Allgemeine histologische Befunde

5.1.3.1 Methodik

Die in dieser Arbeit verwendete BOUINsche Lösung hat gegenüber Formol den Vorteil, dass sie schneller in das Gewebe eindringt und dort zu einer guten Proteinfixierung führt. Zudem kommt es nicht zu Schrumpfungsartefakten. Das schnelle Eindringen in das Gewebe ist besonders wichtig bei der Fixierung der Enterozyten, da diese schon nach sehr kurzer Zeit autolytische Veränderungen aufweisen. Außerdem kann es in BOUINscher Lösung, im Gegensatz zur Fixierung in Formol, nicht zu einer Überfixierung der Gewebe kommen. (PEARSE 1985)

Die anschließende Einbettung der Proben erfolgte sowohl in Paraffin als auch in Technovit 7100. Letzteres weist gegenüber Paraffin den Vorteil auf, dass es im Zuge der Einbettung nicht zu Schrumpfungsartefakten kommt (HANSTEDE und GERRITS 1983). Somit sind an den Technovitpräparaten auch Messungen, wie die der Höhe der Enterozyten, möglich und die Strukturen in den Zellen und Geweben werden weitestgehend naturgemäß dargestellt. Einige histologische Färbungen, wie beispielsweise die Masson-Färbung, sind jedoch nur an den Paraffinschnitten möglich.

Bei den verwendeten Färbeverfahren handelte es sich um in der Histologie gängige und erprobte Übersichtsfärbungen.

5.1.3.2 Histologische Darstellung der Caeca

In der nicht dehnbaren Basis caeci sind lange fingerförmige Zotten ausgebildet, die das Lumen stark verkleinern. Dieser Aufbau stellt möglicherweise eine mechanische Barriere dar, die nur Flüssigkeiten und kleinere Partikel in die Caeca hineinlässt. Dies unterstützt die Ergebnisse von SKADHAUGE (1982) zur Osmoregulation und von DUKE (1989) zum Zusammenspiel der Peristaltik von Ileum, Caecum und Rectum. Die Autoren haben festgestellt, dass in die Caeca gezielt flüssige Bestandteile der Ingesta eingesaugt und gepresst werden. Dabei

werden gleichzeitig die festen Bestandteile an den Caeca vorbei direkt in das Rectum geschleust. Die dehnbaren Anteile des Caecums nehmen die anfallende Flüssigkeitsmenge auf, aus der dann nach und nach Nährstoffe resorbiert werden können. Funktionell sind Corpus und Apex caeci bei den Eulen daher wahrscheinlich zu einer Einheit zusammen zu fassen.

Die Caeca stellen sich analog der vom Huhn bekannten Darm-Schichtung dar.

Betrachtet man jedoch die einzelnen Strukturen genauer, weisen sie doch deutliche Unterschiede auf, ins Besondere im Bereich der Lamina epithelialis.

Diese beherbergt bei den Eulen eine Vielzahl von Becherzellen; ein Aspekt, der unter Punkt 5.1.4 ausführlicher diskutiert wird. Die Blinddarm-Enterozyten sind bei den Eulen schmaler und höher als beim Huhn. Schon durch die histologischen Untersuchungen wird deutlich, dass die Enterozyten der Caeca in hohem Maße stoffwechselaktiv sind. Ihre Form ist stark hochprismatisch und die Zellen besitzen einen mittig liegenden Kern. Dies ist ein Zeichen dafür, dass sie sowohl auf der luminalen, als auch auf der basalen Seite Transportmöglichkeiten nutzen (MEYER 2007).

In der Toluidinblau-Färbung zeigen die Enterozyten von Corpus und Apex caeci im apikalen Zytoplasma-Anteil eine proteinöse Verdichtung. Dieser Befund ist bei den untersuchten Eulen stärker ausgeprägt als beim Huhn. DANZER (1989) hat diese Struktur beim Huhn auch elektronenmikroskopisch nachweisen können. Er beschreibt sie als Aggregation mikrotubulärer Strukturen (AMS), die als freie filamentöse Bündel nur im Bereich der Zotten, nicht jedoch in den Krypten auftreten. Die Funktion der AMS ist jedoch nach wie vor unbekannt.

