Medizinische Hochschule Hannover
Klinik für Urologie und Urologische Onkologie
Identifizierung epigenetischer Alterationen als Biomarker für Genese, Progression und Therapieansprechen des Nierenzellkarzinoms.
INAUGURALDISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Naturwissenschaften - Doctor rerum naturalium -
(Dr. rer. nat.)
Kumulative Dissertation, bestehend aus 6 Beiträgen vorgelegt von
Natalia Dubrowinskaja
aus Atschinsk Russland
Hannover 2019
Angenommen durch den Senat: 01.10.2019
Präsident: Prof. Dr. med. Michael P. Manns Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. Markus Antonius Kuczyk Wissenschaftliche Zweitbetreuung: Prof. Dr. rer. nat. Jürgen Alves
1. Referent/in: Prof. Dr. med. Markus Antonius Kuczyk 2. Referent/in: Prof. Dr. rer. nat. Jürgen Alves
3. Referent/in: Prof.‘in Dr. med. Brigitte Schlegelberger
Tag der mündlichen Prüfung: 01.10.2019 Prüfungsausschuss
Vorsitz: Prof. Dr. rer. nat. Jürgen Alves
1. Prüfer/in: Prof. Dr. med. Markus Antonius Kuczyk 2. Prüfer/in: Prof. Dr. rer. nat. Jürgen Alves
3. Prüfer/in: Prof.‘in Dr. med. Brigitte Schlegelberger
1
Verzeichnisse
I
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 5
1.1 Epidemiologie des Nierenkarzinoms ... 5
1.2 Aktueller Stand der Therapie. ... 5
1.2.1 Therapieansätze. ... 6
1.2.2 Therapieaussichten. ... 7
1.2.3 Klinische Therapieentscheidungen – Möglichkeiten und Limitationen. ... 7
1.3 Molekulare Pathogenese des Nierenzellkarzinoms. ... 8
1.4 Molekulare Biomarker für das Nierenzellkarzinom – aktueller Stand. ... 12
1.5 DNA-Methylierung als klinischer Biomarker. ... 13
1.6 Zielsetzung der Arbeit. ... 15
2 Ergebnisse. ... 16
2.1 Übersicht der zugrundeliegenden Publikationen. ... 16
2.1.1 Beigefügte Publikationen. ... 18
2.2 Zusammenfassung der Ergebnisse. ... 73
2.2.1 Allgemeine Kriterien für die durchgeführten Untersuchungen. ... 73
2.2.2 Ergebnisse funktioneller Analysen. ... 76
2.2.3 Deskriptive Ergebnisse. ... 76
2.2.4 Translationale Ergebnisse.... 79
3 Diskussion ... 83
3.1 MIR124-3. ... 84
3.2 MIR9-1. ... 86
3.3 GATA3. ... 87
3.4 GATA5. ... 88
3.5 CST6. ... 90
3.6 LAD1. ... 91
3.7 NEFH. ... 93
3.8 CRHBP. ... 94
3.9 Zusammenfassende Diskussion. ... 96
2
3.9.1 Neue Erkenntnisse. ... 96
3.9.2 Aktuelle klinische Anforderungen bei RCCs. ... 97
3.9.3 Aspekte für zukünftige Untersuchungen. ... 98
3.9.4 Perspektiven für die klinikorientierte RCC-Forschung. ... 101
4 Zusammenfassung. ... 102
5 Summary. ... 104
6 Literaturverzeichnis. ... 105
Danksagung. ... 133
Eidesstattliche Erklärung.... 134
Lebenslauf. ... 135
II Tabellenverzeichnis
Tabelle 1. Eigenanteilerklärung………...….18Tabelle 2. Übersicht über das experimentelle Design……….………...…..75
Tabelle 3. Übersicht über die wichtigsten deskriptiven Ergebnisse...………...……...78
Tabelle 4. Übersicht über die wichtigsten Ergebnisse zur Prognose………..………...80
Tabelle 5. Übersicht über die wichtigsten Ergebnisse zum Therapieansprechen……...…...82
Tabelle 6. Übersicht über die Publikationen, Gene und Zitierungen………...….83
3
III Abkürzungsverzeichnis
AKT Proteinkinase B
BAP1 BRCA1 Associated Protein-1 CGIs CpG islands (en.); CpG-Inseln (dt.) ccRCC Clear Cell Renal Cell Carcinoma (en.);
klarzelliges Nierenzellkarzinom (dt.) CRH Corticotrophin-Releasing Hormone
CRHBP Human Corticotrophin Releasing Factor Binding Protein
CST6 Cystatin E/M
ctDNA Circulating Tumor DNA (en.); zirkulierende Tumor-DNA (dt.)
dt. deutsch
en. englisch
EMT Epithelial-Mesenchymale Transition GATA3 GATA Binding Protein 3
GATA5 GATA Binding Protein 5
IMDC International Metastatic Renal Cell Carcinoma Database Consortium Model (en.)
ITH Intratumorale Heterogenität KPP Klinisch-Pathologische Parameter
LAD1 Ladinin 1
LOH Loss Of Heterozygosity
MET MET Proto-Oncogene
miRNA microRNA
mRCC metastasiertes Nierenzellkarzinom
mRNA messenger RNA
MSKCC Memorial-Sloan-Kettering-Cancer-Center Model mTOR mechanistic Target of Rapamycin (en.);
Ziel des Rapamycins im Säugetier (dt.) NF-H Neurofilament Heavy Chain
OS Overall Survival (en.); Gesamtüberleben (dt.)
PCR Polymerase Chain Reaction (en.); Polymerase-Kettenreaktion (dt.)
4 PFS Progression Free Survival (en.); progressionsfreies Überleben (dt.) QMSP Quantitative Methylspezifische PCR
RT-PCR Real-Time quantitative PCR (en.); Echtzeit-PCR siRNA small interfering RNA
SNP Single Nucleotide Polimorphism (en.);
Einzelnukleotid-Polymorphism (dt.) TCGA The Cancer Genome Atlas
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
VHL Von Hippel-Lindau-Syndrom
5
1 Einleitung
1.1 Epidemiologie des Nierenkarzinoms
Mit über 400 000 Fällen weltweit, welche ca. 2,2 % der Gesamtheit aller onkologischen Neuerkrankungen entsprechen, lag Nierenkrebs (renal cell carcinoma (RCC) - en.) - im Jahr 2018 auf Platz 14 der Inzidenzfälle1. Die Mortalität betrug dabei über 175 000 Fälle und lag dementsprechend auf dem 16 Platz1,2. In Deutschland wurden im Jahr 2014 offiziell 14 960 Neuerkrankungen und 5 278 Todesfälle registriert2. Die Inzidenz bei Männern lag etwa zwei Mal höher als bei Frauen1-3.
Mit einem Anteil von 70 % ist das klarzellige Nierenzellkarzinom (Clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) - en.) mit Abstand der häufigste Typ, 10-15 % sind papilläre Karzinome, ca. 5% - chromophobe und weniger als 1 % sind den Karzinomen der Sammeltubuli zuzuordnen4.
