall) nicht zwingend auf die genaue Rolle des Gens / der miR bei der Tumorgenese zurückschließen lässt. Es wurde bereits für einige Gene eine locusspezifische Heterogenität des Methylierungsstatus gezeigt, wobei die einzelnen CpG-Stellen in unterschiedlichen Kombinationen / Proportionen methyliert vorliegen und beide Zustände tumorassoziiert sein können59. Es bedarf tiefergreifender funktioneller Untersuchungen, um ein Gen bzw. Protein als Tumorsuppressor, Onkogen oder auch als
„Passenger“-Gen für RCCs einzuordnen. Dieses gilt auch für die übrigen von uns untersuchten Gene.
Von uns wurde das Potential der MIR9-1-Hypermethylierung als Kandidatenbiomarker für die translationale Medizin untersucht. Die von uns in einem statistischen Modell durchgeführte Analyse des prädiktiven Potenzials einer CGI-Subregion des MIR9-1-Gens hat keine statistischen Zusammenhänge gezeigt. Daher kann die MIR9-1-Subregion nicht unmittelbar als prädiktiver Kandidatenmarker vorgeschlagen werden. Die fehlende Assoziation könnte eventuell auf einen sich dynamisch ändernden MIR9-1-Methylierungsstatus unter Therapieeinfluss zurückgeführt werden. Die Ergebnisse der Arbeitsgruppe um Hildebrandt, welche unter anderem uns als Anstoß für die Therapiestudie dienten, haben 74 neudiagnostizierte Tumore vor Beginn der Therapie untersucht88, in unseren Therapiestudie wurden hingegen die Gewebe bereits behandelter Patienten analysiert. Interessanterweise
87 wurde gezeigt, dass MIR9-1-Methylierung sensitiv gegenüber einem VEGF -Therapeutikums (Erlotonib) war188. Möglicherweise könnte eine Sensitivität, die mit Methylierungsänderungen einhergeht, auch gegenüber weiteren Therapeutika bestehen.
Nach unserer Publikation wurde die miR-9 mittlerweile von anderen Arbeitsgruppen als molekularer Marker im 5-Biomarker-Panel für die Identifizierung von Hochrisikopatienten mit kolitisassoziiertem kolorektalem Karzinom189 und in 7-Biomarker-Panel für die Voraussage des Gesamtüberlebens bei dem Leberzellkarzinom190 vorgeschlagen.
Im Kontext der Literaturdaten über eine starke Beteiligung der miR-9 an neoplastischen Prozessen wären weitere Untersuchungen der Relevanz dieser miR für die ccRCCs trotz
Im Kontext der Literaturdaten über eine starke Beteiligung der miR-9 an neoplastischen Prozessen wären weitere Untersuchungen der Relevanz dieser miR für die ccRCCs trotz