Vergleicht man die histologische Struktur der Eulenblinddärme mit derjenigen der Greifvogelblinddärme, z. B. der der Rohrweihe (HEIDENBRINK 2003), werden große Unterschiede im Aufbau augenscheinlich. So sind in der Lamina propria der Eulencaeca zwar in allen Abschnitten einzelne Lymphozytenaggregate erkennbar, die von ihrem Aufbau her den Peyerschen Platten der Säugetiere ähneln (vgl.

WELSCH 2006). Beim Greifvogel besteht die Lamina propria dagegen fast ausschließlich aus Lymphozytenansammlungen. Ihre sonst mehr bindegewebige Grundstruktur wird weitestgehend aufgelöst. Im Bereich der Lamina epithelialis fehlen in der Regel die Becherzellen (HEIDENBRINK 2003). Dieser Befund weist darauf hin, dass sich die Funktion der Caeca der Greifvögel von derjenigen der

als eine für den Verdauungstrakt notwendige und natürliche Abwehreinrichtung anzusehen. Sie stehen für die eigentliche Funktion der Caeca allerdings keinesfalls in dem Maße im Vordergrund, wie dies bei den Greifvögeln der Fall ist.

Der Schwerpunkt in der Funktion der Eulencaeca ist vielmehr in der hohen Stoffwechselaktivität der Enterozyten zu sehen (vgl. auch Kapitel 5.1.5.3).

5.1.4 Histochemische Darstellung der Becherzellen

5.1.4.1 Methodik

Die verwendete AB-PAS- Färbung ist ein vielfach erprobtes und standardisiertes histochemisches Verfahren zur Differenzierung saurer und neutraler Glycokonjugate. Diese wurden im Schleim der Becherzellen dargestellt.

5.1.4.2 Darstellung der Becherzellen

Die Caeca der Eulen weisen im Gegensatz zu denen des Huhns eine Vielzahl an Becherzellen in den untersuchten Darmabschnitten auf. Der Befund unterstützt die Aussage von NAIK (1968), der Eulen den glandulären Caeca-Typ zuordnet, Hühnern jedoch den intestinalen Typ.

Die Becherzellen der Eulen sind breiter und der Schleimanteil nimmt einen größeren Bereich innerhalb der Zellen ein, als dies bei den vergleichsweise untersuchten Hähnen der Fall war. Das bedeutet funktionell, dass die Becherzellen der Eulen in höherem Maße sekretorisch aktiv sind als diejenigen der Hühner. Becherzellen dienen dazu, einen komplexen Schleim zu produzieren und zu sezernieren, welcher sich den Enterozyten als Schutzfilm gegen das im Darm vorherrschende Milieu auflegt (FAURE et al. 2003). Es wäre also möglich, dass die Zusammensetzung des Blinddarminhaltes der Eulen für die Enterozyten eine schädigendere Wirkung hat, als der Inhalt der Hühnerblinddärme. Es wäre interessant, diesbezüglich weitere vergleichende Untersuchungen, wie z. B. pH-Wert Messungen am Inhalt der Caeca durchzuführen.

5.1.5 Immunhistochemische Nachweise

5.1.5.1 Methodik

Bei der für die Antikörperreaktion verwendeten Methode handelt es sich um ein Verfahren, welches sich in der immunhistochemischen Darstellung vielfach bewährt hat. Es mussten jedoch hinsichtlich der Art der Aufbereitung des Präparats und der geeigneten jeweiligen Antikörperkonzentration im Vorfeld immer Vorversuchsreihen durchgeführt werden, um die Methode für den jeweiligen verwendeten Antikörper zu optimieren.