Das durchschnittliche Erkrankungsalter von 68 Jahren bei Männern und 72 Jahren bei Frauen weist daraufhin, dass das Alter zu den wichtigsten Risikofaktoren bei der Ausbildung der Nierenkarzinome RCC gezählt werden kann1-4.
Als gesicherte Risikofaktoren gelten ferner einige modifizierbare Lebensstilfaktoren wie Tabakkonsum, Adipositas, Bluthochdruck und Diabetes. Zu den protektiven Lebensstilfaktoren zählen der Alkoholkonsum und körperliche Aktivität5. Etliche chemische Agenzien wie Arsen, Asbest, Benzinbestandteile, Blei, Halogenkohlenwasserstoffe, Kadmium und Trichloroethylen gelten als krankheitsassoziiert und somit als zusätzliche Risikofaktoren3,4.
1.2 Aktueller Stand der Therapie.
In über 30 % der Fälle liegt bereits bei der Erstdiagnose eine Metastasierung der Tumore vor6. Derartige Befunde bedeuten für den Patienten eine sehr ungünstige Prognose mit einer 5-jährigen Überlebensrate von ca. 12 %7. Während die Patienten mit Tumoren im frühen Stadium nach der Resektion gute Genesungsaussichten haben, weist die Gruppe mit metastasierten Tumoren (mRCC), die zudem oft inoperabel sind, eine sehr hohe Mortalitätsrate auf. Nach der Primärtumorentfernung setzt die Metastasierung in 20-30 % der Fälle wieder ein, wobei zugleich sich oft eine Resistenz gegenüber „klassischen“ Chemo- und
6 Strahlentherapieansätzen entwickelt8,9. Die medikamentöse Systemtherapie spielt bei der Behandlung der mRCC-Patienten, vornehmlich vor einem palliativen Hintergrund, eine wichtige Rolle. Mit Hilfe der zur Verfügung stehenden Therapeutika wird angestrebt, vor allem das Gesamtüberleben (overall survival (OS) - en.) und progressionsfreie Überleben (progression free survival (PFS) - en.) metastasierender Patienten zu verlängern und deren Lebensqualität zu verbessern10.
1.2.1 Therapieansätze.
Die gezielten Krebstherapeutika. Mehrere Vertreter dieser vergleichsweise neuen Gruppe sind aktuell die wirksamsten Medikamente bei der Behandlung von inoperablen oder metastasierenden Nierenzellkarzinomen und befinden sich im klinischen Einsatz bzw. in den fortgeschrittenen Testphasen. Drei unterschiedliche Wirkungsansätze haben sich derzeit herauskristallisiert.
Zum einem wird, angesichts der Tatsache, dass circa 60 % der Karzinome hohe Konzentration an VEGFs (Vascular Endothelial Growth Factors - en.) aufweisen, versucht an mehreren Stellen die Prozesse der Tumorvaskularisation gezielt zu beeinträchtigen. Konkret wird die Produktion der proangiogenetischen Faktoren durch die Tyrosinkinaseinhibitoren (TKI) gemindert, unterdrückt oder deren Bindung an die involvierten Rezeptoren verhindert bzw.
deren Aktivität blockiert11,12.
Zum anderem wird, mittels sogenannter mTOR-Inhibitoren (mechanistic Target of Rapamycin - en.), die allgemeine Funktionalität der Tumorzellen beeinflusst. Die Inaktivierung des mTORs, durch therapeutische Kleinmolekülinhibitoren der Klasse Makrolide, hemmt allgemein die stromabwärts liegenden Signalwege, was die Proliferationsstörung der Tumorzellen, die Stimulierung der Autophagie oder Apoptose und Beeinträchtigung der Tumorangiogenese bewirkt13-15.
Des Weiterem sind diverse Substanzen, die als Inhibitoren verschiedener Checkpoints des Immunsystems (Immun-Checkpiont-Hemmer (ICH)) agieren und der immunevasiven Eigenschaft der Tumore entgegenwirken, ein Gegenstand pharmazeutischer Forschung16,17. Die ICHs weisen teilweise eine so derart hohe Toxizität auf, dass viele der klinischen Studien
7 (beispielsweise Teststudien der CTLA4-Inhibitoren (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4)) in der Phase II abgebrochen werden9.
1.2.2 Therapieaussichten.
In den Jahren der Anwendung von gezielten Krebstherapeutika bei Nierenzellkarzinomen ist die 5-Jahres-Überlebensrate von 20 % auf 60 % gestiegen. Die 5-Jahres-Überlebensrate von 10 % und das mediane Gesamtüberleben von 6-12 Monaten bleiben bei primär metastasierten Tumoren weiterhin sehr niedrig18. Trotz der vergleichsweise höheren Rate der Therapieansprecher (eine Vergleichsstudie mit IL-2 (Interleukin-2)), ist das komplette Ansprechen dennoch sehr selten19. Auch wird lediglich eine signifikante Verlängerung der Gesamtüberlebenszeit beobachtet, jedoch nicht des progressionsfreien Überlebens19,20. Das Resistenzproblem der Tumore, welches mutmaßlich aus deren hoher epi- und genetischer Heterogenität resultiert, bleibt auch gegenüber den gezielten Krebstherapeutika bestehen – oft bereits in dem ersten Jahr der Therapie21,22.
Überdies weisen alle Medikamente eine sehr hohe Toxizität auf, welche für die Patienten erhebliche Nebenwirkungen zufolge hat. Die klinischen Ärzte stehen somit vor der Aufgabe, eine möglichst individuelle und effiziente Therapie durchzuführen.
1.2.3 Klinische Therapieentscheidungen – Möglichkeiten und Limitationen.
An dieser Stelle ist kurz der Unterschied zwischen den Begriffen „Prognose“ und
„Prädiktion“ beziehungsweise „prognostische“ und „prädiktive“ Faktoren zu verdeutlichen.
Die Prognose dient der Einschätzung des Krankheitsausgangs ohne die Berücksichtigung der eventuellen zukünftigen adjuvanten Therapie. Die Prädiktion wird als die Prognose des Krankheitsverlaufes unter einer bestimmten Therapie und unter Einbezug der individuellen Risikofaktoren des Patienten definiert. Prädiktive Faktoren helfen bei der Einschätzung der Therapieeffektivität, was angesichts der Tatsache, dass speziell die ccRCC-Patienten bei der gezielten Therapie unterschiedliche Überlebenszeiten aufweisen, von großem klinischem Interesse ist23.
8 Als Grundlage bei der Behandlungswahl von Nierenkarzinompatienten dient in Deutschland die „S3-Leitlinie Diagnostik, Therapie und Nachsorge des Nierenzellkarzinom.“24. Den Klinikern stehen anatomische25, klinische26,27 und histologische Faktoren28,29 zur Verfügung um eine prognostische oder prädiktive Aussage treffen zu können.