5.1.5.2 Problematik

Die Problemstellung, die sich für die Anwendung der Immunhistochemie in dieser Arbeit ergab, war, dass keine eulenspezifischen Antikörper verfügbar waren. Es war daher notwendig, Antikörper zu verwenden, die sich gegen Antigene einer möglichst verwandten Spezies richteten oder aber solche, die Spezies-übergreifend kreuzreagierten. Daher musste zudem auch auf Antikörper gegen Säugerantigene zurückgegriffen werden, wie beispielsweise bei der Reaktion gegen den Calciumkanal. Bei dem für die Herstellung verwendeten Antigen handelte es sich um die α2-Untereinheit des Calciumkanals des T-tubulären Systems vom Kaninchenskelettmuskel. Laut Antikörper-Beschreibung kreuzreagiert der Antikörper jedoch auch mit Calciumkanälen anderer Gewebe und anderer Vertebratengruppen. Die für die erforderliche Antikörperreaktion notwendige relativ hohe Konzentration des Antikörpers kann ein Hinweis darauf sein, dass solche Kreuzreaktionen vorlagen.

Generell kann man jedoch davon ausgehen, dass intrazelluläre Systeme, die sich schon relativ früh im Laufe der Evolution bewährt haben, Ordnungs- und teilweise sogar Klassen-übergreifend bei den Vertebraten auftreten.

Im Falle eines negativen Reaktionsergebnisses mussten bei den Reaktionen an den Eulenblinddärmen immer zwei mögliche Ursachen berücksichtigt werden:

(1.), das gesuchte Antigen ist im Präparat nicht vorhanden, oder (2.), der verwendete Antikörper reagiert nicht mit dem entsprechenden Protein der Eule.

Zusätzlich musste bei jeder Antikörperreaktion berücksichtigt werden, dass immer auch unspezifische Reaktionen auftreten können. Dies bedeutet, das der Antikörper an ein strukturell ähnliches Protein bindet, welches funktionell jedoch

5.1.5.3 Nachweis der Mitochondrien

Die Reaktionen für alle verwendeten Antikörper gegen Mitochondrien und Succinat-Dehydrogenase (SDH) fielen stark positiv aus. Bei Mitochondrien handelt es sich um evolutionsbedingt sehr alte Zellorganellen, die sich im Laufe ihrer evolutionären Entwicklung bei den einzelnen Tiergruppen nicht sehr unterschiedlich differenziert haben. Dies erklärt die positive Reaktion sowohl auf Vogel-, als auch auf humane Mitochondrien und schließlich der SDH als Enzym des Citratcyclus, welcher im Mitochondrium als ein der Zelle Energie liefernder Prozess abläuft. Die positive SDH Reaktion kann somit als Indikator für eine hohe Stoffwechselaktivität der Enterozyten gewertet werden. Die Blinddarmenterozyten der Eulen sind besonders reich an stoffwechselaktiven Mitochondrien, welche verstärkt in den apikalen, wie auch den basalen Zytoplasma-Anteilen auftreten. Mit Hilfe der Antikörperreaktion gegen SDH konnte nachgewiesen werden, dass in den apikalen und basalen Anteilen der Enterozyten offenbar ständig Energie fordernde Prozesse ablaufen.

5.1.5.4 Nachweis von Calbindin D 28k

Einen Hinweis auf die Art der in den Eulencaeca ablaufenden Prozesse lieferte der immunhistochemische Nachweis des Calcium-Transportproteins Calbindin D28k. Dieses wurde in den Enterozyten allgemein im Bereich des Zytoplasmas nachgewiesen und zeigte dabei apikal und basal in einigen Enterozyten eine Häufung. Das bedeutet, dass ein aktiver Calciumtransport von luminal bzw. apikal nach basal durch die Enterozyten der Eulencaeca erfolgen könnte. Beim Huhn wurde ermittelt, dass der Großteil der Calciumaufnahme im Duodenum stattfindet (HURWITZ et al. 1973). Bei den untersuchten Eulen fiel die Reaktion auf Calbindin im Dünndarm (Duodenum) jedoch deutlich schwächer aus als in den Blinddärmen. Mit Hilfe der Antikörperreaktion gegen Calbindin D28k wurde daher deutlich, dass bei Eulen den Caeca für die aktive Calciumresorption eine besondere Rolle zukommt.