Da die Aussagekraft der Einzelfaktoren in der Praxis nur begrenzt für eine individuelle Prognose und Therapiewahl ausreicht, werden von Medizinern seit über 16 Jahren prognostische Modelle als Entscheidungshilfen, zwecks Risikostratifizierung, benutzt: das MSKCC (Memorial-Sloan-Kettering-Cancer-Center Model - en.) mit fünf unabhängigen klinischen Faktoren30 und das IMDC (International Metastatic Renal Cell Carcinoma Database Consortium Model - en.) mit sechs ebenso klinischen Kriterien30. Sie sind offiziell in S3-Leitlinien zur Bestimmung der Risikogruppe verankert. Verglichen mit vier anderen Prognose-Modellen (allerdings noch aus der Zytokinära der RCC-Therapie - darunter auch MSKCC), weist das IMDC-Modell die beste Aussagekraft mit Hinsicht auf 2-Jahres- Prognose krankheitsbedingter Todesfälle vor30. Somit ist das IMDC-Modell zurzeit (zusammen mit den histologischen Daten) auch für die Prädiktion der gezielten Krebstherapie das geeignetste Modell.
Dennoch sind auch die Entwickler des IMDC-Modells der Meinung, dass rein klinische prognostische Faktoren bei Therapieprädiktion für metastatische Tumoren ihre Grenzen erreicht haben. Es erfordert neue Biomarker, die bei Individualisierung der Therapie, vor allem bei einer Voraussage von Therapieversagen bzw. im Falle einer erforderlichen „Switch- Therapie“ (Sequenztherapie um die Therapieresistenz zu umgehen) zu der Erhöhung der Erfolgsquote klinischer Behandlungen beitragen könnten31-33.
1.3 Molekulare Pathogenese des Nierenzellkarzinoms.
Das für die meisten Nierentumore als typisch geltende Bild des gestörten Glukosemetabolismus und Fettablagerungen weist auf die Beteiligung der Gene hin, die für die Stoffwechselvorgänge relevant sind34. Das lässt einerseits den Nierenkrebs als eine metabolische Krankheit verstehen34, andererseits sind zusätzliche Mechanismen notwendig, um eine tatsächliche Tumorbildung mit für ccRCC spezifischen metabolischen Phänotypen auszulösen35.
9 Ebenfalls wurde seit langem die Beteiligung des Immunsystems an den Prozessen der Tumorgenese der Niere untersucht. In der Tumormikroumgebung (tumor microenvironment (TME) - en.) wurde speziell bei den Nierentumoren eine sehr hohe Ansammlung und Aktivität diverser Abwehrzellen beobachtet36,37. Jedoch findet gleichzeitig eine Maskierung der Tumorzellen gegenüber dem Immunsystem, sowie eine verstärkte Apoptose der T-Zellen und daraus folgende Anergie statt37,38. Des Weiteren können die veränderten Differenzierungen dendritischer Zellen, die Induktion der Anergie assoziierten Gene in den T-Zellen39 und tumorassoziierte Makrophagen (TAMs) zur Insuffizienz des Immunsystems und der Tumorangiogenese und -infiltration beitragen40,41. Es wurde eine prognoserelevante tumorsubtypspezifische Zusammensetzung der TAM-Phänotypen in RCCs gezeigt42.
Die molekularen Ursachen hinter den Nierenzellkarzinomen, vor allem im Kontext der genetischen Komponenten, sind Gegenstand zahlreicher wissenschaftlicher Untersuchungen.
Aktuell wird davon ausgegangen, dass ca. 4 % der RCC-Fälle auf eine genetische Prädisposition zurückzuführen sind43. Ein Teil der erblichen Nierentumore gehört zu gut beschriebenen vererbbaren Syndromen, die Mehrzahl wurde allerdings noch nicht vollständig und eindeutig genetisch charakterisiert43. Zu den gut beschriebenen RCC-Syndromen mit assoziierten Mutationen zählen von Hippel-Lindau-Syndrom (VHL-Mutationen), erbliches papilläres RCC (MET-Mutationen), Birt-Hogg-Dubé- (BHD) -Syndrom (FLCN-Mutationen (Folliculin)) und hereditäre Leiomyomatose mit RCC (HLRCC) (FH-Mutationen (Fumarathydratase))43.
Das am häufigsten betroffene Gen bei den ccRCCs ist VHL. Ca. 40-50 % der Träger verschiedener VHL-Alterationen erkranken an Nierenkrebs. Insgesamt ist das Gen bei ca. 60-80 % aller erblichen sowie sporadischen ccRCC-Fällen epigenetisch oder genetisch stillgelegt4,43,44. Dazu zählen unter anderem Allel- und Bialleldeaktivierungen, Allel- und
Bialleldeletionen, DNA-Mutationen und DNA-Methylierungsalterationen4,43,44. Als ein Adaptorprotein tritt VHL-Protein (pVHL) zwar als Interaktionspartner für über 30 verschiedene in die Tumorgenese involvierten Proteine auf, eine Assoziation zwischen einem Funktionsverlust des pVHL und progressionsfreiem Überleben bzw. Gesamtüberleben wurde bei den metastasierten Patienten jedoch nicht festgestellt4,43,44. Dieser Umstand wurde dahingehend interpretiert, dass die Tumorentstehung und -progression nicht einzig als Folge des Funktionsverlusts des pVHL angesehen werden können45, sondern es vielmehr von mehreren genetischen und epigenetischen Ereignissen in Kombination verursacht wird46.
10 Weitere, bei sporadischen ccRCCs am häufigsten mutierte Gene sind PBRM1 (Polybromo 1), SETD2 (SET domain containing 2) und BAP1 (BRCA1 associated protein-1), wobei in der Summe bei 10-50 % der Patienten somatische Mutationen beobachtet wurden47,48. Diese Gene kodieren für histon- und chromatinregulierende Proteine und sind auch wie das VHL-Gen auf dem Chromosom 3 lokalisiert, welches in mehr als 90 % der ccRCCs den Verlust des kurzen Arms aufweist48. Die Mutationen in jedem dieser Gene sind signifikant mit dessen Expressionsverlust assoziiert. Diese Mutationen korrelieren untereinander und sind mit vorgeschrittenem Tumorstadium, hohem Tumorgrad, schlechter Tumordifferentiation und Nekrose signifikant assoziiert48,49. In früheren Arbeiten wurden die sich gegenseitig ausschließenden Mutationen von BAP1 und PBRM1 und deren unabhängige Aussagekraft bezüglich schlechter Prognose diskutiert50. Auch bei der Klassifizierung der ccRCCs in sieben klonale evolutionäre Subtypen spielen diese drei Gene bei fünf der Subtypen eine sehr wichtige Rolle48,49.
In ca. 20 % der ccRCCs wurden Mutationen, die den Signaltransduktionsweg des mTOR- Komplexes 1 deregulieren, in den Genen MTOR, TSC1 (tuberous sclerosis proteins 1), PIK3CA (Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate 3-Kinase Catalytic Subunit Alpha) und PTEN (phosphatase and Tensin homolog) identifiziert50.
Verschiedene weitere spontane somatische Mutationen, darunter auch die des bereits erwähnten MET-Gens, konnten mit sporadischen Fällen des Nierenkarzinoms in Verbindung gebracht werden43,51. Als tumorrelevante identifizierte Gene sind unter anderem KDM5C (lysine-specific demethylase 5C), UTX (ubiquitously transcribed tetratricopeptide repeat, X chromosome), MITF (Melanocyte Inducing Transcription Factor), SDHD (succinate dehydrogenase complex subunit D), TFE3 (transcription factor E3), TFEB (transcription factor EB) und TP53 (tumor protein p53) beschrieben worden47,51,52.
Hinsichtlich der Unterteilung der tumorrelevanten Gene in Kategorien nach deren Funktion im Organismus wären die am häufigsten betroffenen Gene (u.a. VHL, PBRM1, SETD2, BAP1, MTOR) den sogenannten Caretaker-Genen (Hausmeister-Gene), die für die Genomintegrität verantwortlich sind, zuzuordnen53. Zugleich wurden die Deletionen, Mutationen usw. in diesen Genen als Treiber-Aberrationen bei frühen Ereignissen der klonalen Tumorevolution in den ccRCCs identifiziert49,54,55. Diese Erkenntnisse würden im Einklang mit der Theorie über die Kolinearität zwischen der Entstehungszeit der tumorrelevanten Gene während der Evolution und deren Rolle bei der Tumorprogression stehen. Diese beinhaltet dass die
11 tumorassoziierten Mutationen der zwei Gengruppen – Caretakers und Gatekeepers (Pförtner- Gene) in zwei zeitlich nach einander folgenden Peaks stattfinden und die phylogenetische Abfolge der Genentstehung (Caretakers bei der Einzeller-Entstehung und Gatekeepers bei der Metazoa-Entstehung) widerspiegeln53.
Eine ausgeprägte intratumorale Heterogenität (ITH) der klarzelligen Nierentumore wird als einer der entscheidendsten Aspekte für die häufige Metastasierung und Therapieresistenz diskutiert47,52,56,57. Aus den in silico-Analysen der in der TCGA-Datenbank zu Verfügung stehender Multi-omic Daten der Einzelbiopsien geht hervor, dass die Patienten mit ähnlichen klinischen Befunden auf der molekularen Ebene individuelle heterogene Profile aufweisen und die ITH ein häufiges Ereignis ist54,58. Das heterogene individuelle Mutationsspektrum erschwert die Suche nach statistischer Assoziation mit den klinischen Verläufen. Die tiefergreifenden Untersuchungen von Multiregiongewebsbiopsien mit Hilfe von ultratiefen Sequenzierungen des Genoms oder Exoms zeigten, dass die Diversität und Komplexität der ITH mit der Anzahl der analysierten Biopsien steigt49,54. Aktuell wird die subklonale Evolution der Tumorzellen der Niere intensiv erforscht, um die klonalen Architekturmuster mit klinischen prognoserelevanten Subtypen in Verbindung zu bringen55. Des Weiteren werden inzwischen auch vor dem populations-genetischen Hintergrund die Signatur-Analysen des ccRCCs durchgeführt55.
Interessanterweise sind die genetischen Alterationen absolut gesehen vergleichsweise weniger häufige Ereignisse59. Zugleich kodieren einige der mit am häufigsten mutierten Gene wie z.B.
PBRM1, SETD2 und BAP1 in die epigenetischen Prozesse involvierte chromatinmodulierende Enzyme. Überdies sind diese Gene selbst häufig epigenetisch alteriert59. Tatsächlich sind die epigenetischen Ereignisse bei den Nierentumoren häufiger zu finden als die somatischen Mutationen. Dazu gehören unter anderem die Veränderungen der Histonmodifikationen, der DNA-Methylierung und veränderte miRNA-Levels60. Mittlerweile wurden von mehreren Gruppen Hypermethylierungen diverser Loci in dem Nierenkarzinom gezeigt und einige davon teilweise unabhängig voneinander bestätigt61. Daraus folgend lässt sich auf die Relevanz die epigenetischen Alterationen bei der Entstehung und Progression von klarzelligen Nierentumoren schließen35. Dementsprechend wäre es denkbar, dass ferner Assoziationen solcher Alterationen mit Prognose und Prädiktion der Nierenzelltumoren existieren.
12 1.4 Molekulare Biomarker für das Nierenzellkarzinom – aktueller Stand.
Die limitierte Aussagekraft klinischer Modelle bezüglich einer Stratifikation der ccRCC- Patienten und deren Therapieansprechen ist vor allem auf hohe intratumorale genetische und epigenetische Heterogenität zurück zu führen56,62-64. Vor diesem Hintergrund könnte eine feinere Auflösung individueller molekularer Profile der Patienten mit ähnlichen klinischen und histologischen Phänotypen fehlende prognostische bzw. prädiktive Informationen liefern.
Daher ist es weit akzeptiert dass neue biomolekulare Marker benötigt werden65. Dieser neue experimentelle Ansatz wird aktuell intensiv erforscht und ist Gegenstand zahlreicher Untersuchungen und Studien. Die Umsetzung in die Praxis steht jedoch noch aus.
Da mittlerweile eine große Anzahl an vorgeschlagenen biomolekularen Kandidatenmarker existiert, werden hier nur beispielhaft einige Ergebnisse aus der Literatur aufgeführt. Die Kandidatenmarker lassen sich nach Art des zu analysierendes Materials und nach der Art der Analyseverfahren und des Weiteren nach deren diagnostischen, prognostischen und prädiktiven Nutzen unterscheiden.
Die Anwendung von immunhistochemischen Protein- und zytogenetischen Analyseverfahren an Geweben66-70 und nicht invasiven Proteintests mit Hilfe bildgebender Verfahren71-73 könnten bei der Prognose eine Rolle spielen.
Es gibt experimentelle Ansätze, aus dem nicht invasiv bzw. mit geringen Komplikations- häufigkeit zu beschaffenden Material, wie beispielsweise Urin oder Blut, die Informationen prognostischer bzw. prädiktiver Natur zu gewinnen74-76, welche aber vorerst widersprüchliche Resultate lieferten77-82.
Diverse Kandidatenmarker für die Prognose wurden bei der Analyse an den Tumorgeweben im Bereich der DNA-Mutationen52,83, der mRNA84-87 und DNA-Methylierungen88,89, zum Teil als Einzelfaktoren oder auch in Kombination, identifiziert58,90-92.
Auf genetischer Ebene konnten zum Beispiel die Assoziationen zwischen einigen SNP- Varianten (single nucleotide poyimorphism - en.; Einzelnukleotid-Polymorphismen) und dem Therapieausgang gezeigt werden93-98.
Für die Veränderungen in der mRNA-Expression wurden in ersten kleineren Studien Korrelationen mit dem Therapieansprechen, also ein prädiktives Potenzial, nachgewiesen99,100.