In welcher Form das Calbindin im Zytoplasma der Blinddarmenterozyten der Eulen vorliegt, müsste elektronenmikroskopisch untersucht werden, wie dies von NEMERE et al (1991) an den Enterozyten des Duodenums vom Huhn durchgeführt worden ist. Die Autoren konnten Calbindin D28k in Vesikeln und vermeintlichen Lysosomen nachweisen.

5.1.5.5 Nachweis von Calciumkanalstrukturen (αααα2-Untereinheit des Calciumkanals des T-tubulären Systems)

In den Enterozyten der Eulenblinddärme konnten in allen drei untersuchten Lokalisationen Calciumkanalstrukturen (α2-Untereinheit des Calciumkanals des T-tubulären Systems) immunhistochemisch nachgewiesen werden. Sie traten vornehmlich im Bereich der apikalen Zellmembran auf.

Der Einstrom von Calcium über Calciumkanäle in die Vogelenterozyten ist von LARSSON und NEMERE (2002) als ein mögliches Modell der schnellen Calciumaufnahme, als sogenannte erleichterte Diffusion, beschrieben worden.

Vom Säuger ist bekannt, dass es in der luminalen Enterozytenmembran spannungsgesteuerte Calciumkanäle (TRPV-5 und TRPV-6) gibt.

Im Rahmen dieser Arbeit ist nachgewiesen worden, dass auch bei Eulen in der apikalen Enterozytenmembran Calciumkanäle vorhanden sind. Diese könnten möglicherweise das funktionelle Pendant zu den TRPV-Kanälen des Säugers darstellen. Eine strukturelle Ähnlichkeit besteht jedoch nicht.

Auch im Bereich der basalen Zellmembran fiel die Reaktion positiv aus, wenn auch wesentlich schwächer als apikal. Im basalen Bereich der Enterozyten muss das Calcium die Zelle wieder verlassen. Bei Säugetieren sind hierfür Ca/Na-Austauscher und Ca-ATPasen beschrieben worden (WILKENS 2006), was von LARSSON und NEMERE (2002) auch als ein möglicher Mechanismus beim Vogel diskutiert wird. Auf Grund der Ergebnisse dieser Arbeit sind auch im Bereich der basalen Enterozytenmembran der Eulenblinddärme Calciumkanäle in Betracht zu ziehen.

Alle proteinösen Zellbestandteile werden im rauen Endoplasmatischen Retikulum und Golgi-Apparat produziert bzw. verwendet und dann über Vesikel zum Ort ihres Einsatzes, also z. B. zur Zellmembran transportiert und dort eingebaut. Das erklärt die positive Zytoplasmareaktion in einigen Enterozyten.

5.1.5.6 Nachweis des Vitamin D3-Rezeptors

In dieser Arbeit konnten in allen Blinddarmregionen Vitamin D3-Rezeptoren in den Enterozyten nachgewiesen werden.

Vitamin D3-Rezeptoren spielen im Darm für die Calciumaufnahme eine wichtige Rolle. Dabei werden zwei verschiedene Rezeptortypen unterschieden. Der eine Rezeptortyp liegt zunächst frei im Zytoplasma vor und wandert erst Liganden- und

von Proteinen, welche für die Calciumaufnahme aus dem Darm benötigt werden, z. B. von Calbindin D 28k. (NORMAN 2006)

Der andere Vitamin D3-Rezeptortyp wurde von HUHTAKANGAS et al. (2004) in der Caveolaefraktion der apikalen Enterozytenmembran von Hühnern nachgewiesen. Das Binden von 1,25(OH)2-Vitamin D3 an diesen Membranrezeptor führt über verschiedene Second-messenger-Systeme zum schnellen Einstrom von Calcium in den Enterozyten.