13 Auf der epigenetischen Ebene wurden beispielsweise für Gene wie BNC1 (Basonuclin 1), CDO1 (Cysteine Dioxygenase Type 1), COL14A1 (Collagen Type XIV Alpha 1 Chain)101,102, GREM1 (Gremlin 1)103, GATA5 (GATA Binding Protein 5)104, RASSF1A (Ras Association Domain Family Member 1)105-107, SFRP1 (Secreted Frizzled Related Protein 1)108 signifikante Korrelationen der DNA-Methylierung mit klinisch-pathologischen Parametern (KPP;
clinicopathological parameters (CPPs) - en.) - und einer ungünstigen Prognose bei RCC beobachtet. Ebenso wurde vor kurzem ein promoter methylation classifier ((PMC) panel (Promoter-Methylierungsklassifizierer-Panel (dt.)) aus 172 CpG-Stellen für die Prognose der nicht-metastasierten ccRCC-Patienten vorgeschlagen109. Die Liste der Loci, die tumorspezifische DNA-Methylierungsänderungen aufweisen bzw. starke Assoziationen mit den klinikrelevanten Fragestellungen zeigen, wird ständig mit neuen potenziellen Kandidaten erweitert.
Als Schlussfolgerung aus den neuen Erkenntnissen letzter Jahre, die auf potenzielle klinische Relevanz epigenetischer Alterationen hindeuten, wurde in unserer Arbeitsgruppe beschlossen sich verstärkt mit dem Thema der DNA-Methylierungen in den urogenitalen Tumoren zu beschäftigen.
1.5 DNA-Methylierung als klinischer Biomarker.
DNA-Methylierung allgemein. Zwei Hauptfunktionen methylierter Cytosine, die aus der Hauptfurche des DNA-Doppelstrangs herausragen, werden postuliert - das Fernhalten der Transkriptionsfaktoren und das Anlocken von methylbindenden Proteinen, die mit dem Genschweigen und mit Histonmodifikationen assoziiert sind. Es wurde eine breite Spannweite an den DNA-Methylierungsvarianten unter den verschiedenen Spezies gefunden.
Im Gegensatz zu den Wirbellosen wurde eine Sonderstellung der Wirbeltiere mit für sie typischen Genmethylierungen beobachtet. Bei den Letzteren wird ein Teil der Gene in Korrelation mit der Präsenz von CpG-Methylierungen transkribiert (und evtl. durch die auch kontrolliert), und ein anderer Teil ist davon unabhängig. Dies lässt die Methylierung als einen weiteren, zusätzlich hinzugekommenen, Mechanismus moderater Natur, der toleriert und / oder bei der Kontrolle der Genexpression benutzt wird, beschreiben110,111.
14 DNA-Methylierung in Tumoren. Ähnlich der Genmutationen können auftretende tumorspezifische Methylierungen zu der Aggregation der tumorbegünstigenden Signalwege führen, woraus sich auch der Tumorphänotyp ableiten lässt112. Trotz einer 5 - 10 -fachen Steigerung der Mutationsrate (im Detail überwiegen Rearrangements die Punktmutationen113) liegt die Frequenz der Methylierungsänderungen in Tumoren weit über die Frequenz der Genmutationen114-116. Dabei entstehen tumorspezifische Methylierungsmuster113,117-120, und der Verlust der DNA-Methylierung trägt mutmaßlich zu der chromosomalen Instabilität bei121. Diese Beobachtungen stehen im Einklang mit dem Krebsentstehungsmodell der epigenetischen Krebsvorläuferzelle110,121-124.
Auch der globale Methylierungsverlust kann mit dem Stadium der Progression und Metastasierung korrelieren125-128. Früher im Text exemplarisch aufgeführte Beispiele der Korrelation der Methylierungsalterationen mit wichtigen tumorrelevanten Charakteristika veranschaulichen das Potenzial der DNA-Methylierung als vielversprechende translationale Kandidatenbiomarker.
Obwohl die Anwesenheit von chromosomalen Aberrationen und Mutationen in RCCs als häufiges Ereignis gut beschrieben ist, konnte bis heute keiner der untersuchten genetischen Kandidaten eine ausreichende prognostische bzw. prädiktive Aussagekraft vorweisen. Dabei ist es zu beachten, dass die molekularen Schritte der Tumorentstehung aus Keimzellen nicht zwingend gleiche Mutationen wie die nicht-familiären Tumore aufweisen müssen. Anderseits schließt das Fehlen klinikrelevanter Aussagen anhand der genetischen Alterationen das Finden relevanter Informationen bei den gleichen Genen auf epigenetischer Ebene nicht aus.
Somit können auch aus dem Bereich der Genetik abgeleitete Daten eine gute Ausgangsplattform sein, um die epigenetische Seite zu erforschen113.
Praktibilität der DNA-Methylierungsanalysen. Zu erwähnen wären die unkomplizierten Abläufe und die Möglichkeit der Verfahrensstandardisierung für die klinische Routine bereits vorhandener Methoden wie beispielsweise QMSP (quantitative methylspezifische PCR) oder Pyrosequenzierung. Dafür benötigtes Material kann ohne Beeinträchtigung der Routinediagnostik und ohne zusätzliche Belastung des Patienten untersucht werden. Die Materialkonservierung kann flexibel gehandhabt werden - sowohl aus frisch eingefrorenem Gewebe, als auch aus FFPE-Gewebe(formalinfixiertes paraffineingebettetes Gewebe) und - Gewebsschnitten ist die Gewinnung hochqualitativer DNA in standardisierten Verfahren möglich.
15 1.6 Zielsetzung der Arbeit.
Gemeinsame Zielsetzung der vorliegenden Arbeit und der in diesem Rahmen publizierten Studien war die Identifizierung neuer molekularer Marker mit einer potenziellen Relevanz für die Prognose bzw. Prädiktion der Nierenzellkarzinome.
Die Relevanz entsprechender biometrisch identifizierten Biomarker-Kandidaten sollte in retrospektiven Querschnittsanalysen unter Verwendung aktueller Laborverfahren, wie der Quantifizierung von mRNA-Expression sowie den quantitativen Nachweis von DNA- Methylierungsänderungen experimentell überprüft werden.
Die quantitativen Daten sollten die Grundlage für eine objektive statistische Evaluation schaffen, um so Hinweise auf die Relevanz der untersuchten Alterationen zu geben.
16
2 Ergebnisse.
2.1 Übersicht der zugrundeliegenden Publikationen.
1) Gebauer K, Peters I, Dubrowinskaja N, Hennenlotter J, Abbas M, Scherer R, et al. Hsa- mir-124-3 CpG island methylation is associated with advanced tumours and disease recurrence of patients with clear cell renal cell carcinoma. Br J Cancer. 2013 Jan 15;108(1):131-8.129
Mittels QMSP-Messungen wurde eine Erhöhung der relativen DNA-Methylierung in einem Locus innerhalb einer CpG-Insel des MIR124-3-Gens in der Kohorte der ccRCC- Tumorgewebsproben im Vergleich mit der Kohorte korrespondierender peritumoraler Geweben festgestellt. Die Subgruppe der fortgeschrittenen Tumore zeigte eine nochmals signifikant höhere relative Methylierungswerte. Die statistische Assoziation höherer relativer Methylierung mit einem verkürzten rückfallfreien Überleben identifizierte die Methylierung als signifikanten Modellparameter.
2) Peters I, Dubrowinskaja N, Kogosov M, Abbas M, Hennenlotter J, von Klot C, et al.
Decreased GATA5 mRNA expression associates with CpG island methylation and shortened recurrence-free survival in clear cell renal cell carcinoma. BMC Cancer. 2014 Feb 17;14:101130.
Der mittels RT-PCR gemessener GATA5-mRNA-Expressionslevel wurde als statistisch signifikant reduziert in der Kohorte der ccRCC-Tumorgewebsproben im Vergleich mit der Kohorte korrespondierender peritumoraler Geweben gezeigt. Außerdem zeigte die Kohorte der ccRCC-Tumorgewebsproben, verglichen mit der Kohorte korrespondierender peritumoraler Gewebe, statistisch eine erhöhte relative Methylierung innerhalb eines Locus einer CpG-Insel des GATA5-Gens. Die statistische Untersuchung zu einer möglichen Assoziation des reduzierten mRNA-Expressionslevels mit schlechtem klinischem Ergebnis identifizierte mRNA-Level als signifikanten Modellparameter.
3) Peters I, Gebauer K, Dubrowinskaja N, Atschekzei F, Kramer MW, Hennenlotter J, et al.
GATA5 CpG island hypermethylation is an independent predictor for poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Oncol Rep. 2014 Apr;31(4):1523-30131.
17 In der Kohorte der RCC-Tumorgewebsproben zeigten mittels QMSP gemessene relative DNA-Methylierungen für ausgewählte Loci innerhalb der CpG-Inseln der GATA3- und GATA5-Gene eine statistische Assoziation mit dem Metastasierungsstatus. Die statistische Untersuchung zu einer möglichen Assoziation höherer relativer Methylierung mit einem verkürzten progressionsfreien Überleben identifizierte GATA5-Methylierung als signifikanten Modellparameter.
4) Peters I, Dubrowinskaja N, Abbas M, Seidel C, Kogosov M, Scherer R, et al. DNA Methylation Biomarkers Predict Progression-Free and Overall Survival of Metastatic Renal Cell Cancer (mRCC) Treated with Antiangiogenic Therapies. PLoS One. 2014 Mar 14;9(3):e91440132.
Die Prädiktion des Therapieverlaufs bei metastasierten RCC-Patienten war Gegenstand der obigen Arbeit. Die mittels QMSP gemessene relative DNA-Methylierung zeigte einen statistisch signifikanten Zusammenhang mit dem Therapieansprechen/-erfolg für die CST6- und LAD1-Genloci.
5) Dubrowinskaja N, Gebauer K, Peters I, Hennenlotter J, Abbas M, Scherer R, et al.
Neurofilament Heavy polypeptide CpG island methylation associates with prognosis of renal cell carcinoma and prediction of antivascular endothelial growth factor therapy response. Cancer Med. 2014 Apr;3(2):300-9133.
Mittels QMSP-Messungen wurde eine durchschnittliche Erhöhung der relativen DNA- Methylierung in einem Locus innerhalb einer CpG-Insel des NEFH-Gens in der Kohorte der RCC-Tumorgewebsproben im Vergleich mit der Kohorte korrespondierender peritumoraler Geweben festgestellt. Die statistische Untersuchung zu einer möglichen Assoziation höherer relativer Methylierung mit progressionsfreiem Überleben und Gesamtüberleben identifizierte die Methylierung als signifikanten Modellparameter. Zusätzlich wurde in statistischer Untersuchung ein signifikanter Zusammenhang der Methylierung mit dem Therapieansprechen/-erfolg für den NEFH-Locus gezeigt.
18 6) Tezval H, Dubrowinskaja N, Peters I, Reese C, Serth K, Atschekzei F, et al. Tumor Specific Epigenetic Silencing of Corticotropin Releasing Hormone - Binding Protein in Renal Cell Carcinoma: Association of Hypermethylation and Metastasis. PLoS One.
2016 Oct 3;11(10):e0163873134.
Mittels QMSP wurde eine durchschnittliche Erhöhung der relativen DNA-Methylierung in einem Locus des CRHBP-Gens in der Kohorte der ccRCC-Tumorgewebsproben, im Vergleich zu der Kohorte korrespondierender peritumoraler Gewebe festgestellt. Gleichzeitig korrelierte die erhöhte relative Methylierung invers in ccRRC-Tumorgewebsproben mit einem reduzierten mRNA-Expressionslevel. Die erhöhte relative Methylierung zeigte statistische Assoziation mit dem Metastasierungsstatus und fortgeschrittener Krankheit. Eine Validierung der obengenannten Ergebnisse wurde mit Hilfe einer statistischen in silico-Evaluation unter Einbezug der TCGA-Datenbank (The Cancer Genome Atlas- en.) durchgeführt.
Tabelle 1. Eigenanteilerklärung.
Publikations-Nr. 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Konzeption des
Forschungsansatzes (%) 5 10 10 10 50 10
Planung der
Untersuchungen (%) 20 40 50 50 70 40
Datenerhebung (%) 30 60 60 70 90 40
Datenanalyse und
-interpretation (%) 20 40 25 20 50 30
Schreiben des Manuskripts
(%) 10 20 20 20 50 40
2.1.1 Beigefügte Publikationen.
Hier folgen die Originalpublikationen.
Hsa- mir-124-3 CpG island methylation is associated with advanced tumours and
disease recurrence of patients with clear cell renal cell carcinoma
K Gebauer1, I Peters1, N Dubrowinskaja1, J Hennenlotter2, M Abbas3, R Scherer4, H Tezval1, A S Merseburger1, A Stenzl2, M A Kuczyk1and J Serth*,1
1Department of Urology, Hannover Medical School, OE6247, Carl-Neuberg-Str.1, 30625 Hannover, Germany; 2Department of Urology, Eberhard-Karls University, 72074 Tu¨bingen, Germany; 3Department of Pathology, Hannover Medical School, 30625 Hannover, Germany and4Department of Biometry, Hannover Medical School, 30625 Hannover, Germany
Background:Whether methylation of the microRNA (mir)-124-3CpG island is of relevance for the clinical course of a solid cancer and whether it shows association with clinicopathology or survival of patients with renal cell cancer (RCC) is not known as yet.
Methods:In a cross-sectional study, relative methylation ofmir-124-3was measured in 111 RCC samples and 77 paired normal appearing tissues using quantitative methyl-specific PCR. Results were statistically compared with tumour histology, clinicopathological parameters and disease recurrence.
Results:We found tumour-specific hypermethylation ofmir-124-3in samples of RCCs with clear cell histology (ccRCC) compared with paired normal appearing tissues (Po0.0001). Methylation was significantly increased in tumours with state of advanced disease (Po0.0001). Higher relative methylation was associated with worse recurrence-free survival in both univariate (hazard ratio¼9.37; P¼0.0005) as well as bivariate Cox regression analyses considering age, sex, diameter of tumours and state of advanced disease, metastasis and lymph node metastases as covariates (hazard ratios¼5.9–18.2;P-values of 0.0003–0.008).
Conclusion:We identifiedmir-124-3CpG islands (CGI) methylation as a relevant epigenetic mark for ccRCC thus underlining the need for functional studies of potentially affected signalling pathways in kidney tumour models. Methylation of mir-124-3 is suggested as an independent prognosticator for ccRCC.