Die positive Antikörperreaktion gegen den Vitamin D3-Rezeptor im Bereich der apikalen Membran der Blinddarmenterozyten zeigt an, dass hier der membranständige Vitamin D3-Rezeptor vorliegt. Folglich müssen bei den Eulen auch Mechanismen (z. B. Calciumkanäle) für einen schnellen Calciumeinstrom in die Enterozyten der Caeca ausgebildet sein.

Die positive Reaktion im apikalen Zytoplasma kann einerseits Nachweis für den noch ungebundenen Vitamin D3-Rezeptor sein, welcher frei im Zytoplasma vorliegt, bevor er in den Zellkern wandert um dort seine genomische Wirkung zu entfalten. Andererseits können jedoch auch Bestandteile noch unfertiger Vitamin D3-Rezeptoren (sowohl des membranständigen als auch des nucleären Rezeptors) im rauen Endoplasmatischen Retikulum oder im Golgi-Apparat nachgewiesen worden sein.

Aus der Antikörperbeschreibung des Herstellers ging leider nicht hervor, welcher Anteil des Rezeptors das Antigen darstellt. Es wird auch nicht erläutert, ob nur der freie Vitamin D3-Rezeptor mit dem Antikörper reagiert oder auch der Liganden- und Motorprotein gebundene, welcher im Zellkern vorliegt. Es besteht daher die Möglichkeit, dass das Antigen aus dem Bereich einer der beiden Bindungsstellen des Rezeptors stammt. Dies würde dazu führen, dass ein Nachweis des Rezeptors im Kern mit diesem Antikörper nicht möglich ist. In der vorliegenden Arbeit konnte eine positive Reaktion im Zellkern der Enterozyten nicht mit Sicherheit nachgewiesen werden. Es wäre daher sinnvoll, die Reaktion nochmals mit einem Antikörper gegen die nucleäre Form des Vitamin D3-Rezeptors zu wiederholen.

Auch im basalen Bereich einiger Enterozyten konnten Vitamin D3-Rezeptoren immunhistochemisch erfasst werden. Es ist einerseits möglich, dass es sich hierbei um Anteile des Rezeptors in der Bildung, d.h. im rauen Endoplasmatischen Retikulum oder im Golgi-Apparat handelt. Andererseits könnte der Vitamin D3

-Rezeptor auch basal im Enterozyten bei der Ausschleusung des Calciums, z. B.

über dort liegende Calciumkanäle, eine Funktion innehaben.

Generell kann davon ausgegangen werden, dass sich der Antikörper nicht ausschließlich gegen den membranständigen Rezeptor richtet, da dieser im Gegensatz zum nucleären nicht den klassischen Vitamin D3-Rezeptor-Typ darstellt.

Im Zuge der Antikörperreaktion wurde deutlich, dass mit dem gleichen Antikörper sowohl der membranständige Vitamin D3-Rezeptor, als auch der frei im Zytoplasma vorliegede nucleäre Rezeptortyp nachgewiesen werden konnte. Das lässt darauf schließen, dass es sich bei den zwei Vitamin D3-Rezeptor-Typen um strukturell ähnliche Proteine handeln muss. Dieser Befund würde die These von NORMAN (2006) unterstützen, der davon ausgeht, dass beide Rezeptoren weitestgehend identisch sind und lediglich eine geringfügige Konfigurationsänderung der Ligandenbindungsstelle vollziehen, wenn sie je nach Bedarf vom nucleären Vitamin D3-Rezeptor-Typ in die membranständige Form wechseln.

Um diese Aussage abzusichern ist es notwendig, in einer Folgereaktion auch im Zellkern selbst den Vitamin D3-Rezeptor nachzuweisen, denn nur so kann ausgeschlossen werden, dass es sich in der Zytoplasmareaktion nicht um Anteile von unfertigen membranständigen Vitamin D3-Rezeptoren handelt.