With over 111 000 new cases and 43 000 deaths reported in 2008, kidney cancer is among the top 10 causes of cancer death of men in the developed countries (Jemal et al, 2011). Nephron-sparing surgery and nephrectomy are still the gold standard for therapy of localised stages of renal cell carcinoma (RCC), but despite recent advances in targeted therapy, the prognosis for patients with progressive disease is still poor. Moreover, few diagnostic methods are available to predict progression of the disease. The identifica- tion of biomarkers for RCC could provide a basis for both future
stratification of targeted therapy schemes and the identification of relevant signalling pathways for RCC development. The most frequent histology of RCC is clear cell RCC (ccRCC) exhibiting mutations in the von Hippel-Lindau (VHL) and polybromo 1 (PBRM1) (Varela et al, 2011) genes in at least 30% of tumours analysed. von Hippel-Lindau is involved in various cellular mechanisms such as tumour suppression, response to hypoxia, protein degradation and interaction with intra- as well as extracellular matrix proteins (Nordstrom-O’Brien et al, 2010)
*Correspondence: Dr J Serth; E-mail: serth.juergen@mh-hannover.de
Received 16 July 2012; revised 6 November 2012; accepted 8 November 2012
&2013 Cancer Research UK. All rights reserved 0007 – 0920/13
FULL PAPER
Keywords:renal cell carcinoma; microRNA;mir-124-3; DNA methylation; prognosis
British Journal of Cancer(2013) 108, 131–138 | doi: 10.1038/bjc.2012.537
www.bjcancer.com |DOI:10.1038/bjc.2012.537 131
and PBRM1 has been identified as part of chromatin structure modifying protein complexes (Reisman et al, 2009; Thompson, 2009).
However, from other studies it has become apparent, that numerous epigenetic alterations are also involved in renal carcinogenesis (Baldewijns et al, 2008; Morris et al, 2008, 2010, 2011). Most of these alterations refer to changed DNA methylation as observed in CGI of various genes and some of them have been suggested in functional analyses as candidate tumour suppressor genes (TSG) function (Dreijerink et al, 2001; Morris et al, 2010, 2011). Changes in clinical outcome of RCC patients have been attributed so far either to multimarker methylation panels (Urakami et al, 2006) or to gene-specific CGI methylation of genes such as basonuclin 1 (BNC1), collagen type XIV a 1 (COL14A1), DAL-1/4.1B, GATA-binding protein 5 (GATA5), secreted frizzled-related protein 1 (SFRP1) and signal peptide CUB domain EGF-like 3 (SCUBE3) (Yamada et al, 2006; Morris et al, 2010; Peters et al, 2012). Interestingly, a subset of these candidate prognosticators were independent from other clinico- pathological parameters includingDAL-1/4.1B(independent from stage and grade of tumours) COL14A1 (size, grade and stage), gremlin 1 (GREM CGI region 1, age and sex) and SFRP1 (size, grade, stage, age and gender) (Yamada et al, 2006; Morris et al, 2010; van Vlodropet al, 2010; Atschekzeiet al, 2012).
Alteration of microRNA (miR) expression as a result of DNA methylation has recently also been described as a common mechanism in human tumourgenesis (Esquela-Kerscher and Slack, 2006). Considering that miR’s may interact with a large number of target mRNAs leading to degradation and loss or reduction of corresponding gene expression epialterations of miR, CGIs may be of great potential relevance for the prediction of cancer progression (Han et al, 2007; Selbach et al, 2008). In line with this hypothesis,miR-9methylation has already been identified as an epigenetic mark of potential prognostic relevance for RCC.
Apart from that onlymiR-34aandmiR-34b/cCGIs were found to be methylated in RCC as yet (Hildebrandtet al, 2010; Vogtet al, 2011).
Here we asked, whether methylation of a CGI annotated to mir-124-3and found to be relevant in many tumours (Kentet al, 2002) can be also detected in kidney tumours and is of relevance for the clinical outcome of patients with RCC. MiR-124 matures from three precursor variants located on chromosomes 8p23.1 (mir-124-1), 8q12.3 (mir-124-2) and 20q13.33 (mir-124-3). Hyper- methylation ofmiR-124has been initially demonstrated to occur in colon, breast and lung cancers as well as leukaemia and lymphoma (Lujambio et al, 2007) and seems to play an important role in tumour development. However, a possible clinical relevance of mir-124-3 methylation as independent prognosticator has been reported so far only for haematological malignancies (Agirreet al, 2009; Roman-Gomezet al, 2009), while corresponding information for solid tumours in general as well as for RCC in particular are not available. Here, we analysed whether methylation of themir-124-3 locus is relevant for RCC and, moreover, whether changes are associated with the clinicopathology and disease progression of RCC patients.
MATERIALS AND METHODS
Cell lines. Human kidney tumour cell lines and primary renal proximal tubular epithelial cells (RPTEC) were cultured not longer as 2 months following purchase and identity control by the manufacturer as described previously (Peterset al, 2012). Human breast cancer and cervical cancer cell line DNAs were a kind gift by Thilo Do¨rk (Department of Gynaecology & Obstetrics, Hannover Medical School, Hannover, Germany).
Study design and patients. Cross-sectional analyses were con- ducted on 111 RCC samples and 77 samples from paired histologically normal appearing renal tissues. Sample collection was approved by the local ethics committee and informed consent was obtained from each patient. TNM classification of all tissues was evaluated according to the Union for International Cancer Control 2002 classification (Sobin and Compton, 2010). Two pathologists assessed all specimens considering tumour classifica- tion, grade and histological subtype. Localised RCC was defined as pTp2, lymph node (N) and metastasis (M) negative (N0, M0) and a grading (G) of 1 and 1–2. Advanced tumours were classified as pTX3 and/or lymph node positive (Nþ), positive for distant metastasis (Mþ) or G2–3 and G3. The time to disease progression corresponds to the point in time patients demonstrating either a local recurrence or a synchronous/metachronous metastasis as detected by CT scan. Clinical and histopathological characteristics of tumour specimens are summarised in Table 1.
DNA isolation, bisulphite conversion of DNA and quality measurements. DNA isolation from frozen sections and histopathological examination of control sections were carried out as described previously (Peters et al, 2012). Tumour tissue sections represented 100% tumour tissue and included only minor fractions of normal cells. Bisulphite conversion of DNA was performed as described before (Peters et al, 2007). To control bisulphite conversion efficiency, all samples were subjected to quantitative methylation-specific PCRs (qMSP) using the concept reported by Campanet al(2009) and van der Horstet al(2004).
Briefly, detection of the methylation-independent repetitive sequence ALU-C4 (QC1) and a single copy b-Actin (ACTB) (QC2) sequence served to measure the yield of conversion and to provide for controlled input of bisulphite converted template DNA into qMSP analyses, while the repetitive sequence ALU-YB8 (QC3) allows to quantify unconverted DNA. Fully methylated bisulphite converted control DNA (M) and unmethylated bisulphite converted control DNA (U) were generated as described recently (Weisenbergeret al, 2008).
Quantitative methylation-specific PCR (qMSP) analysis. Methy- lation analyses of bisulphite-treated genomic DNA was performed by a quantitative real-time fluorimetric 50exonuclease PCR assay.
Our analyses determined a subregion within the CpG island (CGI) annotated to the hsa-mir-124-3 locus on chromosome 20 as indicated in Figure 1A. The qMSP-specific primers 50-GGTCGGG TCGGGTTAGTAGG-30 (forward) and 50-CGCAAACCGACTAC GAACCG-30(reverse) as well as the Taqman probe 50-FAM-CCA CGAAATCCACGCTACAAACGCCCA-BHQ-3 were designed according to Weisenberger et al (2005) and using the Beacon Designer software (PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA).
Real-time PCRs were carried out in duplicate on an ABI 7900HT (Life Technologies, Foster City, CA, USA) in 384-well plates.
Amplification included initial incubation for 10 min at 951C followed by 45 cycles of denaturation for 15 s at 951C, 1 min annealing and elongation at 601C in a reaction volume of 9ml, consisting of 1.2mM of each primer, 400 nM probe and 1 Taqman Universal Master Mix II no UNG. For PCR setup, the FasTrans automatic Liquid Handling System (AnalyticJena, Jena, Germany) was used. Measurements were carried out blinded against type, order and clinicopathological status of samples by the experimenter.
Calculation of relative methylation levels. The relative degree of methylation was determined using the method of Weisenberger et al(2005). Sample-specific total input of converted DNA in each sample was measured by detection by means of QC1 while calibrator samples M and U served as positive and negative controls, in each run. Relative methylation values were calculated according to the 2 DDCT method (Livak and Schmittgen, 2001).
BRITISH JOURNAL OF CANCER Mir-124-3 methylation and RCC prognosis
132 www.bjcancer.com |DOI:10.1038/bjc.2012.537
Briefly, Ct values of samples were normalised to QC1 and referenced to the positive control M, allowing calculation ofDDCt and the relative methylation. Notably, the resulting methylation values are related to the copy number of methylated sequences detected in the calibrator sample corresponding to a fully
methylated diploid genome. Hence, both potential cancer-related alterations such as regional amplification of DNA as well as slight variation in measured Ct values may lead to the measurement of methylation values of4100%. Therefore, the methylation values were designated as ‘relative methylation level’. Samples exhibiting lower template DNA input than a QC1 Ct value of 21.1 were excluded. The analytical sensitivity of the mir-124-3 assay was estimated calculating the limit of quantitative detection (LQ) from the variance measurements of blank values as suggested by Currie (1968). First the non-methylated control U was measured 12 times and all runs were found to be undetermined. To consider the variance of ‘blank values’ present within sample group, LQ was then calculated by addition of the mean of background methylation levels as determined from 153 undetermined samples and the corresponding 10-fold standard deviation.
Statistical analyses. Explorative statistical data analyses were conducted by the use of the statistical software R 2.12 (R Development Core Team, 2011). Po0.05 were considered to indicate statistical significance. Relative methylation levels are converted to the natural logarithmic scale before conducting further statistical calculations. Linear regression analysis was performed for linearity and PCR efficiency measurements of the qMSP assay. Statistical comparison of the mean relative methyla- tion levels observed for paired tumour and adjacent normal appearing tissue were carried out using the paired t-test.
For group comparisons of independent tissue samples representing different clinicopathological classifications, univariate logistic regression analysis was conducted, providing both statistical significance and odds ratio (OR) serving as a measure of the observed effect size. Analysis of recurrence-free survival was achieved using Cox’s proportional-hazards regression model.
The grade and state of lymph node metastasis were not considered in bivariate analyses due to low number of cases in subgroups following dichotomization. Note that G and N were part of the localised and advanced disease classifications (see above).
Optimum threshold calculations for dichotomization of methyla- tion levels were performed using the R package ‘maxstat’.
RESULTS
Measurement of technical controls. We analysed the specificity of the mir-124-3 qMSP analysis by duplicate measurements of converted methylated (M), converted non-methylated (U) and non-converted DNA control samples. We exclusively observed Ct values of 45 (undetermined) for the U and non-converted DNA samples, while the M sample demonstrated Ct values of about 29 (Figure 1B). Non-converted DNA was detected neither in QC1 control PCR nor in mir-124-3-specific qMSP, thus demonstrating that only methylated and converted DNA has been measured by themir-124-3methylation assay. To determine PCR efficiency and linearity of the methylation detection assay, we analysed a two-fold dilution series of the M control within the U control DNA adjusting for constant total converted DNA input. Linear regression analysis revealed a slope of DCT¼ 3.3 per 10-fold dilution and a coefficient of correlation of r¼0.97 (P¼0.001), indicating a high efficiency and linearity of the assay (Figure 1C).
Estimation of the analytical sensitivity LQof themir-124-3assay according revealed a relative methylation level of 5.7E 4 (mean of blank values¼3.0E 5, s.d.¼5.3E 5).
mir-124-3methylation in tumour cell lines and normal primary cells. We first evaluated whether the mir-124-3 qMSP assay is capable of detecting methylation in cell lines used as surrogates for tumours with known methylation (breast cancer) as well as for normal tissues and tissues of both localised and metastatic human Table 1. Tumour patients characteristics
All
RCC % ccRCC % ccRCC surv.
group %
Total cases 111 80 37
Histology
ccRCC 80 72.1 80 100 37 100
papRCC 23 20.7 0 0 0 0
Chrom.
RCC
4 3.6 0 0 0 0
Not class. 4 3.6 0 0 0 0
Sex
Female 38 34.2 30 37.5 15 40.5
Male 73 65.8 50 62.5 22 59.5
Age Median (years)
65 64 65
Distant metastasis
M0 86 77.5 60 75 28 75.7
Mþ 25 22.5 20 25 9 24.3
Lymph node metastasis
N0 98 88.3 73 91.3 35 94.6
Nþ 13 11.7 7 8.8 2 5.4
T-classification
pT1 11 9.9 8 10 1 2.7
pT1a 32 28.8 21 26.3 12 32.4
pT1b 19 17.1 14 17.5 7 18.9
pT2 7 6.3 5 6.3 2 5.4
pT3 5 4.5 2 2.5 1 2.7
pT3a 9 8.1 7 8.8 2 5.4
pT3b/c 23 20.7 21 26.3 11 29.7
pT4 1 0.9 0 0 0 0
NA 4 3.6 2 2.5 1 2.7
Differentiation
G1 22 19.8 19 23.8 5 13.5
G1–2 14 12.6 9 11.3 4 10.8
G2 56 50.5 38 47.5 21 56.8
G2–3 8 7.2 4 5 2 5.4
G3 11 9.9 10 12.5 5 13.5
State of disease Loc.
diseasea
59 53.2 39 48.8 17 45.9
Adv.
diseaseb
51 45.9 41 51.3 20 54.1
NA 1 0.9 0 0 0 0
Paired samples
All RCC 77
ccRCC 58
Abbreviation: ccRCC¼clear cell renal cell carcinoma.
apTp2, N0, M0 and G1þG1–2.
bpTX3 and/or Nþ, Mþor G2–3 G3.
Mir-124-3 methylation and RCC prognosis BRITISH JOURNAL OF CANCER
www.bjcancer.com |DOI:10.1038/bjc.2012.537 133
